Summary
ここでは、分離し、構造、嗅力海ヤツメウナギの推定フェロモン化合物の行動応答を評価するためのプロトコルを提案する.
Abstract
バイオアッセイ誘導の分別は、生理・行動生物検定の結果を使用して分離とアクティブなフェロモン化合物の同定をガイドする反復的なアプローチです。このメソッドは、幅広い動物種のフェロモンとしてその関数化学信号の正常性状に起因しました。海ヤツメウナギは行動または生理学的な応答を仲介するフェロモンを検出する嗅覚に頼る。私たちはこの魚の生物学の知識を使用して推定されるフェロモンの機能を仮定するし分離とアクティブなフェロモン成分の同定。クロマトグラフィーは、抽出、集中、およびエアコンの水から化合物の分離に使用されます。電気 olfactogram (EOG) 録音する分数は嗅覚応答を引き出すを決定するため行われています。2 つの選択肢迷路行動アッセイは、臭気の分数のいずれかがアクティブな行動もし、好みを誘発するかどうかを決定する使用されます。分光法と分光学的方法は、分子量や構造解明を支援する構造の情報を提供します。純粋な化合物の生物活性を EOG と行動実験で確認しました。迷路の中にみられる行動応答は最終的に自然のストリーム設定の機能を確認するためのフィールド設定で検証しなければなりません。これらの生物検定は、1) 分別プロセスをガイドし、2) 確認するデュアル役割と、分離されたコンポーネントの活性の定義します。ここでは、分別のバイオアッセイ誘導アプローチの有用性を例証する海ヤツメウナギ フェロモン同定の代表的な結果を報告します。海ヤツメウナギ フェロモンの同定は、フェロモン通信システムの変調が侵襲的海ヤツメウナギ ラウレンツィアーナ五大湖にオプションの中では特に重要です。このメソッドは、イチイの広範な配列の化学交信を特徴付けるし、水系の化学生態学に光を当てるに容易に適応できます。
Introduction
フェロモンは、食料源を検索、検出捕食者および個体1の社会的な相互作用を仲介することでそれらを支援する個人によってリリースされた特定の化学信号です。昆虫のフェロモン ・ コミュニケーションはずっとよく勉強2;しかし、化学的同定と水生脊椎動物フェロモンの生物学的機能が検討されていないとして広く。Id の知識とフェロモンのリリースの機能は、絶滅危惧種3,4または制御害虫種5,6の回復を容易に適用できます。これらの技術のアプリケーションは、分離・生理活性フェロモン成分の同定を必要とします。
フェロモンの同定は、天然物化学の枝です。フェロモン研究の進歩は、フェロモン分子自身の性質上、部分的に制限されています。フェロモンは、不安定になり、少量でリリースされた、揮発性7,8または9水溶性化合物の微量を検出するだけいくつかのサンプリング手法が存在します。フェロモン的なアプローチには、1) 知られている化合物、2) メタボロミクス、および 3) バイオアッセイ誘導分別の対象となるスクリーニングが含まれます。知られている化合物の標的スクリーニングは、フェロモンとして機能するいると仮定の生理的過程の市販の代謝の副産物をテストします。研究者のみ知られており、利用可能な化合物をテストできますので、この方法は制限されています。ただし、それをもたらしました金魚の性ホルモンの成功した識別関数フェロモン10、11,12として。メタボロミクスは、潜在的な生物学的システム13内低分子代謝産物を区別する第 2 フェロモン同定アプローチです。2 つのグループ (すなわちアクティブと非アクティブのエキス) の代謝プロファイルの比較により、潜在的な代謝プロファイルの id 構造の解明から代謝物を精製し、生物活性は確認された14です。特定の混合物の複雑な配合の添加剤または相乗効果、代謝物は一緒にではなく、分数13のシリーズとしてと見なされるために、メタボロミクスで検出される可能性が高い。まだ、メタボロミクスの実装は、結果のデータは、新規構造の解明を促進しないので合成参照の可用性に依存します。
バイオアッセイ誘導の分別、2 つのフィールドにまたがる統合、反復的なアプローチ: 化学および生物学。このアプローチは、分離とアクティブなフェロモン化合物の同定をガイドするのに生理・行動生物検定の結果を使用します。粗野なエキスは、 (すなわち、分子サイズ、極性等)の化学的性質によって分別され、生物検定および/または電気 olfactogram (EOG) 録音でのテストです。生理活性成分をスクリーニング、分別および EOGs および/または生物検定の手順を繰り返ししています。分子量と合成される化合物のテンプレートを生成する構造情報提供分光法と分光学的方法により純粋な活性化合物の構造を明らかにします。バイオアッセイ誘導の分別には、多様な代謝と生合成の経路から予測される可能性が高いではないユニークな化学のスケルトンと潜在的新規フェロモンをもたらすことができます。
