Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at isolere og karakterisere struktur, olfaktoriske potens og adfærdsmæssige reaktion af formodede feromon forbindelser af havet lampretter.
Abstract
Bioassay-styrede fraktionering er en iterativ fremgangsmåde, der bruger resultaterne af fysiologiske og adfærdsmæssige bioassays guide isolering og identifikation af en aktiv pheromone sammensatte. Denne metode har resulteret i den vellykkede karakterisering af de kemiske signaler der fungerer som feromoner i en lang række dyrearter. Havet lampretter er afhængige af lugtesansen til at opdage pheromones at mægle adfærdsmæssige eller fysiologiske reaktioner. Vi bruger denne viden om fisk biologi at postulere funktioner af formodede feromoner og vejlede isolering og identifikation af aktive pheromone komponenter. Kromatografi bruges til at udtrække, koncentrere sig og separate forbindelser fra konditioneret vandet. Electro-olfactogram (EOG) optagelser er gennemført for at fastslå, hvilke fraktioner fremkalde olfaktoriske svar. To-valg labyrint adfærdsmæssige assays bruges derefter til at afgøre, om nogen af de lugtende fraktioner er også behaviorally aktive og fremkalde en præference. Spektrometrisk og spektroskopiske metoder giver molekylvægt og strukturelle oplysninger til at hjælpe med struktur udredning. Bioactivity af de rene forbindelser er bekræftet med EOG og adfærdsmæssige assays. De adfærdsmæssige reaktioner observeret i labyrinten skal i sidste ende valideres i feltet omgivelser til at bekræfte deres funktion i en naturlig stream indstilling. Disse bioassays spille en dobbelt rolle 1) guide fraktioneringsproces og 2) bekræfte og definere yderligere bioactivity af isolerede komponenter. Her, rapportere vi repræsentative resultaterne af en Havlampretten pheromone identifikation at eksemplificerer nytte af metoden bioassay-styrede fraktionering. Identifikation af Havlampretten feromoner er særlig vigtigt, fordi en graduering af dens pheromone kommunikationssystem er blandt de gennemgåede modeller til at styre den invasive Havlampretten i Laurentian store søer. Denne metode kan let tilpasses til at karakterisere den kemiske meddelelse i en bred vifte af taxa og kaste lys over vandbårne kemiske økologi.
Introduction
Feromoner er specifikke kemiske signaler udgivet af enkeltpersoner, der støtte dem i at lokalisere fødekilder, afsløre rovdyr og mægle sociale interaktioner af artsfæller1. Feromon kommunikation i insekter er blevet godt undersøgt2; dog er den kemiske identifikation og biologiske funktion af akvatiske hvirveldyr feromoner ikke blevet undersøgt så grundigt. Viden om identitet og funktion af feromoner udgivet kan anvendes til at fremme inddrivelsen af truede arter3,4 eller kontrol skadedyr arter5,6. Disse teknikker overførselsordning isolering og karakterisering af de bioaktive pheromone komponenter.
Feromon identifikation er en gren af naturstofkemi. Fremskridt i feromon forskning har været delvis begrænset på grund af karakteren af pheromone molekylerne, selv. Feromoner er ofte ustabile og udgivet i små mængder, og kun et par stikprøver eksisterer for at opdage små mængder af flygtige7,8 eller vandopløselige forbindelser9. Tilgange til at identificere feromoner omfatter 1) en målrettet screening af kendte forbindelser, 2) metabolomics og 3) bioassay-styrede fraktionering. En målrettet screening af forbindelser er kendt som tester kommercielt tilgængelige metaboliske biprodukter af fysiologiske processer hypotese for at fungere som feromoner. Denne tilgang er at begrænse fordi forskere kan kun test kendte og tilgængelige forbindelser. Men det har resulteret i succesfulde identifikation af kønshormoner i guldfisk der fungerer som feromoner10,11,12. Metabolomics er en anden pheromone identifikation tilgang, der adskiller potentielle lille molekyle metaboliske produkter i et biologisk system13. En sammenligning af de metaboliske profiler af to grupper (dvs.en aktiv versus en inaktiv ekstrakt) giver mulighed for identifikation af en potentiel metaboliske profil fra som metabolitten er renset, strukturen er belyst, og den bioactivity er bekræftet14. Tilsætningsstof eller synergistiske virkninger af komplekse formuleringer af bestemte blandinger er mere tilbøjelige til at blive opdaget med metabolomics fordi metabolitter betragtes sammen i stedet for som en serie af brøker13. Endnu, gennemførelsen af metabolomics afhængig af tilgængeligheden af syntetiske referencer fordi de resulterende data ikke lette klarlæggelsen af nye strukturer.
