Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere og karakterisere strukturen, olfactory styrke og atferdsmessige respons av antatte feromon forbindelser av havet niøyer.
Abstract
Bioassay-guidede fraksjoneres er en iterative metode som bruker resultatene av fysiologiske og behavioral bioassay for å veilede isolasjon og identifikasjon av en aktiv feromon sammensatte. Denne metoden har resultert i vellykket karakterisering av kjemiske signalene som fungerer som feromoner i et bredt spekter av dyrearter. Havet niøyer avhengige luktesans å oppdage feromoner som megle atferdsmessige eller fysiologiske svar. Vi bruker denne kunnskapen fisk biologi posit funksjoner av antatte feromoner og guide isolasjon og identifikasjon av aktive feromon komponenter. Kromatografi brukes til å trekke ut, konsentrere og skille forbindelser fra betinget vannet. Elektro-olfactogram (EOG) innspillinger er gjennomført for å fastslå hvilke fraksjoner framprovosere olfactory reaksjoner. To-valget labyrint atferdsmessige analyser brukes deretter til å finne ut om noen av illeluktende fraksjoner er også behaviorally aktive og indusere en preferanse. Spectrometric og spektroskopiske gi molekylvekt og strukturinformasjon å hjelpe til med struktur forklaring. Bioactivity av ren forbindelser er bekreftet med EOG og atferdsmessige analyser. De atferdsdata svarene observert i labyrinten bør til slutt valideres i feltet omgivelser å bekrefte deres funksjon i naturlige strømmen omgivelser. Disse bioassay spille en dobbel rolle 1) lede fraksjoneres prosessen og 2) bekrefte og definere ytterligere bioactivity av isolerte komponenter. Her rapporterer vi representant resultatene av en sjø lamprey feromon identifikasjon som eksemplifiserer verktøyet av bioassay-guidede fraksjoneres tilnærming. Identifikasjon av havet lamprey feromoner er spesielt viktig fordi en modulering av sin feromon kommunikasjonssystem er blant alternativene anses å kontrollere invasiv havet lamprey i Laurentian sjøene. Denne metoden kan lett tilpasses for å karakterisere den kjemiske kommunikasjonen i et bredt spekter av taxa og belyse vannfortynnbare kjemiske økologi.
Introduction
Feromoner er bestemte kjemiske signaler utgitt av enkeltpersoner som hjelper dem i å finne mat kilder, oppdage rovdyr og formidling sosiale interaksjoner fra Art1. Feromon kommunikasjon i insekter har vært godt studert2; imidlertid har kjemiske identifikasjon og biologisk funksjon av akvatiske virveldyr feromoner ikke blitt studert som. Kunnskap om identiteten og funksjon av feromoner utgitt kan brukes for å tilrettelegge for utvinning av truede arter3,4 eller kontroll pest arter5,6. Anvendelsen av disse teknikkene nødvendiggjør isolering og karakterisering av bioaktive feromon komponentene.
Feromon identifikasjon er en gren av naturprodukt kjemi. Fremgang i feromon forskning har vært delvis begrenset på grunn av feromon molekylene seg. Feromoner er ofte ustabil og utgitt i små mengder, og bare noen prøvetaking teknikker finnes for å oppdage minutt mengder flyktige7,8 eller vannløselige forbindelser9. Tilnærminger til å identifisere feromoner inkluderer 1) en målrettet screening av kjente forbindelser, 2) metabolomics og 3) bioassay-guidede fraksjoneres. En målrettet til kjente forbindelser tester kommersielt tilgjengelig metabolske biprodukter av fysiologiske prosesser hypotesen for å fungere som feromoner. Denne tilnærmingen er begrensende fordi forskere kan bare teste kjent og tilgjengelig forbindelser. Men har det resultert i vellykket identifikasjon av kjønnshormoner inne goldfish som fungerer som feromoner10,11,12. Metabolomics er en andre feromon identifikasjon tilnærming som skiller potensielle små molekyl metabolske produkter innen en biologisk system13. En sammenligning av metabolske profiler av to grupper (dvs.en aktiv versus et inaktive utdrag) gjør det mulig for identifikasjon av en potensiell metabolske profil fra som metabolitten er renset, strukturen er utredet, og bioactivity er bekreftet14. Additiv eller synergistic effekter av komplekse formuleringer bestemt blandinger er mer sannsynlig å bli oppdaget med metabolomics fordi metabolitter regnes sammen enn som en rekke fraksjoner13. Gjennomføringen av metabolomics bruker ennå, tilgjengeligheten av syntetiske referanser fordi resultatdataene ikke Letter utviklingen av romanen strukturer.