ここでは、分離し、男性の海ヤツメウナギ セックス フェロモン化合物の生物活性を評価するために使用するバイオアッセイ誘導分別のプロトコルについて述べる。海ヤツメウナギ (カワヤツメ属 marinus) は、これらの魚は大きく 3 つの段階から成る、さくの生活史を仲介する化学手掛かりの嗅覚の検出に依存するため、フェロモン ・ コミュニケーションを研究する理想的な脊椎動物のモデルです。幼虫、少年、大人。海ヤツメウナギ淡水ストリームの底に穴を掘る、抜本的な変態、湖または海洋大ホスト魚を寄生彼らに移行する少年に変換します。ホストの魚からデタッチ後大人は産卵ストリームに戻って移行, ストリーム居住者幼虫15,16,17,18,19 発表渡り鳥のフェロモンに導かれて.成熟した雄は産卵場に登る、仲間を集めるし、約一週間、断続的に産卵して死ぬ15,20の多成分性フェロモンをリリースします。海ヤツメウナギ フェロモンの同定は、フェロモン通信システムの変調がラウレンツィアーナ五大湖21の侵襲の海ヤツメウナギにオプションの中では重要です。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会のミシガン州立大学 (AUF # 03/14-054-00 と 02/17-031-00) によって承認されています。
1. 収集と海ヤツメウナギの抽出水を完備
- 場所は性的成熟男性海ヤツメウナギ (15-30 動物) 16-18 ° C で維持される気泡のヒューロン湖水の 250 L に付属しているタンクで
- 6 月から 7 月まで毎晩中男性エアコンの水を収集します。
注: 海ヤツメウナギは自然産卵後死にます。魚がその人生でこの点に近づいている、それを新鮮な成熟した男性と交換してください。 - 固相抽出によるエアコンの水を抽出します。
- 4 h のメタノールで列にロードする前に樹脂を浸します。列に樹脂をロードし、有機溶媒を除去するために列を通る水の 10 L をポンプします。
- 列の上部にポンプ システムを介して魚保持タンクからエアコンの水を渡します。4 つのシリーズに含まれている適度極性高分子イオン交換樹脂 (例えば.、アンバー ライト XAD 7 HP ガレージ) の 2 kg のベッドを通過水 2.5 L 大容量ガラス列。400 間のロード速度を維持し、600 mL/6 分溶出メタノール 5 L のアセトンの直後の 10 L の代謝産物。
注意: この手順は、メタノールとアセトンを使用します。両方は、可燃性、有毒。
注: プールの残留はさらに加工されるまで-80 ° C で保存できます。
- (約 10 リットル) の水で洗浄することにより濃縮の 1 週間後列を再アクティブ化します。
- 有機溶剤 (メタノールと水の混合物) を削除し、減圧 (下 300 mbar) 40 ° C で 5 時間回転蒸着法による抽出物を収穫凍結乾燥するまで-20 ° C で 48 時間乾燥凍結乾燥によって水の残留物を集中します。
2 クロマトグラフィーとプールの画分の分離
- シリカゲル (230 400 メッシュ) 30 分転送初期移動相でガラス カラムに溶媒 (懸濁液) のゲルを浸します。移動相を通過するを許可するように列のバルブを開きます。ケイ酸ゲル沈殿し、シリカゲルのベッドを形成するを許可します。
- シリカゲル (70 230 メッシュ) と抽出液を混和し、シリカゲルのベッドの上液体クロマトグラフィー カラムに読み込みます。95% CHCl3 (クロロホルム) からグラデーションでそれらを溶出/メタノール (メタノール) を 100% メタノール、総量 2.5 L。各バイアル (各 10 ml) の溶離液を収集します。
注意: この手順で使用されるクロロホルムは有毒な試薬です。 - 薄層クロマトグラフィー (TLC) 解析による 20 の派閥に、溶離液のプールをガイドします。
- スタート ラインにサンプルを適用し、密封されたガラスの開発溶剤 (極性 CHCl3の比を選択メタノール 100 0% から) でプレートの開始行を浸漬塗装シリカゲル プレート上 TLC 実験を行うタンク。
- すべて、TLC スポット保持因子 (Rf) 0.3 に至るように溶剤の開発の比を選択 - 0.8。