Bioassay-styrede fraktionering er en integreret og iterativ tilgang, der strækker sig over to felter: kemi og biologi. Denne fremgangsmåde bruger resultaterne af fysiologiske og adfærdsmæssige bioassays guide isolering og identifikation af en aktiv pheromone sammensatte. En rå ekstrakt er fraktioneret af en kemisk egenskab (dvs., Molekylær størrelse, polaritet, etc.) og testet med electro-olfactogram (EOG) optagelser og/eller i et bioassay. De bioaktive komponenter er screenet ved at gentage disse trin fraktionering og EOGs og/eller bioassays. Strukturer af rene aktive forbindelser er belyst ved spektrometrisk og spektroskopiske metoder, som giver molekylvægt og strukturelle oplysninger til at producere en skabelon af sammensat at blive syntetiseret. Bioassay-styrede fraktionering kan give forskellige metabolitter og potentielt roman feromoner med unikke kemiske skeletter, der er usandsynligt, at forudsiges fra de biosyntetiske veje.
Her beskriver vi de bioassay-styrede fraktionering protokol, der bruges til at isolere og karakterisere bioactivity af mandlige Havlampretten sex feromon forbindelser. Havlampret (Petromyzon marinus) er en ideel hvirveldyr model til at studere pheromone kommunikation, fordi disse fisk er stærkt afhængige af olfaktoriske påvisning af kemiske signaler at mægle anadrome liv historien består af tre særskilte faser: larver, unge og voksne. Havlampretten larverne graver sig ned i sedimentet i ferskvand streams, underkastes en drastisk forvandling og omdanne ungfisk, der overflyttes til en sø eller havet hvor de parasitize store vært fisk. Efter afmontering fra værten fisk, vandrer voksne tilbage i gydende streams, styret af de migrerende feromoner udgivet af stream-resident larver15,16,17,18,19 . Voksne hanner stige op til gydepladserne, frigive en multi-komponent sex feromon at tiltrække kammerater, periodisk gyde i ca en uge, og så dør15,20. Identifikation af Havlampretten feromoner er vigtigt, fordi en graduering af feromon kommunikationssystem er blandt de gennemgåede modeller til at styre de invasive havet lampretter i Laurentian store søer21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 og 02/17-031-00).
1. kollektion og udvinding af Havlampretten aircondition vand
- Sted seksuelt modne mandlige havet lampretter (15-30 dyr) i en tank følger med 250 L i vand tilsat kulsyre Lake Huron vedligeholdes ved 16-18 ° C.
- Indsamle de mandlige-aircondition vand hele hver aften fra juni til juli.
Bemærk: havet lampretter naturligt dør efter gydningen. Hvis en fisk nærmer sig dette punkt i sit liv, erstatte det med en frisk ældre mand. - Uddrag af konditioneret vand ved faste fase ekstraktion.
- Sættetid harpiks i methanol til 4 h før du lægger det i en kolonne. Indlæse harpiks i kolonnen og derefter pumpe 10 L vand gennem kolonnen for at eliminere den organisk opløsningsmiddel.
- Passere konditioneret vandet fra tank holder fisk via pumpesystem til toppen af kolonnen. Vandet passerer gennem en seng af 2 kg af moderat polar polymere ionbyttende harpiks (e.g., Amberlite XAD-7 HP harpiks), indeholdt i en serie af fire 2,5 L-kapacitet glas kolonner. Vedligeholde load hastigheder mellem 400 og 600 mL/6 min. elueres metabolitter med 10 liter methanol umiddelbart efterfulgt af 5 L af acetone.
Forsigtig: Dette trin bruger methanol og acetone. Begge er brandfarlige og giftige.
Bemærk: Den restdumpingmargen, der samles kan opbevares ved-80 ° C indtil videreforarbejdes.
- Genaktivere kolonnen efter 1 uge om berigelse ved at vaske det med vand (ca. 10 L).
- Fjerne den organisk opløsningsmiddel (blanding af methanol og vand) og høste uddraget af rotatorisk fordampning for 5 h under reduceret tryk (under 300 mbar) ved 40 ° C. Koncentrere vand rester af fastfrysning tørretumbler ingot i 48 timer ved-20 ° C indtil tør.
2. isolering af brøkdel Pools med kromatografi
- Sættetid silicagel (230-400 mesh) i den oprindelige mobile fase i 30 min. overførsel gel med opløsningsmiddel (suspension) til en glaskolonne. Åbne ventilen i kolonnen for at tillade den mobile fase til at gå igennem. Tillad silicagel bundfald og danne en silicagel seng.
- Bland ekstrakter med silica gel (70-230 mesh) grundigt og indlæse dem i kolonnen væskekromatografi over silicagel seng. Elueres dem med en gradient fra 95% CHCl3 (chloroform) / MeOH (methanol) til 100% MeOH, 2,5 L i samlede volumen. Indsamle elueringsvæsken i individuelle hætteglas (hver 10 ml).
Forsigtig: Chloroform anvendes i dette trin er en giftig reagens. - Guide, en sammenlægning af Elueringsvæskerne i 20 fraktioner af et tyndt lag kromatografi (TLC) analyse.