Bioassay-guidede fraksjoneres er en integrert, iterativ tilnærming som strekker seg over to felt: kjemi og biologi. Denne fremgangsmåten bruker resultatene av fysiologiske og behavioral bioassay for å veilede isolasjon og identifikasjon av en aktiv feromon sammensatte. En rå ekstrakt fraksjonert ved en kjemisk eiendom (dvs., molekylær størrelse, polaritet, etc.) og testet med elektro-olfactogram (EOG) innspillinger og/eller i en bioassay. Bioaktive komponenter er vist ut ved å gjenta disse trinnene i fraksjoneres og EOGs og/eller bioassay. Strukturer av ren aktiv forbindelser er belyst av spectrometric og spektroskopiske metoder, som gir molekylvekt og strukturinformasjon å lage en mal av sammensatt til syntetiseres. Bioassay-guidede fraksjoneres kan gi ulike metabolitter og potensielt romanen feromoner med unike kjemiske skjeletter som neppe å bli spådd fra biosyntetiske veier.
Her beskriver vi bioassay-guidede fraksjoneres protokollen for å isolere og karakterisere bioactivity av mannlige Havniøye sex feromon forbindelser. Havniøye (Petromyzon marinus) er en ideell virveldyr modell å studere feromon kommunikasjon fordi disse fiskene avhengige olfactory påvisning av kjemiske signaler å megle deres anadrom livshistorie består av tre distinkte faser: Larvene, unge og voksne. Havniøye larver hule i sedimentet av ferskvann, gjennomgår en drastisk metamorfose og forvandle yngel som migrere til en innsjø eller et hav der Ceratophyllidae stor vertsfisk. Etter frakobling fra verten fisken, overføre voksne tilbake til gyting bekker, guidet av de vandrende feromoner utgitt av strømmen-resident Larvene15,16,17,18,19 . Eldre menn stige til gyting grunnlag, slipper en multi-komponent sex pheromone å tiltrekke mates, og gyte i omtrent en uke, og deretter dø15,20. Identifikasjon av havet lamprey feromoner er viktig fordi en modulering av feromon kommunikasjonssystemet er blant alternativene anses å kontrollere invasiv havet niøyer i Laurentian Great Lakes21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 og 02/17-031-00).
1. innsamling og utvinning av havet Lamprey betinget vann
- Sted modne seksuelt mannlige havet niøyer (15-30 dyr) i en tank med 250 L karbonisert Huronsjøen vann vedlikeholdes på 16-18 ° C.
- Samle hann-conditioned vannet gjennom hver kveld fra juni-juli.
Merk: havet niøyer dø naturlig etter gyting. Hvis en fisken nærmer seg dette punktet i livet sitt, må du erstatte den med en fersk moden mann. - Ekstra betinget vannet av solid fase utvinning.
- Suge harpiks i metanol 4 h før du legger det i en kolonne. Laste inn harpiks i kolonnen, og pumpe 10 L vann gjennom kolonnen for å eliminere organiske løsemidler.
- Passere betinget vannet fra tanken holder fisk via pumping systemet til toppen av kolonnen. Vannet går gjennom en seng av 2 kg av moderat polar polymere ionebytte harpiks (f.eks., Amberlite XAD-7 HP harpiks) i en serie på fire 2,5 L kapasitet glass kolonner. Opprettholde sideinnlasting hastigheter mellom 400- og 600 mL/6 min. Elute metabolitter med 10 L av metanol etterfulgt av 5 L aceton.
Advarsel: Dette trinnet bruker metanol og aceton. Begge er brannfarlige og giftige.
Merk: Den grupperte gjenværende kan lagres ved-80 ° C før videre behandlet.
- Reaktivere kolonnen etter 1 uke berikelse ved å vaske den med vann (ca 10 L).
- Fjern den organiske løsemidler (blanding av metanol og vann) og høste ekstrakt av rotatory fordampning 5 h under redusert trykk (under 300 mbar) på 40 ° C. Konsentrere seg vann rester av fryse tørketrommel lyophilization 48 h på 20 ° C til tørr.
2. isolering av brøkdel bassenger med kromatografi
- Nyt silica gel (230-400 mesh) i startfasen mobile for 30 min. overføring gel med løsemiddel (suspension) til en glass-kolonne. Åpne ventilen for kolonnen slik at den mobile fasen å erfare. Tillate silica gel utløse og danne en silica gel seng.