- 展開溶媒では、最後の行に達すると、プレートを取り出し、タンク、蒸発する溶剤の 10 分を待ちます。
- まず紫外線 254 nm とし、汚れの下でスポットを視覚化するクロマトグラフィー噴霧器によって 5% アニスアルデヒド (20 μ L) の酸性メタノールとそれらに吹きかけるとそれらを 3 分間 85 ° C で加熱しています。
注: TLC プレートにカラフルな斑点は、分数の主要なコンポーネントを示します。 - スポット カラーおよび主要なコンポーネントの Rfの類似性に基づいて 20 の分数に溶離液を組み合わせます。
- 約 30 分の 40 ° C で減圧 (溶剤のプロパティによると 300 mbar) 回転蒸着法による残基に分数を集中します。
3. 電気 olfactogram (EOG) 臭気分数/化合物を識別するために録音
- ホウケイ酸ガラス管を引く (外径: 1.5 mm; 内径: 0.86 mm; 長さ: 100 mm) マイクロ ピペット ヒーター レベルで引き手を 65 に設定します。
- スコアしダイヤモンドひっくり返されたガラス カッターで毛細血管の先端に開口部をカットし、0.9% 生理食塩水中での溶湯の 0.4% 寒天で塗りつぶします。キャピラリーの先端に開口部は、直径約 10 μ m にする必要があります。
- 3.1 3.2 の手順および固体電極ホルダーから引っ張られたキャピラリー電極はプレハブ 3 M マイクロ ピペットを使用して KCl Ag/agcl ペレット (材料の表を参照) を入力します。
注: は、毛細血管や電極ホルダーに空気の泡を取り除きます。 - 電極ホルダーに引っ張られた電極を挿入します。
- 100 ml 10-5 M の L-アルギニン脱イオン水 (4 ° C で保存)、メスフラスコに 10-2 M L-アルギニン原液から炭フィルター水の中。転送 10-5 M 20 mL ガラス瓶に L-アルギニン。
- 濃度応答曲線のガラス瓶で 2.3 の手順から一部プールの 10 倍希釈液 10 mL を準備します。実験の前に毎日新鮮な希釈液を準備し、一日の内で使用します。L-アルギニンと分数プール希釈作業ソリューションのガラス瓶を入れて温度 8 ° C に平衡するまで循環水のお風呂
- 3-アミノ安息香酸エチル (MS222; 100 mg/L) とヤツメウナギを麻酔し、滅菌注射器ガラミン (0.9% 生理食塩水で体重の 3 mg/kg) の投与でそれを固定します。
注: 十分な麻酔深度はないギル モーション、直立の姿勢を維持することができないおよび、口腔のディスクを使用してタンクの側面にない吸引を観察によって決定されます。前に、手術中に微生物汚染を最小限に抑えるために滅菌手袋を着用して 70% エタノール (v): 郭清ツールに使用する前に、少なくとも 10 分のための脱イオン水漬します。 - V 字スタンドで麻酔のヤツメウナギの向きし、乾燥を防ぐために湿らせたペーパー タオルで包んでください。
注: は、鰓の開口部をふさがないでください。 - 頬キャビティに MS222 の 50 mg/L を含む炭酸水を循環の管を挿入、流量を調整、水を継続的にエラを灌漑する鰓の開口部を介して終了して ことを確認します。
- 生殖不能のメスと鉗子を使用 [1.25 倍の倍率で実体顕微鏡下 (材料の表を参照してください)] 嗅上皮を公開する嗅覚のカプセルの表面の皮膚の 5 mm2セクションを削除します。
- ろ過された水に匂い配信チューブをフラッシュし、マイクロマニピュレーターにマウントされているバルブに接続します。匂いのない管理時に乾燥を防ぐために嗅上皮にろ過された水を提供するマニピュレーターを用いた嗅覚上皮キャビティに匂い配信キャピラリー チューブを配置します。
- マニピュレーターの記録および参照電極をマウントします。外部の皮膚、ナリスの近くに参照電極を下げます。電極を用いる実体顕微鏡 (1.25 倍)、低い記録やっと嗅上皮の表面をタッチします。
- 10-5 M L-アルギニン ソリューションにバック グラウンド フィルター処理水から臭気物質分配チューブの取り込みを転送します。
- コンピューター、(DC モードに設定) 増幅器、フィルター、およびデジタイザーを入れます。4 T に設定、T1 のボックスをチェックして匂いの 4 s の単一のパルスを管理する手順をプログラム バルブ ドライバー ソフトウェアを使用して s、および T2 のボックスをチェックします。
- データ集録ソフトウェアの (材料の表を参照)、高速オシロ スコープにアクイジション ・ モードを設定、再生アイコンをクリックし、匂いパルスをトリガーするバルブ ドライバーで開始をクリックします。