- Udføre TLC eksperiment på forhånd belagte silicagel plader ved at anvende prøven på startlinjen og nedsænkning startlinjen af pladen i udviklingslandene opløsningsmidler (Vælg polariteten af forholdet mellem CHCl3 til methanol fra 100-0%) i et forseglet glas tank.
- Vælg forholdet mellem udviklingen af opløsningsmiddel til at gøre alle de TLC steder med en fastholdelse faktor (Rf) spænder fra 0,3 - 0,8.
- Efter udvikling af opløsningsmiddel når linjen slutningen, tage pladen ud af tanken, og vente 10 min for opløsningsmidlet til at fordampe.
- Visualisere steder først under UV-lys ved 254 nm og derefter pletten dem ved at sprøjte dem med en sur methanol løsning af 5% anisaldehyde (20 μL) af en kromatografi sprøjte og varme dem på 85 ° C i 3 min.
Bemærk: De farverige steder på TLC-pladen angiver den vigtigste komponent i fraktionen. - Kombinere elueringsvæsken til 20 fraktioner baseret på den staffagefarve og Rf ligheden af den vigtigste komponent.
- Koncentrere brøk til en rest af rotatorisk fordampning under reduceret tryk (300 mbar ifølge egenskaben for opløsningsmidler) ved 40 ° C i ca 30 min.
3. Electro-olfactogram (EOG) optagelser til at identificere lugtende fraktioner/forbindelser
- Trække borsilikatglas kapillærer (ydre diameter: 1,5 mm, indvendig diameter: 0,86 mm, længde: 100 mm) med en mikropipette aftrækker med niveauet vandvarmeren angivet til 65.
- Score og skære åbning på spidsen af kapillar med en diamant spids glas cutter og fyld den med smeltet 0,4% agar i 0,9% saltvand. Åbning på spidsen af kapillar bør være omkring 10 µm i diameter.
- Fyld trak kapillær elektroderne fra trin 3.1-3.2 og solid-state elektroder indehavere præ fabrikeret med Ag/AgCl pellets (Se Tabel af materialer) med 3 M KCl ved hjælp af en mikropipette.
Bemærk: Løsne eventuelle luftbobler i kapillar eller elektrode indehaveren. - Indsæt de trak elektroder i elektrode indehavere.
- Forberede 100 mL 10-5 M L-arginin i kul-filtreret vand fra en 10-2 M L-arginin stamopløsning i ionbyttet vand (opbevares ved 4 ° C) i en målekolbe. 20 ml af den 10-5 M L-arginin til et hætteglas.
- Koncentration-respons kurve, forberede 10 10-fold mL af brøkdel puljer fra trin 2.3 i hætteglas. Tilberedes frisk fortyndinger dagligt før eksperimenterne og bruge dem inden for en dag. Sætte hætteglas af de arbejdende løsninger af L-arginin og brøkdel pool fortyndinger i vandbad recirkulerende tillade temperatur til Reagensglasset 8 ° C.
- Bedøver Flodlampret med 3-aminobenzoic syre ethylester (MS222, 100 mg/L) og immobilisere det med en intramuskulær injektion af gallamine triethiodide (3 mg/kg legemsvægt i 0,9% saltvand) med en steril sprøjte.
Bemærk: En tilstrækkelig dybde af anæstesi bestemmes ved at observere nogen gill bevægelse, manglende evne til at opretholde en oprejst stilling og ingen suge til siderne af tanken ved hjælp af sin mundtlige disk. For at minimere enhver mikrobiel forurening før og under operation, sterile handsker og blød dissektion værktøjer i 70% ethanol (v: v) i ionbyttet vand i mindst 10 min før brug. - Orientere den bedøvede Flodlampret i en V-formet stativ og pak det med en våd køkkenrulle til at forhindre udtørring.
Bemærk: Ikke hindre gill åbninger. - Indsæt et rør af recirkulerende vand tilsat kulsyre indeholdende 50 mg/L af MS222 i den bukkal hulrum, justere flow, og sikre, at vand er spændende via gill åbninger for at løbende overrisle gællerne.
- Bruge en steril skalpel og pincet [under stereoskopiske mikroskop ved 1,25 X forstørrelse (Se Tabel af materialer)] til at fjerne en 5 mm2 del af huden på overfladen af de olfaktoriske kapsel at eksponere Lugtepithelet.
- Skyl lugtstof levering rør med filtreret vand og slutte det til ventil monteret på en micromanipulator. Placere lugtstof levering kapillarrør i Lugtepithelet hulrummet ved hjælp af micromanipulator til at levere filtreret vand til Lugtepithelet at forhindre udtørring, når du ikke administrerer duftstoffer.
- Montere optagelse og reference elektroderne på micromanipulators. Lavere referenceelektrode på eksterne huden nær naris. Bruger den stereoskopiske mikroskop (1,25 X), lavere optagelse elektrode til knap skærmoverfladen Lugtepithelet.
- Overfør optagelsen af lugtstof levering rør fra baggrunden filtreret vand til 10-5 M L-arginin løsning.