- Bland ekstrakter med silica gel (70-230 mesh) grundig og laste dem inn i kolonnen flytende kromatografi over silica gel sengen. Elute dem med en gradient fra 95% CHCl3 (kloroform) / MeOH (metanol) til 100% MeOH, 2,5 L i totalt volum. Samle eluent i individuelle ampuller (hver 10 ml).
FORSIKTIG: Kloroform brukes i dette trinnet er en giftig reagens. - Guide samle eluents til 20 fraksjoner av et tynt lag kromatografi (TLC) analyse.
- Utføre TLC eksperimentet på pre belagt silica gel plater ved å bruke prøven på startstreken og fordype startstreken på platen i utviklingsland løsemidlene (Velg polariteten av forholdet mellom CHCl3 å metanol fra 100-0%) i en forseglet glass tank.
- Velg forholdet mellom utvikle løsemiddel å gjøre alle de TLC flekkene med en oppbevaring faktor (Rf) fra 0.3 - 0,8.
- Etter utvikling løsemiddelet når slutten linjen, ta plate ut av tanken, og vente 10 min for løsemiddelet til å fordampe.
- Visualisere flekker først under UV-lys på 254 nm og deretter flekken av sprøyting dem med en syreholdig metanol løsning av 5% anisaldehyde (20 μL) av en kromatografi sprayer og varme dem på 85 ° C i 3 minutter.
Merk: Fargerike flekker på TLC platen viser den viktigste komponenten i fraksjonen. - Kombinere eluent 20 fraksjoner basert på spotfargen og Rf likheten av hovedkomponenten.
- Konsentrere brøkene en rest av rotatory fordampning under redusert trykk (300 mbar ifølge for løsemidler) på 40 ° C i ca 30 min.
3. elektro-olfactogram (EOG) opptak identifisere illeluktende fraksjoner/forbindelser
- Trekke Borosilikatglass kapillærene (ytre diameter: 1,5 mm; indre diameter: 0,86 mm; lengde: 100 mm) med brønnene avtrekker varmeapparatet nivået satt til 65.
- Score og kutte åpningen på spissen av kapillær med en diamant-tipped glass kutter og fyll den med smeltet 0,4% agar i 0,9% saltløsning. Åpningen på spissen av av kapillær bør være rundt 10 µm i diameter.
- Fyll trakk kapillær elektrodene fra trinn 3.1-3.2 og SSD elektroder holdere før fremstille med Ag/AgCl pellets (se Tabell for materiale) med 3 M KCl hjelp av brønnene.
Merk: Fjerne eventuelle luftbobler i av kapillær eller elektrodeholderen. - Sett trakk elektrodene elektrode innehavere.
- Forberede 100 mL 10-5 M L-arginin i kull-filtrert vann fra en 10-2 M L-arginine lagerløsning i deionisert vann (lagret på 4 ° C) i en volumetriske kolbe. Overføring 20 mL 10-5 M L-arginine til et hetteglass.
- Av konsentrasjon-respons kurve, forberede 10 mL av 10 ganger fortynninger av brøkdel bassengene fra trinn 2.3 i hetteglass. Forberede frisk fortynninger daglig før eksperimenter og bruker dem innen en dag. Sette hetteglass arbeider løsninger av L-arginine og brøk bassenget fortynninger i et resirkulerende vannbad at temperaturen å equilibrate til 8 ° C.
- Bedøve lamprey med 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222, 100 mg/L) og nakkens det med en intramuskulær injeksjon av gallamine triethiodide (3 mg/kg kroppsvekt, i 0,9% saltvann) med sterile sprøyter.
Merk: Tilstrekkelig dyp anestesi bestemmes ved å observere ingen gill bevegelse, en udyktighet vedlikeholder en oppreist holdning, og ingen suction å sidene av akvariet med oral harddisken. For å minimere alle mikrobiell forurensning før og under operasjonen, bruke sterilt hansker og suge disseksjon verktøyene i 70% etanol (v: v) i deionisert vann i minst 10 min før bruk. - Orientere bedøvet lamprey i en V-formet stå og Pakk den med en våt tørkepapir å hindre uttørking.
Merk: Ikke dekk gill åpningene. - Sette inn en tube resirkulering karbonisert vann som inneholder 50 mg/L av MS222 inn i bukkal hulrommet, justere infusjonshastigheten og sikre at vann er spennende via gill åpningene å kontinuerlig vanne gjellene.