注: データ集録ソフトウェアの自動的に記録の差動 EOG 20 応答振幅 s (3 の前に、4 s 匂いパルスと 13 の間に s s その後)。記録電極、参照電極または L-アルギニン標準に最大応答と空白のコントロール (最小限の応答と信号対雑音比を高めるため臭気管の位置を操縦するためのマニピュレーターを使用します。ろ過された水)。GND に電極を移動しながら AC DC アンプのスイッチを切り替えることにより、増幅器を接地してください。 - 空白のコントロール、L-アルギニン、し手順 3.6 低からろ過された水の 2 分フラッシュと高濃度にアプリケーション間で匂いの記録を開始します。
- テストするすべての匂いに応答を記録した後、アンプを接地し、電極と嗅覚毛管管を慎重に撤回します。MS222 の過剰摂取と麻酔のヤツメウナギを安楽死させる次の眼球運動実験の終了時、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の承認された方法 (1 g/L)。
メモ: は、鰓の動きと少なくとも 5 分脳を pithing 続いてハートビートの欠如を注意することによって成功した安楽死を確認します。 - 分析し、解析ソフトウェアを使用してデータをプロットします。ブランク水コントロールより大きい応答を引き出す臭気の分数を識別する匂い22の検出のしきい値を決定します。空水の制御とは異なる濃度依存性嗅覚応答を引き出す分数プールは行動分析 (ステップ 4) でテストします。
4. 2 つの選択肢迷路行動活性分画/化合物を識別するために行動の生物検定
- 迷路の中でリリース檻の中で性的に成熟した女性海ヤツメウナギを順応 (補足図 1参照) 5 分の迷路の中で川の水の流量を維持
注: 迷路は迷路を上流端の 2 つのチャネルに分割する長さは 2.7 m を測定する分周器塗装マリン グレードの木材と対策幅 1.2 m 長さ 6.5 m から作成されます。水は一時的に迷路に転換します。水の深さは、0.19 m で維持されるべきし、0.07 m/s ± 0.01 で速度を維持しなければなりません。 - 海ヤツメウナギを解放し、ヤツメウナギを実験に費やしている時間と制御チャネルを含む各河川水で 10 分間の累積量を記録します。
注: 海ヤツメウナギが実験を入力し、少なくとも 10 のチャネルを制御する失敗した場合この 10 分間では、s、試用を終了は、これは非アクティブまたは強い側のバイアスを示す。 - テスト刺激を適用 (すなわち、10-12 M で推定されるフェロモン 50% メタノール/脱イオン水に溶解) ランダムに割り当てられた実験水路と車両 (50% メタノール/脱イオン水) 制御チャネルを使用して蠕動ポンプ 200 mL/分の一定のレートで 5 分。
注: 電気 olfactogram 録音で決定されたテスト刺激の検出濃度は、行動テストの初期濃度として使用する必要があります。 - テスト刺激とさらに 10 分間車を適用し、実験のヤツメウナギに費やす時間の累積量を記録と制御チャネル。
- 次の臨床試験開始前に 10 分のための水の迷路をフラッシュします。十分なテスト刺激が利用可能な場合は、少なくとも 7 ヤツメウナギと 4.1 4.4 手順を繰り返します。
- 好み22各試験のためのインデックスを計算し、ウィルコクソンの符号順位検定を使用して意義を評価します。
注: インデックスの結果は正または負にすることができます 1 つの数字。好みのインデックスの値が正の魅力を示しますは、一方優先適応反発のインデックスの負の値です。好みのインデックスがゼロと大幅に異なる場合、分数がアクティブとみなされます。
ここは
Bc嗅覚アプリケーションの前に制御チャネルのテスト ヤツメウナギで過ごした時間を =
Be = 匂いアプリケーションの前に実験水路で費やされた時間
C = 匂いアプリケーション後制御チャネルで費やされた時間と
E = 匂いアプリケーション後実験水路で費やされた時間。
5. クロマトグラフィー分離活発な分数から純粋な化合物の
- 手順 2.1 2.4 嗅覚反応 (ステップ 3) を誘導する分数プール付き、行動応答 (手順 4) を引き出します。
- さらに化合物にセファデックス LH 20 列を使用してサイズ排除クロマトグラフィーによる活発な分数を浄化します。