- Tænd computeren, forstærker (angivet at DC-tilstand), filter og digitizer. Ved hjælp af driversoftwaren ventil program procedure til at administrere en 4 s enkelt puls af lugtstof af indskrivning den boks af T1, at T til 4 s, og indskrivning boksen i T2.
- I data erhvervelse software (Se Tabel af materialer), sæt erhvervelse mode til en højhastigheds oscilloskop, klik på play-ikonet, og klik derefter starte i ventil driveren til at udløse lugtstof puls.
Note: Data erhvervelse software registrerer automatisk den differentiale EOG svar amplitude for 20 s (3 s før 4 s under lugtstof puls og 13 s bagefter). Brug micromanipulator til at manøvre holdninger optagelse elektrode, referenceelektrode eller lugtstof tilførselsrøret at øge signal / støj-forhold med en maksimal svar til L-arginin standard og en minimal svar til blindkontroller ( filtreret vand). Jorden forstærker ved at skifte AC-DC forstærker kontakten til GND mens du flytter elektroderne. - Starte optagelsen blindprøvekontrollen, L-arginin og derefter Duftenes forberedt i trin 3.6 fra lav til høje koncentrationer med en 2 min flush filtreret vand mellem programmer.
- Efter optagelse svar til alle duftstoffer skal testes, jorden forstærkeren og forsigtigt trække elektroder og lugtstof levering kapillarrør. Efter de godkendte institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) metoder, ved afslutning af forsøget EOG aflive den bedøvede Flodlampret med en overdosis af MS222 (1 g/L).
Bemærk: Verificer vellykket eutanasi ved at bemærke manglende gill bevægelse og hjerteslag i mindst 5 min. efterfulgt af pithing i hjernen. - Analysere og plotte data ved hjælp af analysesoftwaren. Bestemme tærsklen til påvisning af Duftenes22 at identificere lugtende fraktioner, der fremkalde svar større end den tomme vandkontrol. De brøkdel puljer, der fremkalde koncentration-afhængige olfaktoriske reaktioner, der er anderledes end den tomme vandkontrol derefter testes i en adfærdsmæssige assay (trin 4).
4. to-valg labyrint adfærdsmæssige Bioassay at identificere Behaviorally aktive fraktioner/forbindelser
- Acclimate kønsmodne kvindelige Havlampretten i release cage i labyri (Se tillægs figur 1) for 5 min. vedligehold strømningshastigheden af flodvand i labyrinten
Bemærk: Labyrinten er bygget fra lakerede marine grade træ og foranstaltninger 6,5 m i længden og 1,2 m i bredden med en skillevæg måling 2,7 m længde til at adskille labyrinten i to kanaler for opstrøms enden. Vand er midlertidigt omdirigeret i labyrinten. Vanddybden skal opretholdes på 0,19 m og hastigheden skal fastholdes på 0,07 m/s ± 0,01. - Frigive Havlampretten og optage det samlede beløb af tid Bæklampretten tilbringer i den eksperimentelle og kontrol kanal hver indeholdende floden vand i 10 min.
Bemærk: Hvis Havlampretten undlader at indtaste den eksperimentelle og styre kanal for mindst 10 s i denne periode, 10 min, ender forsøget, da dette er en indikation af inaktivitet eller stærke side bias. - Anvende test stimulus (dvs.en formodede pheromone på 10-12 M opløses i 50% methanol/deioniseret vand) til tilfældigt tildelte eksperimentelle kanalen og køretøjet (50% methanol/deioniseret vand) til kontrol kanal ved hjælp af peristaltiske pumper til konstante priser på 200 mL/min i 5 min.
Bemærk: Afsløring tærskelkoncentration af test stimulus som bestemmes med electro-olfactogram optagelser bør anvendes som den oprindelige koncentration til adfærdsmæssige test. - Anvende test stimulus og køretøjet til en ekstra 10 min og optage det samlede beløb af tid Bæklampretten tilbringer i den eksperimentelle og kontrol kanal.
- Skyl labyrint med vand i 10 min før starten af den næste retssag. Gentag trin 4.1-4.4 med mindst 7 lampretter, hvis tilstrækkelig test stimulus er tilgængelige.
- Beregne et indeks af præference22 for hvert forsøg og evaluere betydning ved hjælp af en Wilcoxon underskrevet-rank test.
Bemærk: Indekset resulterer i et enkelt nummer, der kan være enten positive eller negative. En positiv værdi for indekset for præference angiver attraktion, der henviser til en negativ værdi for indekset for præference indikationer frastødning. Hvis indekset for præference er signifikant forskellig fra nul, anses fraktion for aktive.
Her
Bc = test Flodlampret i kontrolkanalen før programmet lugtstof tidsforbrug
Be = tid i den eksperimentelle kanal før programmet lugtstof
Enc = tid i kontrolkanalen efter programmet lugtstof og
Ene = tid i den eksperimentelle kanal efter programmet lugtstof.
