Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لعزل وتوصيف هيكل وفاعلية حاسة الشم، والاستجابة السلوكية للمركبات فرمون المفترضة للبحر الشلق.
Abstract
تجزئة تسترشد الحشري هو نهج تكرارية وتستخدم نتائج المقايسة الفسيولوجية والسلوكية لإرشاد عزل وتحديد مجمع فرمون النشطة. أدى هذا الأسلوب توصيف ناجحة من الإشارات الكيميائية التي تعمل الفيرومونات في طائفة واسعة من الأنواع الحيوانية. الشلق البحر تعتمد على أولفاكشن للكشف عن الفيرومونات التي تتوسط الاستجابات الفسيولوجية أو السلوكية. نحن نستخدم هذه المعرفة لبيولوجيا الأسماك إلى افتراض وظائف الفيرومونات المفترضة وتوجيه عزل وتحديد المكونات النشطة فرمون. يتم استخدام اللوني لاستخراج وتركيز وفصل المركبات من الماء المكيفة. وتجري التسجيلات الكهربائية-أولفاكتوجرام (EOG) لتحديد الكسور التي الحصول على ردود حاسة الشم. ثم تستخدم فحوصات السلوكية المتاهة الخيار الثاني لتحديد إذا كان أي من الكسور معطر أيضا تنشط سلوكيا والحث على تفضيل. توفير أساليب والمطيافيه والطيفية الوزن الجزيئي والمعلومات الهيكلية للمساعدة توضيح هيكل. ويؤكد بيواكتيفيتي المركبات النقية مع EOG وفحوصات السلوكية. يجب التحقق من الاستجابة السلوكية التي لوحظت في متاهات في إعداد حقل لتأكيد وظيفتها في أجواء طبيعية تيار في نهاية المطاف. هذه المقايسة بدور مزدوج 1) توجيه عملية تجزئة و 2) تأكيد وزيادة تحديد بيواكتيفيتي المكونات المعزولة. هنا، نحن تقريرا عن نتائج الممثل لتعريف فرمون لامبرى البحر التي تمثل الأداة نهج تجزئة تسترشد الحشري. تحديد الفيرومونات لامبرى البحار أهمية خاصة نظراً لتعديل نظامها للاتصالات فرمون من بين الخيارات التي نظرت للتحكم لامبرى البحر الغازية في منطقة "البحيرات الكبرى اللورنثيه". هذا الأسلوب يمكن تكييفها مع سهولة وصف البلاغ الكيميائي في طائفة واسعة من الأنواع وتسليط الضوء على الإيكولوجيا الكيميائية المنقولة بالمياه.
Introduction
الفيرومونات هي محددة الإشارات الكيميائية الصادرة عن الأفراد بمساعدتها في تحديد مصادر الغذاء، والكشف عن الحيوانات المفترسة والتوسط في التفاعلات الاجتماعية من كونسبيسيفيكس1. وقد تم الاتصال فرمون في الحشرات2من درس جيدا؛ بيد أن تحديد الهوية الكيميائية والبيولوجية الفيرومونات الفقاريات المائية لم تدرس على نطاق واسع. يمكن تطبيق معرفة هوية ووظيفة الفيرومونات الإفراج عن تيسير انتعاش الأنواع المهددة بالانقراض3،4 أو مكافحة الآفات الأنواع5،6. ويقتضي تطبيق هذه التقنيات بعزل وتوصيف المكونات النشطة بيولوجيا فرمون.
تعريف فرمون فرع من كيمياء المنتجات الطبيعية. التقدم في البحوث فرمون اقتصر جزئيا بسبب طبيعة الجزيئات فرمون أنفسهم. الفيرومونات غالباً ما تكون غير مستقرة، وتم إصدارها بكميات صغيرة، وتوجد سوى عدد قليل من تقنيات أخذ العينات للكشف عن المبالغ الدقيقة المتطايرة7،8 أو9من المركبات للذوبان في الماء. وتشمل النهج تحديد الفيرومونات 1) لفحص مستهدفة المركبات المعروفة، 2) جميع، ووجود 3) الموجهة بالعينة. اختبارات لفحص مستهدفة من المركبات المعروفة المتاحة تجارياً الآثار الجانبية الأيضية للعمليات الفسيولوجية التي افترض أن تعمل الفيرومونات. هذا النهج هو الحد للباحثين فقط اختبار المركبات المعروفة والمتاحة. ومع ذلك، أنها أدت في تحديد نجاح الهرمونات الجنسية في ذهبية تلك الوظيفة الفيرومونات10،،من1112. جميع هو نهج تحديد فرمون ثانية التي تميز المنتجات الأيضية جزيء صغير المحتملة داخل نظام البيولوجي13. مقارنة بين التشكيلات الجانبية الأيضية للفريقين (أينشاط مقابل مقتطف غير نشطة) يمكن تحديد تشكيل جانبي الأيضية المحتملة من الذي يتم تنقيته في المستقلب، هو توضيح الهيكل، بيواكتيفيتي هو تأكيد14. الآثار المضافة أو التآزر تركيبات معقدة من الخلائط محددة أكثر من المحتمل أن يكون اكتشاف مع جميع لأنها تعتبر نواتج الأيض معا وليس كسلسلة من الكسور13. حتى الآن، تنفيذ جميع يعتمد على توافر المراجع الاصطناعية لأن البيانات الناتجة لا تيسر الكشف عن هياكل جديدة.