- 初期の移動相 0.5 mL のサンプルを準備 [CHCl3- メタノール (1:1) またはメタノール 100%] CHCl3- メタノール (1:1) 列とし、メタノール (100%)] 列に対応する列を読み込む、それら化合物を溶出します。
6 質量分析法 (MS) と核磁気共鳴 (NMR) 純粋な化合物の構造解明
- 溶解し、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 約 1 μ g/mL の 10 μ L のソリューションを形成するための初期の移動相 (通常、メタノール水、1:1、v: v) で浄化された化合物を希釈します。
- 高速液体クロマトグラフィーのバイアルに試料溶液を転送し、hplc オートサンプラーにそれらを設定します。エレクトロ スプレー イオン化質量分析法 (ESIMS) サンプル (10 μ L) 注入し、クロマトグラフィー質量分析計23を使用して高解像度のエレクトロ スプレー イオン化質量分析法 (HRESIMS) スペクトルを記録します。
- 質量分析ソフトウェアのデータベースによると分子式を予測 (材料の表を参照)24。
- 注入された試料のクロマト グラムを開き、クロマト グラフのピークを選択してその質量スペクトルを取得します。
- イオン (m/z) 値 (4 桁)の元素組成のツールモジュールの下に測定された質量を入力します。Ppm、許容値] パラメーターを設定 < 5。
- 測定の分子の元素組成に合わせて記号パラメーターを調整します。ソフトウェアは、単一の質量分析に基づく分子式の予測を生成します。
- サンプルを溶解するプロトコル25によると重水素化溶媒 (600 μ L、CH3OH -d4または DMSO -d6) を選択します。
- 濃度約 0.1 から 10 mg/mL に至るまでのソリューションを形成するため、選択した重水素化溶媒に完全に溶解します。1 D (1H, 13C) を記録する NMR チューブに試料溶液を移すと 2次元 NMR [1h1H 相関分光法 (居心地) 25pxn-1 異核単一量子コヒーレンス (HSQC) 25pxn-1 異核複数の債券の相関(非)]900 MHz NMR 分光計26のスペクトル。
- スピナー タービン内サンプルの NMR チューブを配置します。サンプルの高さ測定ウィンドウの中央にあるように深さゲージを使用します。NMR ソフトウェアを開く (材料表参照) 磁石のサンプルを変更するを持ち上げボタンをクリックします。
注: は、磁石の上部からガスを感じるように磁石の上に手を握ってください。同時に口笛の音が聞こえるはずです。 - 優しく、磁石の上に空気のクッションの上、サンプルを置き、NMR 磁石にサンプルを降下して解除ボタンを押してください。
注: は正しい位置にサンプルを示す「クリック」ノイズを聞きます。 - 新しいデータセットを作成し、NMR 装置による推奨既定パラメーターを読み込む (材料の表を参照してください)。
- 自動ロック プロシージャを呼び出すし、プロンプト] ページで溶媒を選択する「ロック」を入力します。
- 微調整しているは、操作パネルで調整モデルでロックを解除するボタン操作パネルでカーソルを調整し、磁石を再びロックします。
- アートマページ プロンプトで数分をかかる場合がありますチューニングの手順操作パネルでパラメーターを調整します。続行するチューニングが完了するまで待機します。
- 自動シミング ルーチンを先頭するには、プロンプトで"topshim"を入力します。続行する、シミングが完了するまでを待ちます。
- 型自動設定する"rga"受信ゲイン調整、型"d1"パルス、それから型「zg」集録を開始し、、買収が完了するまで待機する間遅延を設定します。
- "Ef"またはデータを処理し、自動段階の"apk"を入力する"efp"を入力します。NMR 処理ソフトウェアでデータを処理します。
- NMR データ解析の解釈によって化学構造を解明します。
- 13C NMR スペクトルにおける炭素の信号をカウントします。高分解能質量分析法 (HR MS) の予測の結果から一致する分子式を選択します。
- 1H の NMR スペクトルでプロトンの信号を統合し、炭素およびプロトン ベース HSQC スペクトル信号に接続を割り当てます。
- 1h-1H 居心地の良い相関と非スペクトルに基づく炭素骨格の接続を割り当てます。
- 一応27構造の理論的根拠に基づく化学構造を割り当てます。化学構造データベースで仮の構造を検索します。参照の類縁体と仮の構造を比較します。
- 核オーバーハウザー効果分光法 (以下) のスペクトルでは相対的な構成を割り当てます。