5. kromatografiske Isolation af ren forbindelser fra aktive fraktioner
- Gentag trin 2.1-2.4 med de brøkdel puljer, der inducerer olfaktoriske svar (trin 3) og fremkalde adfærdsmæssige reaktioner (trin 4).
- Yderligere rense de aktive fraktioner i forbindelser med størrelse-udelukkelse kromatografi ved hjælp af en Sephadex LH-20 kolonne.
- Forberede prøven i 0,5 mL i den indledende mobile fase [CHCl3- MeOH (1:1) eller MeOH 100%], indlæse i den tilsvarende kolonne et CHCl3- MeOH (1:1) kolonne og derefter en MeOH (100%) kolonne og elueres dem for at give forbindelser.
6. struktur udredning af en ren sammensatte med massespektrometri (MS) og Kernemagnetisk resonans (NMR)
- Opløses og fortyndes den rensede sammensatte i den indledende mobile fase (normalt, methanol-vand, 1:1, v: v) af high-performance væskekromatografi (HPLC) til at danne en 10 μl opløsning af ca 1 μg/mL.
- Overføre prøveopløsningen til HPLC hætteglas og sætte dem i autosampler af HPLC. Tilføre electrospray Ionisation massespektrometri (ESIMS) stikprøve (10 μL) og optage høj opløsning electrospray Ionisation massespektrometri (HRESIMS) spectra ved hjælp af en kromatografi massespektrometer23.
- Forudsige Molekylær formel ifølge databasen i massespektrometer software (Se Tabel af materialer)24.
- Åbn kromatogrammet af den injicerede prøve og få sin masse spektrum ved at vælge den kromatografiske toppe.
- Inddata den målte masse ion (m/z) værdi (4 decimaler) i elementært sammensætning under modulet værktøj . Angiv parameteren tolerance til PPM < 5.
- Justere parametrene symbol til at passe element sammensætningen af den målte molekyle. Softwaren giver en forudsigelse af molekylære formel baseret på en enkelt masse analyse.
- Vælg de deutereret opløsningsmidler (600 μl, CH3OH -d4 eller DMSO -d6) Ifølge protokollen25 til at opløse prøverne.
- Opløse prøven i de valgte deutereret opløsningsmidler til at danne en løsning med en koncentration, spænder ca fra 0,1 til 10 mg/mL. Overføre prøveopløsningen ind i en NMR rør til at optage 1D (1H, 13C) og 2D NMR [1H -1H korrelation spektroskopi (hyggelig), heteronuclear enkelt quantum sammenhæng (HSQC), heteronuclear flere bond korrelation (HMBC)] Spectra på en 900 MHz NMR-spektrometer26.
- Sted NMR rør med prøve inde spinner turbine. Bruge dybde gauge for at sikre prøve højde er i midten af vinduet måling. Åbn NMR-softwaren (Se Tabel af materialer) og klik på knappen løfte at ændre prøven i magneten.
Bemærk: Hold en hånd over toppen af magnet til at føle den gas kommer fra toppen af magneten. På samme tid, bør en fløjtende lyd kunne høres. - Forsigtigt prøven anbringes på luftpude oven på magneten og tryk på Lift for igen at ned prøven i NMR magnet.
Bemærk: Lyt efter et "Klik" støj til at angive, at prøven er i den rigtige position. - Oprette et nyt datasæt og indlæse de standardparametre, der er anbefalet af NMR instrument (Se Tabel af materialer).
- Skriv "lock" at påberåbe sig den automatiske låsesystem procedure og vælg opløsningsmiddel på den hurtige side.
- For finjustering, manipuler panel, Juster knappen i modellen Unlock , justere markøren på panelet manipulere og låse magneten igen.
- Lynhurtig Atma side, justere parameter i panelet manipuler til tuning-proceduren, som kan tage et par minutter. Vent, indtil tuning er afsluttet for at fortsætte.
- Start den automatiske shimming rutine ved at skrive "topshim" i prompten. Vent, indtil de shims er afsluttet for at fortsætte.
- Type "rga" til at indstille automatisk modtager gevinst justeringer, så type "d1" til at indstille forsinkelse mellem pulser, så type "zg" at starte erhvervelse og vente, indtil erhvervelsen er færdig.
- Skriv "ef" eller "efp" for at behandle data og derefter skrive "apk" til automatisk afvikling. Behandle data på NMR behandling software.
- Belyse den kemiske struktur af en fortolkning af NMR dataanalyse.
- Tælle carbon signaler i 13C NMR-spektrum. Vælg den matchede molekylformel fra det forventede resultat i høj opløsning massespektrometri (HR-MS).
- Integrere proton signaler i 1H NMR spektret og tildele tilslutning af den CO2 - og proton-baseret på signaler i HSQC spektrum.
- Tildele connectivity i carbon skelettet baseret på korrelationer i 1H -1H HYGGELIGE og HMBC spektrum.
- Forsøgsvis tildele den kemiske struktur baseret på struktur rationale27. Søg den tentative struktur i de kemiske struktur databaser. Undersøg den tentative struktur med analoger i referencer.