- Bruk en steril skalpell og tang [under stereoskopisk mikroskopet på en 1,25 X forstørrelse (se Tabell for materiale)] fjerne en 5 mm2 del av huden på overflaten av olfactory kapselen å avsløre olfactory epitel.
- Tømme odorant levering slangen med filtrert vann, og koble den til ventilen montert på en micromanipulator. Plass odorant levering kapillær røret i olfactory epitel hulrommet bruke micromanipulator for å levere filtrert vann på olfactory epitel å hindre uttørking når ikke administrere odorants.
- Montere opptak og referanse elektrodene på micromanipulators. Lavere referanse elektroden på eksterne huden i nærheten av naris. Av stereoskopisk mikroskopet (1,25 X), lavere opptak elektroden knapt berøre overflaten av olfactory epitel.
- Overføre opptaket av odorant levering tube fra bakgrunnen filtrert vann til 10-5 M L-arginine løsning.
- Slå på datamaskinen, forsterker (satt til DC-modus), filter og digitaliseringsenhet. Bruke driverprogramvare ventil programmet prosedyren for å administrere en 4 s enkelt puls av odorant ved å merke boksen i T1, setter T til 4 s, og merker av for T2.
- I den oppkjøp programvaren (se Tabell for materiale), satt kjøp til en høyhastighets oscilloskop, klikk på spill-ikonet og deretter starte i ventil sjåføren å utløse odorant pulsen.
Merk: Den oppkjøp programvaren automatisk registrerer differensial EOG svar amplituden for 20 s (3 før, 4 s under byens odorant og 13 s etterpå). Bruk av micromanipulator til å manøvrere stillingene av opptak elektrode, referanse elektrode eller odorant levering tube å øke signal-til-støy forholdet maksimale svar til L-arginine standard og minimal svar på tom kontroll ( filtrert vann). Bakken forsterkeren ved å bytte bryteren for AC / DC-forsterker til GND mens du flytter elektrodene. - Starte innspillingen kontrollen tomt, L-arginine og odorants forberedt i trinn 3.6 fra lave til høye konsentrasjoner med 2 min flush filtrert vann mellom programmer.
- Etter innspillingen Svar å alle odorants skal testes, bakken forsterkeren og nøye trekke det elektronen og odorant levering kapillær rør. Følgende godkjente institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) metoder, ved oppsigelse av eksperimentet EOG euthanize bedøvet lamprey med en overdose av MS222 (1 g/L).
Merk: Bekreft vellykket euthanasia ved å merke en mangel på gill bevegelser og hjerterytme for minst 5 min etterfulgt av pithing hjernen. - Analysere og plotte dataene med analyseprogramvare. Bestemme terskelen av oppdagelsen av de odorants22 å identifisere illeluktende brøker som framprovosere reaksjoner større enn kontrollen tom vann. Brøkdel bassengene som framprovosere konsentrasjon-avhengige olfactory reaksjoner som er annerledes enn kontrollen tom vann er testet i en atferdsdata analyse (trinn 4).
4. to-valget labyrint atferdsmessige Bioassay å identifisere Behaviorally aktive fraksjoner/forbindelser
- Acclimate kjønnsmoden kvinnelige havet lamprey i utgivelsen buret i labyrinten (se utfyllende figur 1) for 5 min. opprettholde inntakets elva vann i labyrinten
Merk: Labyrinten er bygget fra lakkerte marine grade tre og tiltak 6,5 meter i lengde og 1,2 meter i bredde med en skillelinje måle 2,7 meter i lengde skille labyrinten i to kanaler på oppstrøms slutten. Vann er midlertidig videre inn i labyrinten. Havdypet bør opprettholdes på 0,19 m og hastigheten bør opprettholdes på 0,07 m/s ± 0,01. - Slipp havet lamprey og registrere samlet mengde tid lamprey bruker i den eksperimentelle og kontroll kanal hver inneholder elva vann i 10 minutter.
Merk: Hvis havet lamprey ikke angi den eksperimentelle og kontroll kanal for minst 10 s i denne 10 min perioden ende rettssaken, som angir inaktivitet eller sterk side skjevhet. - Bruke testen stimulans (dvs.en antatte feromon på 10-12 M oppløst i 50% metanol/ikke-ionisert vann) tilfeldig eksperimentelle kanalen og bilen (50% metanol/ikke-ionisert vann) på kontrollen kanalen ved hjelp peristaltiske pumper til konstant priser på 200 mL/min for 5 min.