注: 光学異性体分析法および分光学的手法に表示される id プロパティは同一なので特に、2'-アルコールと 2'-NH2、いくつかの化合物の絶対配置がで決定する、誘導体化反応。誘導体化反応後は、スペクトルに示されている違いは、ほとんどの化合物28の絶対配置の明確な割り当てを促進します。
7. EOG とバイオアッセイ純粋な化合物を確認するため、臭気とアクティブな行動
- 3.1 3.5 の手順を繰り返します。
- 濃度-反応曲線から 10-6 M - 10-13 M 50% メタノール/水の分子量の決定に基づいて-20 ° C で保存 10-3 M フェロモン原液の純粋な化合物の 10 倍希釈液 10 mL を準備します。手順 6.2。L-アルギニンと純粋な化合物の作業ソリューションとガラスの瓶を入れて温度 8 ° C に平衡するまで循環水のお風呂
- 3.7 3.18 の手順を繰り返します。
- 4.1 4.2 の手順を繰り返します。
- 検出限界濃度は EOG で純粋な化合物をランダムに割り当てられた実験水路や車両 (50% メタノールまたは脱イオンされた水) には 5 分 200 mL/分の一定のレートで蠕動ポンプを使用して制御チャネルに適用されます。
- 4.4 4.6 の手順を繰り返します。
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Representative Results
バイオアッセイ誘導分別のプロトコルで説明されている手順をまとめた図を図 1に示します。プロトコルには、分離し、構造、嗅覚の効力 5 推定海ヤツメウナギ フェロモン (図 2) の行動の活性を評価する手順が含まれます。質量分析および NMR データ (図 3および図 4) を使用して、petromyzene A B と petromyzone A ~ C の構造を完備の成熟した男性海ヤツメウナギ22,29水から解明しました。
眼球運動記録 (図 5) から代表的なデータを示す petromyzene A B と petromyzone A C アダルト海ヤツメウナギの嗅上皮を刺激、低しきい値検出 (図 6) のすべての強力な匂いが.特に注記の眼球運動記録は信頼性の高い匂いの良い信号対雑音比の結果に刺激配信管基準嗅上皮の表面に記録電極の適切な配置を必要とする応答録音 (5 b を図)。この重要なステップに従わない場合それは高ノイズの中で芳香物質によって誘導される信号を識別することは困難になります。匂い暴露後 EOG トレースの下方にたわみが否定的な潜在性です。良い眼電図信号ベースラインへの回復に続いて迅速かつシャープな応答の結果匂い物質管理が表示されます。嗅覚応答推定のフェロモンにいた M L-アルギニン 10-5の応答に正規化も、録音の整合性を確保するための実験テスト海ヤツメウナギで肯定的な制御の嗅覚が維持されました。
2 選択迷路行動アッセイ (図 7 a) に排卵女性海ヤツメウナギ petromyzone A、petromyzene A、petromyzene B に魅了され、petromyzone petromyzone B; から撃退する C. Ovulated 女性登場から撃退しかし、行動反応は重要な (図 7 b) ではなかった。大きなサンプル サイズ petromyzone B. の限られた量のためできませんでした。匂いへの行動応答を正しく評価するには、コントロールと各ヤツメウナギの実験水路の前処理のバイアスを記録するが重要です。
図 1: フェロモンのバイオアッセイ誘導分別フローチャート。この図は、図 2、李などを貸し出して、李から適応30。ボックスは、楕円形で示されている技術から得られた化学製品を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: petromyzene A B の petromyzone A c. 化学構造Liらの数字 1 からこの図を変更します。22,29.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:1 NMR スペクトル。Petromyzene a: 1H NMR (900 MHz) スペクトル (A) と (B) の13C NMR (225 MHz) スペクトルの 1 次元 NMR スペクトル。この図は、李らのサポート情報から29.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 2次元 NMR スペクトル。