- Tildele den relative konfiguration med nukleare Overhauser kraft spektroskopi (NOESY) spektrum.
Bemærk: Da egenskaberne identitet af enantiomerer vises på massespektrometri og spektroskopiske metoder er identiske, den absolutte konfiguration af nogle forbindelser, især dem med 2'-alkohol og 2'-NH2, har bestemmes med en forædling reaktion. Efter forædling reaktionen lette de forskelle, der er angivet på spektrene utvetydig tildelingen af de absolutte konfigurationer af de fleste forbindelser28.
7. EOG og Bioassay at bekræfte ren forbindelser er lugtende og behaviorally aktive
- Gentag trin 3.1-3.5.
- For koncentration-respons kurve, forberede 10 10-fold mL af de rene forbindelser fra 10-6 M - 10-13 M af en 10-3 M pheromone stamopløsning i 50% methanol/vand opbevares ved-20 ° C baseret på Molekylær vægt bestemmes i trin 6.2. Sætte hætteglas med de arbejdende løsninger af L-arginin og de rene forbindelser i vandbad recirkulerende tillade temperatur til Reagensglasset 8 ° C.
- Gentag trin 3.7-3.18.
- Gentag trin 4.1-4.2.
- Gælde det ren sammensatte på EOG påvisning tærskelkoncentration for tilfældigt tildelte eksperimentelle kanalen og køretøj (50% methanol/deioniseret vand) til kontrol kanal ved hjælp af en peristaltisk pumpe til konstante priser på 200 mL/min i 5 min.
- Gentag trin 4,4-4,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et diagram opsummerer trinene beskrevet i protokollen for den bioassay-styrede fraktionering er vist i figur 1. Protokollen indebærer trin for at isolere og karakterisere strukturen, det olfaktoriske potens og adfærdsmæssige aktiviteten af 5 formodede Havlampretten feromoner (figur 2). Ved hjælp af masse spektrometrisk og NMR data (figur 3 og figur 4), blev strukturer af petromyzene A-B og petromyzone A-C belyst fra vand aircondition med modne mandlige havet lampretter22,29.
Vores repræsentative data fra EOG optagelser (figur 5) viser, at petromyzene A-B og petromyzone A-C var alle potente duftstoffer, der stimulerede voksen Havlampretten Lugtepithelet og havde lave tærskler for afsløring (figur 6) . Af særlig note, EOG optagelser kræver en korrekt placering af optagelse elektrode på overfladen af Lugtepithelet i forhold til stimulus tilførselsrøret at resultere i en god signal-støj-forholdet for pålidelig lugtstof svar optagelser ( Figur 5B). Hvis dette kritiske trin ikke følges, vil det være vanskeligt at skelne signalet induceret af lugtstof blandt høj støj. Den nedadgående afbøjning af EOG spor efter lugtstof eksponering er en negativ potentiale. En god EOG signal skal vise en lugtstof administration resulterer i en hurtig og skarp reaktion efterfulgt af et opsving i den oprindelige plan. De olfaktoriske svar til de formodede feromoner blev også normaliseret til svar af 10-5 M L-argininog, en positiv kontrol lugtstof i Havlampretten, testet i hele eksperiment at sikre integriteten af optagelserne blev opretholdt.
I de to-valg labyrint adfærdsmæssige assays (figur 7A), ægløsning kvindelige havet lampretter var tiltrukket af petromyzone A, petromyzene A og petromyzene B, og slået tilbage fra petromyzone C. Ovulated hunner syntes at være slået tilbage fra petromyzone B; men den adfærdsmæssige reaktion var ikke væsentligt (figur 7B). En større stikprøvestørrelse var ikke mulig på grund af den begrænsede mængde af petromyzone B. Til korrekt vurdering af adfærdsmæssige reaktion på en lugtstof, er det kritisk at optage den forbehandling bias for kontrol og eksperimentelle kanal for hver Flodlampret.