Merk: Gjenkjenning terskelen konsentrasjonen av testen stimulans som med elektro-olfactogram opptak bør brukes som første konsentrasjonen for atferdsdata testen. - Bruke testen stimulans og bilen for en ekstra 10 min og registrere samlet mengde tid lamprey bruker i den eksperimentelle og kontroll kanal.
- Tømme labyrinten med vann i 10 min før starten av neste rettssaken. Gjenta trinn 4.1-4,4 med minst 7 niøyer Hvis testen motvirket tilgjengelig.
- Beregne en indeks av preferanse22 for hvert forsøk og vurdere betydningen bruker en Diversified signert-rank test.
Merk: Indeksen resulterer i et enkelt tall som kan være enten positive eller negative. En positiv verdi for indeksen til preferanse angir attraksjon, mens en negativ verdi for indeksen til preferanse indikasjoner frastøting. Dersom indeksen preferanse er signifikant forskjellig fra null, som brøkdel aktiv.
her
Bc = tiden som brukes av testen lamprey i kontrollkanalen før programmet odorant
Be = tid brukt i eksperimentell kanalen før programmet odorant
Enc = tid brukt i kontrollkanalen etter odorant programmet, og
Ene = tid brukt i eksperimentell kanalen etter programmet odorant.
5. brukt kromatografiske isolasjon av ren forbindelser fra aktive fraksjoner
- Gjenta trinn 2.1-2.4 med brøkdel bassengene som induserer olfactory svar (trinn 3) og framprovosere atferdsdata svar (trinn 4).
- Videre rens aktive fraksjoner i forbindelser med størrelse-utestenging kromatografi bruker en Sephadex LH-20-kolonne.
- Forberede prøven i 0,5 mL i startfasen mobil [CHCl3- MeOH (1:1) eller MeOH 100%] laste inn den tilsvarende kolonnen en CHCl3- MeOH (1:1) kolonnene og deretter en MeOH (100%) og elute dem til å gi forbindelsene.
6. struktur utviklingen av en ren stoff med massespektrometri (MS) og kjernefysiske magnetisk resonans (NRM)
- Oppløse og fortynne den rensede sammensatt i mobile startfasen (vanligvis metanol til vann, 1:1, v: v) av høyytelses flytende kromatografi (HPLC) for å danne en 10 μL løsning av ca 1 μg/mL.
- Overføre prøve løsningen til HPLC ampuller og sette dem i autosampler av HPLC. Injisere prøven (10 μL) i electrospray ionization massespektrometri (ESIMS) og ta opp til høy oppløsning electrospray ionization massespektrometri (HRESIMS) spectra bruker en kromatografi masse spectrometer23.
- Forutsi den molekylære formelen etter databasen i programmet masse spectrometer (se Tabell for materiale)24.
- Åpne chromatogram på injisert utvalget og hente spekteret sin masse ved å velge brukt kromatografiske toppen.
- Angi målt massen ion (m/z)-verdien (4 desimaler) i elementær komposisjon under modulen verktøy . Sett parameteren toleranse til PPM < 5.
- Justere parameterne symbolet til elementet sammensetningen av målt molekylet. Programvaren produserer en forutsigelse av molekylære formel basert på enkelt masse analyse.
- Velg de deuterated løsemidlene (600 μL, CH3OH -d4 eller DMSO -d6) i henhold til protokollen25 å oppløse prøvene.
- Løse eksemplet i de valgte deuterated løsemidlene til en løsning med en konsentrasjon, ca fra 0,1 til 10 mg/mL. Overføre prøve løsningen til en NMR rør registrere 1D (1H, 13C) og 2D NMR [1H -1H korrelasjon spektroskopi (KOSELIGE), heteronuclear enkelt quantum sammenheng (HSQC), heteronuclear flere bånd korrelasjon (HMBC)] Spectra på en 900 MHz NMR spectrometer26.
- Sett NMR røret med prøven inne spinner turbinen. Bruk dybdemåler for å sikre prøven er i vinduet måling. Åpne NMR programvare (se Tabell for materiale) og klikk løft for å endre utvalget i magneten.
Merk: Hold en hånd over toppen av magneten føle gassen kommer fra toppen av magneten. På samme tid, bør en pipelyd være hørbar. - Forsiktig plasser prøven på luften puten på magneten og trykk knappen løft igjen å ned prøven inn NMR magneten.