Petromyzene a: (A) HSQC スペクトルの 2次元 NMR スペクトル、(B) 1h1H 居心地の良いスペクトル、(C)、非スペクトル、および (D)、NOESY スペクトル。この図は、李らのサポート情報から29.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 電気 olfactogram (EOG) 準備と代表のトレース記録を記録します。(A) 記録電極、参照電極、匂い配信管麻酔と酸素水と露出の海ヤツメウナギ嗅上皮を示す EOG 対策です。(B) このパネルは、良い (上) または悪い (下) 信号対雑音比を示す代表的なトレース レコーディングを表示します。良い信号対雑音比は、信頼性の高い嗅覚応答録音に必要です。匂い暴露後 EOG トレースの下方にたわみが否定的な潜在性です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 電気 olfactogram (EOG) 濃度応答曲線の半対数プロットします。Petromyzone A C と A と B petromyzene 大人の海ヤツメウナギの嗅上皮に刺激され低検出しきい値をあった。データは、平均正規化された EOG 振幅 ± S.E.M. として表示されます。サンプル サイズは次のとおりです: petromyzone A、petromyzene A、petromyzene B (n = 7)、petromyzone B と petromyzone C (n = 5)。はめ込みは閾値濃度応答を示す眼球運動反応の展開図です。この図は、李らの図 3 から変更されています。22李らの図 429.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 図と匂いに排卵女性海ヤツメウナギの行動応答を評価するために使用 2 つの選択肢の迷路の結果。(A) 矢印が水の流れ (0.07 m s-1 ± 0.01) の方向を表します。円は、臭気物質の管理ポイントを表します。小型の破線は、細かいメッシュの迷路の範囲への海ヤツメウナギの動きを制限するために使用を表します。大型の破線は、水の乱流を減らすためにボードの流れを表します。灰色の四角形では、リリースのケージを表します。スケール バー = 1 m。この図は図の S1 から Li et al. です。29. (B) の女性は、petromyzone A、petromyzene A および B. petromyzene に魅了されました。時間、ヤツメウナギは各チャンネル匂い露出 (10-12 M) を使用して、匂いへの行動応答を評価するために優先順位のインデックスを計算した後の前に迷路で過ごした。好みのインデックスの値が正では、アトラクションを示します。サンプル サイズをnが、かっこの外側に報告され、カッコ内の番号は、複数のコントロールと比較して実験水路で多くの時間を費やして試験女性の数を示します。± S.E.M. を意味するようにデータが表示されます (* p < 0.05;ウィルコクソンの符号順位検定) 臭気物質曝露前後に行動の優先順位を比較します。この図は、李らの図 4 から変更されています。22と図 5 Li et al.29.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: 迷路の写真。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
魚は、化学の世界はまだ識別される化合物の完全に住んでいます。バイオアッセイ誘導分別識別しサクラマス31、アジア象32、および海ヤツメウナギ33で観察など、多くの化学的相互作用を仲介する生理活性分子を特徴付ける重要な証明されています 34,35。バイオアッセイ誘導分別が正確にトレースし、pinpoint 開始から生理活性物質を抽出精製されたアクティブな化合物に効果的です。このアプローチを使用すると、特定の生理活性化合物は、化合物知られている生合成経路からを予測することがないユニークな化学スケルトンを小説を明らかにできます。