تجزئة تسترشد الحشري هو نهج متكامل وتكرارية يمتد على حقلين: الكيمياء وعلم الأحياء. يستخدم هذا النهج نتائج المقايسة الفسيولوجية والسلوكية لإرشاد عزل وتحديد مجمع فرمون النشطة. استخراج النفط خام هو مجزأ حسب خاصية كيميائية (أي، حجم الجزيئية، قطبية، إلخ) واختبارها مع التسجيلات الكهربائية-أولفاكتوجرام (EOG) و/أو العينة. يتم فحص المكونات النشطة بيولوجيا بتكرار هذه الخطوات لتجزئة وأوجس و/أو المقايسة. يتم توضيح هياكل المركبات النشطة نقية بأساليب والمطيافيه والطيفية، التي توفر الوزن الجزيئي والمعلومات الهيكلية لإنتاج قالب من المجمع لتوليف. يمكن أن تسفر عن وجود تسترشد الحشري والايضات المتنوعة، ويحتمل أن تكون رواية الفيرومونات مع الهياكل العظمية الكيميائية الفريدة التي من غير المحتمل أن التنبؤ بمسارات السكروز.
هنا، يمكننا وصف تجزئة تسترشد الحشري البروتوكول المستخدم لعزل وتوصيف بيواكتيفيتي المركبات فرمون الجنس الذكور البحر لامبرى. لامبرى البحر (مارينوس Petromyzon) نموذج فقاريات مثالية لدراسة الاتصالات فرمون لهذه الأسماك تعتمد بشكل كبير على اكتشاف حاسة الشم من الإشارات الكيميائية للتوسط في تاريخهم الحياة البحرية النهرية السرء وتتألف من ثلاث مراحل متميزة: اليرقات والأحداث والبالغين. لامبرى البحر تحفر اليرقات في الترسبات مجاري المياه العذبة، وتمر تحول جذري، وتحويل الأحداث التي تهاجر إلى البحيرة أو المحيط حيث أنهم شوش السمك المضيف كبيرة. بعد فصلها من السمك المضيف، ترحيل البالغين إلى تيارات التفريخ، تسترشد الفيرومونات المهاجرة الإفراج اليرقات المقيم في تيار15،16،،من1718،19 . الذكور الناضجة تصعد إلى حديقة التفريخ، وإطلاق سراح من فرمون جنس متعدد عناصر جذب الأصحاب وتفرخ بشكل متقطع لمدة أسبوع تقريبا ثم يموت15،20. تحديد الفيرومونات لامبرى البحر مهم لتعديل نظام الاتصالات فرمون من بين الخيارات التي نظرت للتحكم الشلق البحر الغازية في "البحيرات الكبرى اللورنثيه"21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة ولاية ميشيغان (عوف # 03/14-054-00 و 02/17-031-00).
1-جمع واستخراج لامبرى البحر مكيفة المياه
- مكان ناضجة جنسياً الذكور البحر الشلق (15-30 الحيوانات) في صهريج لتزويد 250 لتر مياه بحيرة هورون الرغوة المحافظة في 16-18 درجة مئوية.
- جمع المياه مكيفة الذكور في جميع أنحاء كل ليلة من حزيران/يونيه إلى تموز/يوليه.
ملاحظة: الشلق البحر يموت بطبيعة الحال بعد التفريخ. إذا كان السمك يقترب من هذه النقطة في حياته، استبدلها بالذكور ناضجة طازجة. - استخراج الماء مشروطة باستخراج المرحلة الصلبة.
- امتصاص الراتنج في الميثانول ح 4 قبل تحميله إلى عمود. تحميل الراتنج في العمود، ثم ضخ 10 لتر مياه من خلال العمود لإزالة المذيبات العضوية.
- تمرير المياه مكيفة من خزان الضغط الأسماك عبر نظام ضخ المياه إلى أعلى العمود. الماء يمر من خلال سرير من 2 كغ من راتنج التبادل الأيوني البوليمرية معتدل القطبية (على سبيل المثال.، راتنج HP XAD أمبيرليتي-7)، الواردة في سلسلة من أربعة أعمدة الزجاج L سعة 2.5. الحفاظ على سرعة التحميل بين 400 و 600 مل/6 دقيقة الوت تليها مباشرة ل 5 من الأسيتون والايضات مع 10 لتر ميثانول.
تنبيه: هذه الخطوة يستخدم الميثانول والاسيتون. وكلاهما قابل للاشتعال والسامة.
ملاحظة: يمكن تخزين المتبقي المجمعة في-80 درجة مئوية حتى مواصلة معالجتها.
- إعادة تنشيط العمود بعد أسبوع واحد لتخصيب اليورانيوم قبل غسله بالماء (حوالي 10 لتر).
- إزالة المذيبات العضوية (الخليط من الميثانول والمياه) وحصاد المقتطف بالتبخر الدنمارك ح 5 تحت ضغط انخفاض (تحت 300 [مبر]) عند 40 درجة مئوية. يركز رواسب المياه التي lyophilization مجفف التجميد ح 48 في-20 درجة مئوية حتى الجاف.
2-عزل مجمعات الكسر مع اللوني
- نقع هلام السليكا (230-400 مش) في المرحلة الأولية المتنقلة ل 30 دقيقة نقل الجل مع المذيب (تعليق) لعمود زجاج. فتح الصمام للعمود للسماح لمرحلة الجوال من خلال الذهاب إلى. السماح هلام السليكا يعجل وتشكيل سرير هلام السليكا.
- مزيج المقتطفات مع السليكا هلام (مش 70-230) دقة وتحميلها على العمود اللوني السائل على السرير هلام السليكا. الوت لهم مع تدرج من 95% شكل3 (كلوروفورم)/ميوه (الميثانول) إلى 100% ميوه، 2.5 لتر في الحجم الإجمالي. جمع الوينت في قارورة فردية (كل 10 مل).
تنبيه: كلوروفورم المستخدمة في هذه الخطوة كاشف سامة. - دليل تجميع الوينتس في الكسور 20 بتحليل طبقة رقيقة لوني (TLC).
- إجراء التجربة TLC على ألواح مغلفة مسبقاً السليكا جل بتطبيق النموذج على خط البداية وغمر خط البداية لصفيحة في المذيبات النامي (اختر الأقطاب بالنسبة لشكل3 إلى الميثانول من 100-0 في المائة) في زجاج مختومة دبابة.