Merk: Lytte til "Klikk" støy prøven er i riktig posisjon. - Opprette en ny datasett og laste standardparametere anbefalt av NMR apparatet (se Tabell for materiale).
- Skriv inn "Lås" starte automatisk låsing prosedyre og velge løsemiddelet på spørsmål siden.
- For finjustering, manipulere panel, justere knappen i Unlock modellen, justere markøren på manipulere panel og låse magneten igjen.
- På spørsmål Atma side, kan du justere parameteren i manipulere panel å tuning prosedyren, som kan ta noen minutter. Vent til kanalsøket er ferdig for å fortsette.
- Start den automatiske shimming rutinen ved å skrive "topshim" i ledeteksten. Vent til den shimming er fullført for å fortsette.
- Type "rga" Angi automatisk motta gevinst justeringer, så type "d1" Angi forsinkelsen mellom pulser, så type "zg" starte oppkjøpet, og vent til oppkjøpet er fullført.
- Skriv inn "LoF" eller "efp" behandle dataene og skriver inn "apk" for automatisk innfasing. Behandle data på NMR behandlingsprogramvaren.
- Belyse den kjemiske strukturen av en tolkning av NMR dataanalyse.
- Telle karbon signaler i 13C NMR spekter. Velg de samsvarende molekylære formelen spådd resultatet i høy oppløsning massespektrometri (HR-MS).
- Integrere proton signaler i 1H-NMR spekter og tilordne tilkobling av til karbon - og proton-basert på signalene i HSQC spekteret.
- Tilordne tilkobling av karbon skjelettet basert på sammenhenger i 1H -1H koselig og HMBC gjenferd.
- Foreløpig tilordne den kjemiske strukturen basert på strukturen begrunnelsen27. Søk foreløpig strukturen i kjemisk struktur databasene. Sammenligne foreløpig strukturen med analogs i referanser.
- Tilordne relative konfigurasjonen med kjernefysiske Overhauser effekt spektroskopi (NOESY) spekteret.
Merk: Siden identitetsegenskaper for enantiomers vises på massespektrometri og spektroskopiske metoder er identiske, absolutt konfigurasjonen av noen forbindelser, særlig de med 2-alkohol og 2-NH2, har skal fastsettes med en derivatization reaksjon. Etter derivatization reaksjon lette forskjellene angitt på til spectra utvetydig tildelingen av absolutt konfigurasjoner av de fleste forbindelser28.
7. EOG og Bioassay for å bekrefte ren forbindelser er illeluktende og behaviorally aktiv
- Gjenta 3.1-3,5.
- Av konsentrasjon-respons kurve, forberede 10 mL av 10 ganger fortynninger av ren forbindelser fra 10-6 M - 10-13 M av en 10-3 M feromon lagerløsning i 50% metanol/vann lagret på 20 ° C basert på molekylvekt i Trinn 6.2. Sette hetteglass med arbeider løsninger av L-arginine og ren forbindelser i et resirkulerende vannbad at temperaturen å equilibrate til 8 ° C.
- Gjenta 3.7-3,18.
- Gjenta 4.1-4.2.
- Bruke ren sammensatte på EOG oppdagelsen terskelen konsentrasjonen tilfeldig eksperimentelle kanalen og bilen (50% metanol/ikke-ionisert vann) til kontrollkanalen bruker en peristaltiske pumpe til konstant priser på 200 mL/min for 5 min.
- Gjenta 4.4-4.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et diagram oppsummerer fremgangsmåten beskrevet i protokollen for bioassay-guidede fraksjoneres er vist i figur 1. Protokollen inneholder trinn for å isolere og karakterisere strukturen, olfactory styrken og atferdsmessige aktiviteten av 5 mulige havet lamprey feromoner (figur 2). Med masse spectrometric og NMR data (Figur 3 og Figur 4), var konstruksjoner av petromyzene A-B og petromyzone vekselstrøm belyst fra vann klimaanlegg, moden mann havet niøyer22,29.