眼球は、どの留分や化合物を引き出す嗅覚応答を決定するため行われています。いくつかの技術的な考慮事項は、眼球と推定されるフェロモン嗅覚応答を正確に測定することが不可欠。まず、機関動物ケアおよび使用委員会の承認の手順に従って魚深く 3-アミノ安息香酸エチル (MS222) 麻酔、ガラミンの筋肉内注射で固定します。記録電極は、電気ノイズの原因となるエラや不十分な固定のためのハートビートの任意の動きを検出します。第二に、嗅上皮乾燥を防ぐために郭清後、すぐに炭フィルター水に公開する必要があります。空白のコントロール (応答を最小限に抑えながら肯定的な制御の匂いへの反応を最大限に高めることマニピュレーター、電気地面匂い配信管と録音及び参照電極の位置を調整します。ろ過された水)。第三に、嗅上皮で機密性の高い記録の場所を特定した後重要だレコードに変動を最小限に抑えるためのラメラの同じような位置から。似たような場所から一貫して記録し、タンクと同じ位置に魚、顕微鏡、匂い配信管とマニピュレーターを保持している V 字の樹脂製スタンドを保ちます。麻酔の管は麻酔がとれるように実験の期間魚の口腔におく必要があります。ただし、記録電極は電気信号の不安定なベースラインで水の動きを検出する場合は、麻酔薬の流量と、口腔内の配置を変更できます。
行動の分析の設計はテスト主題の行動生態と関心のリサーチ ・ クエスチョンに合わせて必要があります。2 選択迷路行動アッセイは、臭気の分数のいずれかがアクティブな行動もかどうかを決定する使用されます。精製化合物は微量で利用できる頻繁にだけなので、迷路、低い放電に伴うストリームと比較して有益な行動の生物検定です。成熟した男性の近くで成熟した女性の仲間を集めるし、産卵巣の上にそれらを保持する予測が発表した推定フェロモンの震源近傍の好みを評価する上で興味を持っていた。行動のアッセイは、成熟した男性の匂い間排卵の女性選択の自然条件を複製する設計されました。したがって、私たちの行動実験のテスト主題として排卵女性をテストに関連していた。ただし、テスト匂い、によって (すなわち、異なるライフ ステージまたは男性) 他の被験者より適切なあります。2 つの選択肢の迷路の寸法による変奏曲テスト主題と (すなわち、近い長い距離対ソース) フェロモンの予測されたアクティブな領域のサイズによって必要があります36。同様に、行動反応は、濃度依存。検出限界濃度は EOG の決定に適用されると推定されるフェロモンに行動の反応を見られない場合フェロモン濃度を調整する必要があります。ただし、その化合物は強力な臭気物質は、たとえそれ引き起こす可能性がありますいない必ずしも重要な行動の優先順位。最終的には、推定されるフェロモンの機能を確認する合成化合物とフィールド設定の迷路にみられる行動応答を検証しなければなりません。
バイオアッセイ誘導分画の 1 つの主要な制限の留分または生物検定 (EOG または動作) の化合物の連続したテストです。性フェロモンは、通常特定の比率37複数のコンポーネントの混合関数個別コンポーネント38または相乗効果としての適切な応答を誘発する39のブレンド、前作は昆虫を示しています。個体。したがって、化合物混合比に存在する場合有効になっているは、組合せテストを生理活性を確認が必要なためバイオアッセイ誘導分別と見落とす可能性があります。バイオアッセイ誘導分別の他の制限があります: 1) 大量開始材料の構造解析、EOG、行動の試金; に十分な量を持っている必要があります。2) プロセスは反復的な浄化プロセスのため時間がかかります・ 3) 非常に小さいまたは不安定な化合物が検出される可能性があります。将来は、バイオアッセイ誘導分別の技術的な制限の一部を克服するバイオアッセイ誘導分別とメタボロミクスのハイブリッド アプローチを必要があります。ハイブリッド アプローチを使用すると、相加作用または相乗フェロモン効果くださいませ13になりやすい、不安定な化合物が検出される可能性が高い。
説明バイオアッセイ誘導分化プロセス海ヤツメウナギ フェロモンの同定に設計されます。しかし、化学コミュニケーションは動物の王国1のユビキタス、このプロセスはイチイの広範な配列でフェロモンを特徴付けるに容易に合わせることができます。侵略的な種の制御に、または危険にさらさ在来種の復元に起因する行動応答を調節するフェロモンを適用できるため、フェロモンの同定と解析が重要です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
米国地質調査ハモンド湾生物ステーションの研究施設の利用、米魚類野生生物局と水産のスタッフと海カナダ海ヤツメウナギを提供するために感謝しますこの研究は、李維、柯李五大湖漁業委員会からの補助金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
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