- حدد نسبة وضع المذيب لجعل جميع TLC البقع مع احتفاظ بعامل (Rf) تتراوح بين 0.3-0.8.
- بعد المذيب النامية تصل إلى خط النهاية، تأخذ اللوحة من الخزان، وانتظر 10 دقائق المذيب تتبخر.
- تصور أن البقع أولاً تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في 254 نانومتر ووصمة عار ثم منهم برش عليها مع حلاً ميثانول حمضية من أنيسالديهيدي 5% (20 ميكروليتر) ببخاخ لوني وتدفئة لهم في 85 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: تشير البقع الملونة على صفيحة TLC المكون الرئيسي في الكسر. - الجمع بين الوينت إلى 20 الكسور على أساس اللون الموضعي وتشابه العنصر الرئيسيو R.
- تركز الكسر لبقايا بالتبخر الدنمارك تحت ضغط انخفاض (300 [مبر] وفقا لخاصية المذيبات) عند 40 درجة مئوية لمدة حوالي 30 دقيقة.
3-الكهربائية-أولفاكتوجرام (EOG) تسجيلات لتحديد الكسور معطر/المركبات
- سحب الشعيرات الدموية البورسليكات الزجاج (القطر الخارجي: 1.5 مم؛ والقطر الداخلي: 0.86 مم؛ والطول: 100 مم) مع ميكروبيبيتي تعيين ساحبة مع مستوى سخان إلى 65.
- نقاط وقطع فتح في غيض شعري مع قطع زجاج الماس ذات الرؤوس وملئه المنصهر أجار 0.4% في المحلول الملحي 0.9 في المائة. وينبغي فتح في تلميح شعري حوالي 10 ميكرون في القطر.
- تعبئة أقطاب كهربائية الشعرية سحبت من الخطوات 3.1-3.2 وأصحاب أقطاب الحالة الصلبة ملفقة مسبقاً مع الكريات Ag/AgCl (انظر الجدول للمواد) مع 3 م بوكل استخدام ميكروبيبيتي.
ملاحظة: إزاحة أي فقاعات الهواء في الشعرية أو صاحب القطب. - إدراج أقطاب سحبت في أصحاب القطب.
- تحضير 100 مل من 10-5 م ارجينين في المياه تصفية الفحم من 10-2 م ارجينين حل أسهم في المياه (المخزنة على 4 درجة مئوية) في دورق حجمي. نقل 20 مل من 10-5 م ارجينين لقنينة زجاج.
- لمنحنى الاستجابة للتركيز، وإعداد 10 مل تخفيف إذ برك جزء من الخطوة 2.3 في قارورة من الزجاج. إعداد تخفيف الطازجة يوميا قبل التجارب والاستفادة منها خلال يوم واحد. وضع قنينة زجاج من الحلول العامل ارجينين وتخفيف تجمع الكسر في حمام مائي مغلق للسماح بدرجة الحرارة إلى حجته إلى 8 درجات مئوية.
- تخدير لامبرى مع إستر إيثيل حمض 3-امينوبنزويك (MS222؛ 100 مغ/لتر) وشل مع حقن العضلي من جالاميني تريثيوديدي (3 مغ/كغ وزن الجسم، في المياه المالحة 0.9 في المائة) مع المحاقن معقمة.
ملاحظة: يتحدد عمق الكافي للتخدير لمراقبة لا جيل الحركة، عدم قدرة على الاحتفاظ موقف تستقيم، ولا شفط إلى جانبي الخزان باستخدام على القرص عن طريق الفم. لتقليل التلوث الميكروبي أي قبل وأثناء الجراحة، ارتداء قفازات معقمة ونقع أدوات التشريح في الإيثانول 70% (الخامس: الخامس) في المياه لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. - توجيه لامبرى أنيسثيتيزيد في الوقوف على شكل V، والانتهاء من ذلك مع منشفة ورقية مبللة لمنع جفاف.
ملاحظة: لا تعرقل الفتحات الخيشومية. - إدراج أنبوب لتعميم المياه الغازية التي تحتوي على 50 مغ/لتر MS222 في التجويف الشدقى وضبط معدل تدفق، والتأكد من أن الماء هو الخروج عبر الفتحات الخيشومية لري الخياشيم باستمرار.
- استخدام مشرط معقم والملقط [تحت المجهر مجسمة في تكبير X 1.25 (انظر الجدول للمواد)] إزالة مقطع2 5 ملم في الجلد على سطح الكبسولة حاسة الشم لفضح ظهارة حاسة الشم.
- تدفق أنابيب توصيل الرائحة مع تصفية المياه وتوصيله إلى صمام شنت على ميكرومانيبولاتور. مكان التسليم الرائحة الأنبوبة الشعرية في تجويف ظهارة حاسة الشم استخدام ميكرومانيبولاتور لتوصيل المياه التي تمت تصفيتها إلى ظهارة حاسة الشم لمنع جفاف عندما لا إدارة odorants.
- جبل أقطاب تسجيل وإشارة على ميكرومانيبولاتورس. انخفاض مسرى إشارة على الجلد الخارجي بالقرب من منح. استخدام مجهر مجسم (1.25 X)، انخفاض مسرى التسجيل بالكاد لمس سطح ظهارة حاسة الشم.
- نقل الانتفاع بأنبوب إيصال الرائحة من المياه الخلفية التي تمت تصفيتها في حل ارجينين 10-5 م.
- قم بتشغيل الكمبيوتر، مكبر للصوت (تعيين إلى وضع العاصمة)، والتصفية، وجهاز الالتقاط الرقمي. استخدام برنامج تشغيل صمام، البرنامج الداخلي لإدارة 4 s نبضة واحدة من الرائحة عن طريق التحقق من المربع T1، إعداد T إلى 4 s، والتحقق من مربع T2.