Vår representant data fra EOG opptakene (figur 5) viser at petromyzene A-B og petromyzone vekselstrøm var alle potent odorants som stimulerte voksen havet lamprey olfactory epitel og hadde lave terskler for påvisning (figur 6) . Legg spesielt merke EOG opptakene krever en riktig plassering av opptak elektroden på overflaten av olfactory epitel i forhold til stimulans levering røret vil resultere i et godt signal-til-støy-forhold for pålitelig odorant svar opptak ( Finne 5B). Hvis denne viktige skritt ikke er fulgt, vil det være vanskelig å skjelne signalet indusert av odorant blant høy støy. Nedover nedbøyning av EOG spor etter odorant eksponering er en negativ potensial. Et godt EOG signal skal vise en odorant administrasjon resulterer i rask og skarpt svar etterfulgt av en gjenoppretting til grunnlinjen. De antatte feromoner olfactory svar var også normalisert til svarene på 10-5 M L-arginin, en positiv kontroll odorant i havet lamprey, testet gjennom å sikre integriteten til opptakene ble opprettholdt.
I to-valget labyrint atferdsmessige analyser (figur 7A), ovulated kvinnelige havet niøyer ble tiltrukket av petromyzone A, petromyzene A og petromyzene B og slått tilbake fra petromyzone C. Ovulated kvinner syntes å være slått tilbake fra petromyzone B; men var de atferdsmessige respons ikke signifikant (figur 7B). Øke utvalgsstørrelsen var ikke mulig på grunn av begrenset antall petromyzone B. Til riktig vurdere de atferdsmessige respons på en odorant, er det viktig å registrere forbehandling skjevheten for kontroll og eksperimentelle kanal for hver lamprey.
Figur 1: et flytdiagram med bioassay-guidede fraksjoneres av feromoner. Dette tallet er tilpasset fra figur 2 i Li Buchinger og Li30. Boksene angir kjemiske sluttproduktet fra teknikken i ellipsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: den kjemiske strukturer av petromyzene A-B og petromyzone A-C. Dette tallet er endret fra tallene 1 i Li et al. 22 , 29. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:1 d NMR spekter. 1D NMR spekter av petromyzene svar: (A) 1H-NMR (900 MHz) spekteret og (B) 13C NMR (225 MHz) spektrum. Dette tallet er fra støtteinformasjon i Li et al. 29. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: 2D NMR spekter. 2D NMR spekter av petromyzene svar: (A) HSQC spekteret, (B) 1H -1H KOSELIGE spektrum, (C) HMBC spectrum og (D) i NOESY spekteret. Dette tallet er fra støtteinformasjon i Li et al. 29. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: elektro-olfactogram (EOG) opptak forberedelse og representant spor opptak. (A) Dette er en EOG forberedelse viser eksponert havet lamprey olfactory epitel med innspillingen elektroden, referanse elektrode, odorant levering tube og oksygenrikt vann med anesthetic. (B) dette panelet viser representant spor opptak demonstrere god (øverst) eller dårlig (nederst) signal-til-støy-forhold. Et godt signal-til-støy-forhold er nødvendig for pålitelig odorant svar innspillinger. Nedover nedbøyning av EOG spor etter odorant eksponering er en negativ potensial. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: en semi logaritmisk tomt elektro-olfactogram (EOG) konsentrasjon svar kurver. Petromyzone-vekselstrøm og petromyzene A og B var stimulerende til voksen havet lamprey olfactory epitel og hadde lav oppdagelsen terskler. Dataene presenteres som gjennomsnittlig normalisert EOG amplituden ± S.E.M. Utvalgene var som følger: petromyzone A, petromyzene A og petromyzene B (n = 7), og petromyzone B og petromyzone C (n = 5). Rammemargen er en utvidet visning av EOG svar viser svar terskelen konsentrasjoner. Dette tallet er endret fra figur 3 Li et al. 22 og figur 4 i Li et al. 29. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: en skjematisk og resultatene av to-valget labyrinten brukes til å evaluere atferdsdata svar av ovulated kvinnelige havet niøyer odorants. (A) pilen representerer retning av vannstrømmen (0.07 m s-1 ± 0,01). Sirkler representerer odorant administrasjon poeng. De små stiplede linjene representerer finmasket brukes til å begrense bevegelsen av havet lamprey til rammen av labyrinten. De store stiplede linjene representerer styrene brukes til å redusere vann turbulens. Det grå rektangelet representerer utgivelsen buret. Baren skala = 1 m. Dette tallet er fra figur S1 i Li et al. 29. (B) kvinner ble tiltrukket av petromyzone A, petromyzene A og petromyzene