Figur 1: et rutediagram i bioassay-styrede fraktionering af feromoner. Dette tal er tilpasset fra figur 2 i Li, Buchinger og Li30. Boksene angiver det resulterende kemiske produkt fra den teknik, der er angivet i ovalt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: de kemiske strukturer af petromyzene A-B og petromyzone A-C. Dette tal er ændret fra1 tal i Li et al. 22 , 29. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:1 d NMR spektre. 1D NMR spektre af petromyzene A: (A) 1H NMR (900 MHz) spektrum og (B) 13C NMR (225 MHz) spektrum. Dette tal er fra den supplerende oplysninger i Li et al. 29. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: 2D NMR spektre. 2D NMR spektre af petromyzene A: (A) HSQC-spektrum, (B) 1H -1H HYGGELIGE spektrum, (C) HMBC spektrum og (D) NOESY spektrum. Dette tal er fra den supplerende oplysninger i Li et al. 29. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Electro-olfactogram (EOG) optagelse forberedelse og repræsentant trace optagelser. (A) Dette er en EOG forberedelse viser udsatte Havlampretten Lugtepithelet med optagelse elektrode, referenceelektrode, lugtstof levering rør og hydrogenoxyd med narkose. (B) dette panel viser repræsentative trace optagelser viser god (øverst) eller dårligt (nederst) signal-støj forhold. En god signal / støj-forhold er nødvendige for pålidelige lugtstof svar optagelser. Den nedadgående afbøjning af EOG spor efter lugtstof eksponering er en negativ potentiale. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: en semi-logaritmiske plot af electro-olfactogram (EOG) koncentration-respons kurver. Petromyzone A-C og petromyzene A og B var stimulerende at voksen Havlampretten Lugtepithelet og havde lav afsløring tærskler. Dataene præsenteres som den gennemsnitlige normaliseret EOG amplitude ± S.E.M. Stikprøvestørrelserne var som følger: petromyzone A, petromyzene A og petromyzene B (n = 7), og petromyzone B og petromyzone C (n = 5). Indsatsen er en udvidet visning af EOG svar viser svar tærskel koncentrationer. Dette tal er blevet ændret fra figur 3 i Li et al. 22 og figur 4 i Li et al. 29. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: en skematisk og resultaterne af de to-valg labyrint bruges til at evaluere ægløsning kvindelige havet lampretter adfærdsmæssige reaktioner på duftstoffer. (A) pilen repræsenterer retning af vandflow (0,07 m s-1 ± 0,01). Cirklerne repræsenterer lugtstof administration punkter. De små stiplede linjer repræsenterer finmasket bruges til at begrænse flytning af Havlampretten til rammerne af labyrinten. De store stiplede linjer repræsenterer flow plader anvendes til at reducere vand turbulens. Den grå rektangel repræsenterer release bur. Skalalinjen = 1 m. Dette tal er fra figur S1 i Li et al. 29. (B) kvinder var tiltrukket af petromyzone A, petromyzene A og petromyzene B. Tid Flodlampret brugt i hver kanal af labyrinten før og efter lugtstof eksponering (10-12 M) blev brugt til at beregne et indeks af præference for at vurdere dens adfærdsmæssige reaktion på lugtstof. En positiv værdi for indekset for præference angiver attraktion. Stikprøvestørrelse, n, er rapporteret uden for parenteserne, og tallet i parentes angiver antallet af kvinder på tværs af forsøg, der brugte mere tid i den eksperimentelle kanal i forhold til kontrolelementet. Dataene præsenteres som betyder ± S.E.M. (* p < 0,05; Wilcoxon underskrevet-rank test) at sammenligne de adfærdsmæssige præferencer, før og efter lugtstof eksponering. Dette tal er blevet ændret fra figur 4 i Li et al. 22 og figur 5 i Li et al. 29. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tillægs figur 1: et fotografi af labyrinten. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fiskene lever i et kemisk verden fuld af forbindelser endnu blive identificeret. Bioassay-styrede fraktionering har vist sig nødvendigt at identificere og karakterisere bioaktive molekyler, der mægle mange kemiske interaktioner, som dem i masu laks31, asiatiske elefanter32og havet lampretter33, 34,35. Bioassay-styrede fraktionering er en effektiv tilgang til præcist spor og pinpoint de bioaktive stoffer fra start-uddrag til den oprensede aktive stof. Brug denne fremgangsmåde, kan de identificerede bioaktive stoffer afsløre en roman stof med en unik kemisk skelet, det er usandsynligt at være forudsagt fra den kendte biosyntetiske veje.
EOG optagelser er gennemført for at fastslå, hvilke fraktioner eller forbindelser fremkalde olfaktoriske svar. Flere tekniske overvejelser er bydende nødvendigt at præcist at måle de olfaktoriske svar til de formodede feromoner med EOG optagelser. Først, i overensstemmelse med den institutionelle Animal Care og brug Udvalget godkendte procedurer, fisken skal være dybt bedøvede med 3-aminobenzoic syre ethylester (MS222) og immobiliseret med en intramuskulær injektion af gallamine triethiodide. Optagelse elektrode vil registrere enhver bevægelse af gæller og hjerteslag på grund af en utilstrækkelig immobilisering, som kan være en kilde til elektrisk støj. For det andet skal Lugtepithelet straks udsættes for trækul-filtreret vand efter dissektion at forhindre udtørring. Justere placeringen af den optagelse og reference elektrode med micromanipulators, den elektriske jorden og lugtstof levering rør kan hjælpe med at maksimere svar til positiv kontrol lugtstof samtidig minimere svar til blindkontroller ( filtreret vand). Tredje, efter at identificere følsomme optagelse placering i Lugtepithelet, det er vigtigt at optage fra en lignende stilling på lamellae at minimere variationen. Du kan konsekvent optage fra et lignende sted, holde tanken og V-formet plast standen holder fisk, mikroskop, lugtstof levering rør og micromanipulators i den samme holdning. Bedøvelsesmiddel røret skal forblive i fiskens buccale hulrum i varigheden af forsøget til at sikre det forbliver bedøvede. Placering inden for den bukkal hulrum og strømningshastigheden af narkose kan dog ændres, hvis optagelse elektrode er opdage bevægelse af vandet resulterer i en uregelmæssig baseline af det elektriske signal.