- في البرنامج الحصول على البيانات (انظر الجدول للمواد)، قم بتعيين وضع اقتناء للذبذبات عالية السرعة، انقر أيقونة اللعب، وثم انقر فوق البدء في تشغيل صمام لتحريك النبض الرائحة.
ملاحظة: برنامج اقتناء بيانات السجلات تلقائياً السعة استجابة EOG التفاضلية ل 20 s (3 s قبل 4 s أثناء نبض الرائحة و 13 s بعد ذلك). استخدم في ميكرومانيبولاتور للمناورة ومواقف تسجيل القطب، والقطب مرجع، أو الرائحة إيصال الأنبوب زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء مع استجابة الحد أقصى لمستوى ارجينين واستجابة الحد أدنى إلى (عنصر التحكم فارغاً تصفية المياه). الأرض مكبر للصوت بتبديل رمز التبديل مكبر للصوت AC-DC إلى GND أثناء تحريك أقطاب كهربائية. - بدء تسجيل عنصر التحكم فارغاً، ارجينين، ومن ثم أودورانتس إعدادها في الخطوة 3.6 من منخفض إلى تركيزات عالية مع تدفق المياه التي تمت تصفيتها 2 دقيقة بين التطبيقات.
- بعد تسجيل الردود على جميع أودورانتس أن تختبر، الأرض مكبر للصوت، وسحب بعناية أقطاب والرائحة توصيل الأنبوبة الشعرية. اتباع أساليب "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) تمت الموافقة عليها، في إنهاء التجربة EOG، euthanize لامبرى أنيسثيتيزيد مع جرعة زائدة من MS222 (1 غرام/لتر).
ملاحظة: تحقق من القتل الرحيم ناجحة مشيراً إلى انعدام حركة الخياشيم ونبضات القلب لمدة 5 دقائق على الأقل متبوعاً بيثينج الدماغ. - تحليل ورسم البيانات باستخدام برمجيات التحليل. تحديد عتبة الكشف عن أودورانتس22 لتحديد الكسور معطر بالحصول على ردود أكبر من عنصر التحكم فارغاً من المياه. ثم يتم اختبارها في تجمعات الكسر الحصول على ردود حاسة الشم تعتمد على تركيز مختلفة من عنصر التحكم فارغاً من المياه في تحليل السلوكي (الخطوة 4).
4-اثنين-اختيار المتاهة الحشري السلوكية لتحديد الكسور/المركبات النشطة سلوكيا
- تأقلم لامبرى البحر أنثى ناضجة جنسياً في قفص الإفراج في المتاهة (انظر التكميلية الرقم 1) 5 كحد أدنى للحفاظ على معدل تدفق مياه النهر في المتاهة
ملاحظة: المتاهة بنيت من الخشب ملمع الصف البحرية وتدابير 6.5 متر في الطول و 1.2 متر في العرض مع مقسم 2.7 متر في الطول لفصل المتاهة إلى قناتين في نهاية المراحل الأولى. يتم تحويل المياه مؤقتاً إلى المتاهة. ينبغي الإبقاء على عمق المياه في 0.19 م وينبغي المحافظة على السرعة في 0.07 m/s ± 0.01. - إطلاق سراح لامبرى البحر وتسجيل المبلغ التراكمي للوقت لامبرى تنفق في التجريبية وقناة التحكم كل نهر المحتوية على الماء لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: إذا فشل لامبرى البحر أدخل التجريبية والتحكم في القناة لمالا يقل عن 10 s خلال هذه الفترة 10 دقيقة، في نهاية المحاكمة، حيث أن هذا إشارة إلى التحيز القائم على الخمول أو الجانب قوية. - تطبيق حافز الاختبار (أي، فرمون المفترضة في 10-12 م حله في 50 ٪ الميثانول/المياه) إلى القناة التجريبية تم تعيينها عشوائياً والمركبة (50 ٪ الميثانول/المياه) إلى عنصر التحكم باستخدام قناة تحوي مضخات بمعدلات ثابتة من 200 مل/دقيقة لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يجب استخدام تركيز عتبة الكشف عن حافز الاختبار كما هو محدد مع التسجيلات الكهربائية-أولفاكتوجرام كتركيز الأولية لاختبار سلوكية. - تطبيق حافز اختبار ووسيلة 10 دقيقة إضافية وتسجيل المبلغ التراكمي للوقت لامبرى تنفق في التجريبية وقناة التحكم.
- مسح المتاهة مع الماء لمدة 10 دقائق قبل بدء المحاكمة القادمة. كرر الخطوات من 4.1-4.4 مع الشلق 7 على الأقل إذا كانت متوفرة كافية اختبار التحفيز.
- حساب مؤشر ل تفضيل22 لكل محاكمة وتقييم أهمية استخدام اختبار رتبة وقعت الرتبي.
ملاحظة: نتائج مؤشر في رقم واحد التي يمكن أن تكون أما إيجابية أو سلبية. تشير قيمة إيجابية مؤشر من تفضيل إلى الجذب، بينما قيمة سالبة من الفهرس لتفضيل مؤشرات التنافر. إذا كان الرقم القياسي لتفضيل يختلف كثيرا عن الصفر، يعتبر الكسر النشطة.
هنا،
بج = الوقت الذي يقضيه لامبرى الاختبار في قناة التحكم قبل تطبيق الرائحة،
به = الوقت الذي يقضيه في قناة تجريبية قبل تطبيق الرائحة،
ج = الوقت الذي يقضيه في قناة التحكم بعد تطبيق الرائحة، و
ه = الوقت الذي يقضيه في القناة التجريبية بعد تطبيق الرائحة.
5-الكروماتوغرافي عزل المركبات النقية من الكسور النشطة
- كرر الخطوات من 2.1-2.4 مع تجمعات الكسر التي تحفز استجابات حاسة الشم (الخطوة 3) والحصول على ردود السلوكية (الخطوة 4).
- كذلك تنقية الكسور النشطة إلى مركبات مع حجم الاستبعاد اللوني باستخدام عمود Sephadex LH-20.
- تحضير العينة في 0.5 مل في المرحلة الأولية المتنقلة [شكل3-ميوه (1:1) أو ميوه 100%] وتحميل في العمود المطابق في شكل3-ميوه (1:1) عمود ثم عمود ميوه (100%)، والوت لهم تؤتي المركبات.
6-هيكل توضيح مركب نقي مع الطيف الكتلي (مللي ثانية) والرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي)
- حل وتمييع المجمع المنقاة في المرحلة الأولية المتنقلة (عادة، الميثانول للمياه، 1:1، الخامس: الخامس) كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) أن يشكل حلاً ميكروليتر 10 تقريبا 1 ميكروغرام/مل.
- نقل الحل عينة إلى قارورة [هبلك] ومجموعة منهم إلى أوتوسامبلير من [هبلك]. حقن العينة (10 ميكروليتر) اليكتروسبراي التأين الطيف الكتلي (اسيمس) وتسجيل الأطياف الكتلي (هريسيمس) التأين اليكتروسبراي عالية الدقة باستخدام مطياف كتلة لوني23.
- التنبؤ بالصيغة الجزيئية ووفقا لقاعدة البيانات في البرنامج الشامل مطياف (انظر الجدول للمواد)24.
- فتح chromatogram من حقن العينة والحصول على الطيف الشامل عن طريق تحديد ذروة الكروماتوغرافي.
- إدخال كتلة قياس القيمة أيون (m/z) (4 الأرقام العشرية) في تكوين عنصري ضمن الوحدة النمطية أداة . تعيين المعلمة التسامح إلى جزء في المليون < 5.
- ضبط معلمات رمز لتناسب تكوين العنصر جزيء المقاسة. ينتج البرنامج تنبؤ بالصيغة الجزيئية استناداً إلى تحليل شامل واحد.
- حدد المذيبات الديوتيريوم (600 ميكروليتر، CH3OH-د4 أو [دمس]-د6) وفقا لبروتوكول25 لإذابة العينات.
- حل تماما العينة في المذيبات الديوتيريوم المحدد تشكل حلاً مع تركيز تتراوح تقريبا بين 0.1 إلى 10 ملغ/مل. نقل الحل العينة في أنبوب الرنين المغناطيسي لتسجيل د 1 (1ح، 13ج) والرنين المغناطيسي في 2D [واحد1ح-1ح ارتباط مطيافية (مريحة)، هيتيرونوكلير الكم الاتساق (هسقك)، هيتيرونوكلير متعددة بوند الارتباط (همبك)] الأطياف في مطياف 900 ميغاهيرتز الرنين المغناطيسي النووي26.
- ضع أنبوب الرنين المغناطيسي النووي مع العينة داخل التوربينات زر الزيادة والنقصان. استخدام قياس العمق لضمان ارتفاع العينة في منتصف الإطار قياس. فتح برنامج الرنين المغناطيسي النووي (انظر الجدول للمواد) وانقر على زر رفع لتغيير العينة في المغناطيس.
ملاحظة: اضغط يد عبر الجزء العلوي من المغناطيس تشعر بالغاز القادمة من الجزء العلوي من المغناطيس. في الوقت نفسه، ينبغي أن يكون صوت صفير مسموع. - بلطف ضع العينة على وسادة الهواء فوق المغناطيس والضغط على الزر رفع مرة أخرى لتنزل العينة إلى المغناطيس الرنين المغناطيسي النووي.
ملاحظة: الاستماع لضوضاء "فوق" للإشارة إلى النموذج في الموضع الصحيح. - إنشاء مجموعة بيانات جديدة وتحميل المعلمات الافتراضية وأوصى بأن الصك الرنين المغناطيسي النووي (انظر الجدول للمواد).
- اكتب "تأمين" لاستدعاء إجراء القفل التلقائي وحدد المذيب في الصفحة فورا.
- لصقل، في لوحة التحكم، قم بضبط الزر في نموذج فتح وضبط المؤشر على لوحة التحكم، وقفل المغناطيس مرة أخرى.
- على موجه عتمة الصفحة، قم بضبط المعلمة في لوحة التحكم على ضبط الإجراءات، والذي قد يستغرق بضع دقائق. انتظر حتى اكتمال ضبط للمضي قدما.
- بدء تشغيل روتين شيمينج التلقائي بكتابة "توبشيم" في موجه الأوامر. انتظر حتى اكتمال الملئ المضي قدما.
- نوع "رجا" تعيين تلقائي تلقي التعديلات الكسب، ثم نوع "d1" لتعيين التأخير بين البقول، ثم نوع "زج" البدء في اقتناء، والانتظار حتى انتهاء حيازة.
- اكتب "ef" أو "efp" معالجة البيانات ومن ثم اكتب "أية بي كيه" التدريجي التلقائي. معالجة البيانات في برامج معالجة الرنين المغناطيسي النووي.
- توضيح التركيب الكيميائي بتفسير لتحليل البيانات الرنين المغناطيسي النووي.
- عد الإشارات الكربون في طيف "الرنين المغناطيسي النووي ج" 13. حدد الصيغة الجزيئية متطابقة من النتيجة المتوقعة في الاستبانة الطيف الكتلي (HR-MS).
- دمج إشارات بروتون في طيف "الرنين المغناطيسي ح" 1وتعيين الاتصال الكربون-وبروتون-بناء على الإشارات في الطيف هسقك.
- تعيين اتصال هيكل عظمى الكربون على أساس العلاقات المتبادلة في 1ح-1"ح مريحة" والطيف همبك.
- مبدئياً تعيين التركيب الكيميائي استناداً إلى الأساس المنطقي الهيكل27. البحث عن هيكل مؤقت في قواعد بيانات التركيب الكيميائي. مقارنة هيكل مؤقت مع النظير في المراجع.