Design af adfærdsmæssige analysen skal skræddersys til testpersonen adfærdsmæssige økologi og forskningsspørgsmål af interesse. To-valg labyrint adfærdsmæssige assays bruges til at afgøre, om nogen af de lugtende fraktioner er også behaviorally aktive. Fordi renset forbindelser findes ofte kun i små mængder, er labyrinten en gavnlig adfærdsmæssige bioassay sammenlignet med strøm på grund af en lavere udledning. Vi var interesserede i vurderer i nærheden kilde præference af formodede sex feromoner udgivet af voksne hanner forudsagt at tiltrække ældre kvindelige hjælpere i umiddelbar nærhed og beholde dem på en rede for gydning. Den adfærdsmæssige analyse blev designet til at kopiere naturforhold en ovulated kvindelige vælge mellem Duftenes af de voksne hanner. Det var derfor relevant at teste ægløsning hunner som testpersonen i vores adfærd eksperimenter. Afhængigt af lugtstof testet, kan det være mere passende med andre testpersoner (dvs., forskellige livsstadium eller hanner). Variationer over dimensioner for to-valg labyrint kan være nødvendige afhængigt af testpersonen og den forventede aktive plads af feromon (dvs., i nærheden af kilde versus lang afstand) størrelse36. Ligeledes er adfærdsmæssige reaktioner ofte koncentration afhængige. Hvis en adfærdsmæssige reaktion ikke er observeret, når den formodede pheromone anvendes på opdagelse tærskelkoncentration bestemmes med EOG, bør koncentrationen af pheromone justeres. Dog skal det bemærkes, at selv om et stof er en potent lugtstof, ikke kan det nødvendigvis medføre en betydelig adfærdsmæssige præferencer. I sidste ende, de adfærdsmæssige reaktioner observeret i labyrinten skal valideres i feltet omgivelser med det syntetiske stof at bekræfte funktionen af den formodede feromon.
En stor begrænsning af bioassay-styrede fraktionering er den sekventielle testning af enkelte fraktioner og forbindelser i et bioassay (EOG eller adfærd). Tidligere arbejde har vist insekt sex feromoner er typisk blandinger af flere komponenter på specifikke nøgletal37 som fungerer selvstændigt som komponenter38 eller synergistisk som blander39 til at fremkalde de rigtige svar i artsfæller. Derfor, forbindelser, der er kun aktive, når de findes i specifikke blandinger kan overset med bioassay-styrede fraktionering, fordi de kræver kombinatorisk tests for at bekræfte bioactivity. Andre begrænsninger af bioassay-styrede fraktionering omfatter: 1) en stor mængde af starter materiale er nødvendigt at have en tilstrækkelig mængde for strukturel analyse, EOG og adfærdsmæssige assays; 2) processen er tidskrævende på grund af iterative rensningsprocessen; og 3) minuscule eller ustabile forbindelser er usandsynligt, at blive opdaget. I fremtiden, kan at overvinde nogle af de tekniske begrænsninger af bioassay-styrede fraktionering kræve en hybridiserede tilgang af bioassay-styrede fraktionering og metabolomics. Brug en hybridiserede tilgang, additiv eller synergistiske pheromone effekter er mere tilbøjelige til at være skimtes13 og ustabile forbindelser er mere tilbøjelige til at blive opdaget.
Den beskrevne bioassay-styrede fraktioneringsproces er specielt designet til identifikation af Havlampretten feromoner. Men kemisk kommunikation er allestedsnærværende i dyreriget1 , og denne proces kan let tilpasses til at karakterisere feromoner i en bred vifte af taxa. Feromon identifikation og karakterisering er vigtige, fordi feromoner kan anvendes til at modulere adfærdsmæssige reaktioner resulterer i bekæmpelse af invasive arter eller i genoprettelsen af fare hjemmehørende arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker den amerikanske geologiske undersøgelse Hammond Bay biologiske Station for brug af deres forsknings-faciliteter og personale af U.S. fisk og Wildlife Service og fiskeri og oceaner Canada for at give havet lampretter. Denne forskning blev støttet af tilskud fra den store søer fiskerikommission Weiming Li og Ke Li.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
- Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
- Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
- Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
- Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
- Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
- Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , Springer Science & Business Media. (2013).
- Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
- Stacey, N., Sorensen, P. Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , Elsevier Inc. (2011).
- Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
- Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
- Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
- Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
- Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
- Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
- Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
- Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
- Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour? Animal Behaviour. 78, (2009).
- Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
- Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).
- Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
- Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
- Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692 (2007).
- Kaiser, B., Wright, A. Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , BRUKER. Madison, WI. (2008).
- Breitmaier, E., Sinnema, A. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).
- Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
- Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
- Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , In press (2018).
- Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
- Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
- Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
- Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
- Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
- De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
- De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
- Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
- Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).