- تعيين التكوين النسبي مع النطاق الطيفي تأثير أوفرهوزر النووية (نويسي).
ملاحظة: نظراً لخصائص الهوية متبلور مضاد المعروض في قياس الطيف الكتلي والطرق الطيفية متطابقة، تكوين بعض المركبات، لا سيما تلك مع2، 2 '--الكحول و 2'--NH المطلق قد يتحدد مع رد فعل derivatization. بعد رد فعل derivatization، تيسير الاختلافات المشار إليه على الأطياف الإحالة لا لبس فيه من تكوينات المطلقة لمعظم المركبات28.
7-EOG والحشري لتأكيد المركبات النقية معطر وسلوكيا النشطة
- كرر الخطوات من 3.1 إلى 3.5.
- لمنحنى الاستجابة للتركيز، وإعداد 10 مل تخفيف إذ من المركبات النقية من 10-6 م-10-13 م حل الأسهم فرمون 10-3 متر في 50 ٪ الميثانول والمياه المخزنة في-20 درجة مئوية استناداً إلى تحديد الوزن الجزيئي الخطوة 6.2. وضع قنينة الزجاج مع حلول العامل ارجينين والمركبات النقية في حمام مائي مغلق للسماح بدرجة الحرارة إلى حجته إلى 8 درجات مئوية.
- كرر الخطوات من 3.7-3.18.
- كرر الخطوات من 4.1-4.2.
- تطبيق مجمع نقية في تركيز عتبة الكشف عن EOG للقناة التجريبية تم تعيينها عشوائياً والمركبة (50 ٪ الميثانول/المياه) لقناة التحكم باستخدام مضخة تمعجية بمعدلات ثابتة من 200 مل/دقيقة لمدة 5 دقائق.
- كرر الخطوات من 4، 4، 4-6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 1رسم تخطيطي يلخص الخطوات الموصوفة في البروتوكول لتجزئة تسترشد الحشري. ويشمل البروتوكول خطوات لعزل وتوصيف الهيكل وفاعلية حاسة الشم والنشاط السلوكي من الفيرومونات المفترضة البحر لامبرى 5 (الشكل 2). استخدام كتلة والمطيافيه وبيانات الرنين المغناطيسي النووي (الشكل 3 و الشكل 4)، تم توضيح هياكل بيتروميزيني أ-ب وبيتروميزوني أ-ج من المياه مكيفة مع الشلق البحر الذكور الناضجة22،29.
لدينا بيانات تمثيلية من التسجيلات EOG (الشكل 5) تثبت أن بيتروميزيني أ-ب وبيتروميزوني أ-ج كانت جميع odorants القوية التي حفزت ظهارة حاسة الشم الكبار البحر لامبرى وعتبات منخفضة للكشف (الشكل 6) . علما على وجه الخصوص، تتطلب تسجيلات EOG موضع مناسب من مسرى التسجيل على سطح ظهارة حاسة الشم بالنسبة لأنبوب إيصال حافزا ليؤدي إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء جيدة للرائحة موثوق بها تسجيلات استجابة ( الشكل 5B). إذا لم يتم اتباع هذه الخطوة الحاسمة، سيكون من الصعب تمييز الإشارة الناجمة عن الرائحة بين ضوضاء عالية. انحراف نحو الانخفاض للتتبع EOG بعد التعرض الرائحة سلبية محتملة. يجب أن تظهر إشارة EOG جيدة إدارة الرائحة أسفر عن استجابة سريعة وحادة، تليها انتعاشا لخط الأساس. كانت أيضا تطبيع الردود الفيرومونات المفترضة على حاسة الشم إلى ردود 10-5 م ارجينين، وأبقى الرائحة تحكم إيجابي في لامبرى البحر، اختبار في جميع أنحاء هذه التجربة لضمان سلامة التسجيلات.
وفي فحوصات السلوكية المتاهة اثنين للاختيار (الشكل 7 أ)، أوفولاتيد الشلق البحر الإناث تنجذب إلى بيتروميزوني أ وبيتروميزيني أ بيتروميزيني ب وصد من بيتروميزوني يبدو أن الإناث أوفولاتيد جيم صد من بيتروميزوني ب؛ ومع ذلك، لم تكن استجابة السلوكية كبيرة (الشكل 7). حجم عينة أكبر لم يكن ممكناً بسبب كمية محدودة من بيتروميزوني باء لتقييم الاستجابة السلوكية للرائحة بشكل صحيح، من الضروري تسجيل التحيز المعالجة المسبقة للتحكم وقناة تجريبية لكل لامبرى.
رقم 1: مخطط انسيابي لتجزئة تسترشد الحشري من الفيرومونات. وهذا الرقم مقتبس من الشكل 2 في لي، بوتشينجير، ولي30. وتبين المربعات المنتج الكيميائية الناتجة من هذه التقنية المشار إليها في البيضاوي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الهياكل الكيميائية بيتروميزيني أ-ب وبيتروميزوني ألف-جيم يتم تعديل هذا الرقم من 1 الأرقام في لي et al. 22 , 29- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
أطياف "الرنين المغناطيسي النووي" 3:1 الشكل. أطياف الرنين المغناطيسي النووي د 1 بيتروميزيني ج: (أ) الطيف 1"ح الرنين المغناطيسي النووي" (900 ميغاهيرتز) وطيف (ب) 13"ج الرنين المغناطيسي النووي" (225 ميغاهيرتز). وهذا الرقم من المعلومات الداعمة في لي et al. 29- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: أطياف الرنين النووي المغناطيسي ثنائية الأبعاد. أطياف الرنين المغناطيسي النووي 2D بيتروميزيني ج: (أ) الطيف هسقك والطيف (ب) 1ح-1"ح مريحة" والطيف (ج) همبك والطيف (د) نويسي. وهذا الرقم من المعلومات الداعمة في لي et al. 29- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الكهربائية-أولفاكتوجرام (EOG) تسجيل تسجيلات تتبع إعداد والممثل- (أ) هذا إعداد EOG عرض ظهارة يتعرض البحر لامبرى حاسة الشم مع مسرى التسجيل ومسرى المرجعية وأنبوب إيصال الرائحة والمياه اﻷوكسيجين بالمخدر. (ب) هذا الفريق يظهر التسجيلات تتبع الممثل مما يدل على حسن (أعلى) أو سيئة (أسفل) إشارة إلى الضوضاء النسب. نسبة الإشارة إلى الضوضاء جيدة أمر ضروري لتسجيلات الردود الرائحة يمكن الاعتماد عليها. انحراف نحو الانخفاض للتتبع EOG بعد التعرض الرائحة سلبية محتملة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: قطعة شبه لوغاريتمية منحنيات الاستجابة لتركيز الكهربائية-أولفاكتوجرام (EOG)- بيتروميزوني أ-ج وبيتروميزيني A و B كانت محفزة ظهارة حاسة الشم الكبار البحر لامبرى وعتبات كشف منخفضة. وترد البيانات يعني تطبيع EOG السعة ± S.E.M. أحجام العينة على النحو التالي: بيتروميزوني أ وبيتروميزيني أ بيتروميزيني ب (n = 7)، ومن بيتروميزوني ب وبيتروميزوني ج (n = 5). اقحم يتم عرض موسع من الردود EOG عرض استجابة عتبة التركيزات. تم تعديل هذا الرقم من الرقم 3 في لي et al. 22 والرقم 4 في لي et al. 29- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: تخطيطي، ونتائج اثنين-اختيار المتاهة المستخدمة لتقييم الاستجابات السلوكية من الشلق البحر الإناث أوفولاتيد إلى أودورانتس- (أ) السهم يمثل اتجاه تدفق المياه (0.07 m s-1 ± 0.01). الدوائر تمثل النقاط الإدارة الرائحة. خطوط متقطعة صغيرة تمثل غرامة مش يستخدم لتقييد حركة لامبرى البحر إلى حدود المتاهة. تمثل الخطوط المتقطعة كبير تدفق المجالس المستخدمة للحد من الاضطرابات المائية. ويمثل المستطيل الرمادي القفص الإفراج. شريط المقياس = 1 متر. وهذا الرقم من S1 الشكل في لي et al. 29-وكانت الإناث (ب) جذب بيتروميزوني أ وبيتروميزيني أ بيتروميزيني ب الوقت الذي يقضيه لامبرى في كل قناة من المتاهة قبل وبعد التعرض الرائحة (10-12 م) استخدمت لحساب مؤشر الأفضلية لتقييم استجابتها السلوكية للرائحة. تشير قيمة إيجابية مؤشر من تفضيل إلى الجذب. ويقال حجم العينة، و نون، خارج الأقواس، والرقم في الأقواس تشير إلى أن عدد الإناث عبر التجارب التي تنفق المزيد من الوقت في قناة تجريبية مقارنة إلى عنصر التحكم. وترد البيانات يعني ± S.E.M. (* p < 0.05؛ اختبار رتبة وقعت الرتبي) مقارنة تفضيل السلوكية قبل وبعد التعرض الرائحة. تم تعديل هذا الرقم من الرقم 4 لي et al. 22 والرقم 5 في لي et al. 29- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية رقم 1: صورة فوتوغرافية للمتاهة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأسماك تعيش في عالم الكيميائي كامل للمركبات بعد تحديد. ثبت تسترشد الحشري تجزئة أساسية لتحديد وتوصيف النشطة بيولوجيا الجزيئات التي تتوسط العديد من التفاعلات الكيميائية، مثل تلك التي لوحظت في سمك السلمون masu31والفيلة الآسيوية32الشلق البحر33، ،من 3435. تجزئة تسترشد الحشري هو نهج فعال لتتبع بدقة وتحديد استخراج المركبات النشطة بيولوجيا من البداية المجمع النشط المنقي. باستخدام هذا النهج، المركبات الحيوية النشطة المحددة يمكن أن تكشف عن رواية مجمع مع هيكل عظمى كيميائية فريدة التي من غير المحتمل أن التنبؤ بمسارات السكروز المعروفة.
تسجيلات EOG تجري لتحديد الكسور أو المركبات التي الحصول على ردود حاسة الشم. العديد من الاعتبارات التقنية ضرورية لقياس دقة الردود الفيرومونات المفترضة مع تسجيلات EOG على حاسة الشم. أولاً، وفقا "رعاية الحيوان المؤسسية" وإجراءات استخدام وافقت "اللجنة"، الأسماك يجب عميق تخديره مع إستر إيثيل حمض 3-امينوبنزويك (MS222) والمعطل تداولها مع حقن العضلي من تريثيوديدي جالاميني. سيكشف مسرى تسجيل أي حركة الخياشيم وضربات القلب بسبب التثبيت غير كافية، مما يمكن أن يكون مصدرا للضوضاء الكهربائية. وثانيا، ظهارة حاسة الشم ينبغي أن فورا تتعرض للمياه التي تمت تصفيتها الفحم بعد تشريح لمنع جفاف. ضبط موقع مسرى التسجيل والإشارة ميكرومانيبولاتورس والأرض الكهربائية وأنبوب إيصال الرائحة يمكن أن يساعد على تحقيق أقصى قدر من الاستجابة للرائحة السيطرة الإيجابية مع التقليل من الرد على (عنصر التحكم فارغاً تصفية المياه). ثالثا، بعد تحديد مكان تسجيل حساسة في ظهارة حاسة الشم، من المهم إلى سجل من موقف مماثل في لاميلاي للتقليل من التباين. لاستمرار تسجيل من موقع مماثل، الحفاظ على الخزان وموقف بلاستيكية على شكل V عقد الأسماك والمجهر وأنبوب إيصال الرائحة وميكرومانيبولاتورس في نفس الموضع. يجب أن تظل أنبوب مخدر في الشدق السمك طوال فترة التجربة التأكد من أنها ما زالت أنيسثيتيزيد. ومع ذلك، يمكن تعديل الموضع داخل التجويف الشدقى ومعدل تدفق المخدر إذا مسرى التسجيل هو الكشف عن حركة المياه أدى إلى أساس خاطئ للإشارة الكهربائية.
تصميم التحليل السلوكي ينبغي أن يتكيف واﻻيكولوجيا السلوكية لاختبار هذا الموضوع ومسألة البحث من الفائدة. وتستخدم اثنين-اختيار المتاهة السلوكية فحوصات تحديد ما إذا كانت أي من الكسور معطر أيضا نشاطا سلوكيا. لأن المركبات النقية متوفرة غالباً فقط في المبالغ الدقيقة، من المتاهة الحشري سلوكية مفيدة التيار نظراً لابراء ذمة أقل بالمقارنة. نحن مهتمون في تقييم تفضيل قرب مصدر الفيرومونات الجنس المفترضة صدر عن الذكور الناضجة وتوقع لجذب الأصحاب الإناث الناضجة على مقربة والإبقاء عليها في عش لوضع البيض. التحليل السلوكي صمم لتكرار الظروف الطبيعية لاختيار الإناث أوفولاتيد بين أودورانتس الذكور الناضجة. ولذلك كان ذات الصلة لاختبار أوفولاتيد الإناث كموضوع اختبار في تجاربنا السلوك. ومع ذلك، اعتماداً اختبار الرائحة، اختبار المواضيع الأخرى (أي، مرحلة الحياة المختلفة أو الذكور) قد يكون من الأنسب. قد يكون من الضروري تبعاً للحجم من الفضاء النشطة المتوقعة من فرمون (أي، قرب المصدر مقابل المسافة طويلة) واختبار هذا الموضوع الاختلافات في أبعاد المتاهة اثنين-اختيار36. وبالمثل، الاستجابات السلوكية غالباً ما تعتمد تركيز. إذا لم يلاحظ استجابة سلوكية عندما يتم تطبيق فرمون المفترضة في تركيز عتبة الكشف عن العزم مع EOG، ينبغي تعديل تركيز فرمون. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه حتى لو مركب الرائحة قوية، أنه قد لا حمل بالضرورة تفضيل سلوكية هامة. وفي نهاية المطاف، يجب التحقق من الاستجابة السلوكية التي لوحظت في متاهات في وضع حقل مع مجمع الاصطناعية لتأكيد وظيفة فرمون المفترضة.
حد الرئيسية واحد من تجزئة تسترشد الحشري هو اختبار متسلسلة كسور الفردية أو المركبات في العينة (EOG أو السلوك). العمل السابقة قد أظهرت الحشرات الفيرومونات الجنس وعادة ما تكون خليط مكونات متعددة في نسب محددة37 التي تعمل بشكل مستقل كمكونات38 أو تآزر يمزج بين39 للحث على الاستجابات المناسبة في كونسبيسيفيكس. ولذلك، قد التغاضي عن المركبات التي تنشط فقط عندما تكون موجودة في الخلائط محددة مع وجود تسترشد الحشري لأنها تتطلب اندماجي الاختبارات للتأكد من بيواكتيفيتي. تتضمن المحددات الأخرى لتجزئة تسترشد الحشري: 1) كمية كبيرة من ابتداء من المواد اللازمة للحصول على كمية كافية للتحليل الهيكلي، EOG، وفحوصات السلوكية؛ 2) عملية تستغرق وقتاً طويلاً بسبب عملية تنقية متكررة؛ و 3) المركبات ضئيلة أو غير مستقرة من غير المحتمل أن يمكن الكشف عنها. في المستقبل، التغلب على بعض القيود التقنية وجود الموجهة بالعينة قد تتطلب اتباع نهج المهجن تجزئة تسترشد الحشري وجميع. استخدام نهج المهجن، آثار فرمون المضافة أو التآزر من المرجح أن يكون تمييز13 ومركبات غير مستقرة من المرجح أن يتم الكشف عن.
عملية تجزئة تسترشد الحشري وصف مصممة خصيصا للتعرف على الفيرومونات لامبرى البحر. ومع ذلك، الاتصالات الكيميائية موجودة في كل مكان في المملكة الحيوانية1 ويمكن تكييف هذه العملية سهولة تميز الفيرومونات في مجموعة واسعة من الأصناف. فرمون تحديد وتوصيف مهمان لأنه يمكن تطبيق الفيرومونات تعدل الاستجابات السلوكية الناتجة في السيطرة على الأنواع الغازية، أو في استعادة الأنواع الأصلية المنكوبين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الولايات المتحدة الجيولوجية المسح هاموند خليج البيولوجية المحطة لاستخدام مرافقها البحثية وموظفي الولايات المتحدة للأسماك والأحياء البرية ومصائد الأسماك والمحيطات في كندا لتوفير الشلق البحر. وأيد هذا البحث المنح المقدمة من "لجنة مصايد الأسماك في البحيرات العظمى" للي ويي، ولي كه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
- Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
- Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
- Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
- Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
- Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
- Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , Springer Science & Business Media. (2013).
- Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
- Stacey, N., Sorensen, P. Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , Elsevier Inc. (2011).
- Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
- Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
- Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
- Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
- Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
- Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
- Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
- Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
- Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour? Animal Behaviour. 78, (2009).
- Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
- Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).
- Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
- Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
- Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692 (2007).
- Kaiser, B., Wright, A. Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , BRUKER. Madison, WI. (2008).
- Breitmaier, E., Sinnema, A. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).
- Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
- Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
- Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , In press (2018).
- Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
- Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
- Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
- Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
- Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
- De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
- De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
- Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
- Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).