B. Tiden lamprey tilbrakte i hver kanal av labyrinten før og etter odorant eksponering (10-12 M) ble brukt til å beregne en indeks foretrekker å vurdere sin atferdsmessige respons på odorant. En positiv verdi for indeksen til preferanse angir attraksjon. Utvalgsstørrelsen, n, rapporteres utenfor parentesene, og tallet i parentes viser antall kvinner over forsøk som brukte mer tid i eksperimentell kanalen i forhold til kontrollen. Dataene presenteres som betyr ± S.E.M. (* p < 0,05; Diversified signert-rank test) å sammenligne de atferdsmessige preferansen før og etter odorant eksponering. Dette tallet er endret fra figur 4 Li et al. 22 og figur 5 i Li et al. 29. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: et fotografi av labyrinten. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fisken lever i en kjemisk verden full av forbindelser ennå identifiseres. Bioassay-guidede fraksjoneres har vist seg avgjørende for å identifisere og karakterisere bioaktive molekyler som megle mange kjemiske interaksjoner, for eksempel de observeres i masu laks31, asiatiske elefanter32og havet niøyer33, 34,35. Bioassay-guidede fraksjoneres er en effektiv tilnærming til nøyaktig sporing og pinpoint bioaktive forbindelser fra Start ekstra å renset aktive sammensatte. Bruker denne tilnærmingen, kan identifiserte bioaktive forbindelser avsløre en roman sammensatt med et unikt kjemiske skjelett at neppe å bli spådd fra kjente biosyntetiske veier.
EOG innspillinger er gjennomført for å fastslå hvilke brøker eller forbindelser framprovosere olfactory reaksjoner. Flere tekniske betraktninger er viktig å måle olfactory svarene til de antatte feromoner med EOG innspillinger. Først i henhold til institusjonelle Animal Care og bruk komiteen godkjent prosedyrer, må fisken være dypt anesthetized med 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) og immobilisert med en intramuskulær injeksjon av gallamine triethiodide. Innspillingen elektroden vil oppdage eventuelle bevegelser av gjellene og hjerteslag på grunn av en utilstrekkelig immobilisering, som kan være en kilde til elektrisk støy. Andre bør olfactory epitel umiddelbart utsettes for kull-filtrert vann etter disseksjon å hindre uttørking. Justere plasseringen av innspillingen og referanse elektroden med micromanipulators, elektrisk bakken og odorant levering røret kan bidra til å maksimere respons på positive kontroll odorant samtidig som svar på den tomme kontroll ( filtrert vann). Tredje etter å identifisere en følsom opptakssted i olfactory epitel, er det viktig post fra en lignende posisjon på lamellae å minimere variasjon. Å konsekvent registrerer fra et lignende sted, holde tanken og V-formet plast stå holde fisken, mikroskopet, odorant levering tube og micromanipulators i samme posisjon. Anestesi røret må forbli i fiskens bukkal hulrom for varigheten av å sikre at det forblir bedøvet. Plasseringen i bukkal hulrom og flyt av bedøvelse kan imidlertid endres hvis opptak elektroden registrerer bevegelse av vann som resulterer i en uberegnelig grunnlinjen til elektrisk signal.
Utformingen av atferdsmessige analysen bør tilpasses atferdsmessige økologi av testpersonen og problemstillingen rundt. To-valget labyrint atferdsmessige analyser brukes til å avgjøre om noen av illeluktende fraksjoner er også behaviorally aktive. Fordi renset forbindelser finnes ofte bare i minuttet mengder, er labyrinten en gunstig atferdsmessige bioassay sammenlignet med strømmen på grunn av en lavere utslipp. Vi var interessert i å vurdere nær kildekode fortrinnsretten antatte sex feromoner utgitt av eldre menn spådd å tiltrekke moden kvinne kamerater i nærheten og beholde dem på et reir planteplankton. Atferdsmessige analysen var utformet for å gjenskape de naturgitte forholdene i en ovulated kvinnelige velge mellom odorants av de eldre menn. Derfor var det relevant å teste ovulated kvinner som test-faget i vår oppførsel eksperimenter. Imidlertid avhengig av odorant testet, kan andre test fag (dvs., ulike liv stadium eller menn) være mer passende. Variasjoner på dimensjonene av to-valget labyrinten kan være nødvendig avhengig av testpersonen og anslått aktive løpet av feromon (dvs., nær kilden versus lang avstand)36. Likeledes, atferdsmessige responser er ofte konsentrasjon avhengige. Hvis atferdsdata svar ikke er observert når den antatte feromon brukes på oppdagelsen terskelen konsentrasjonen bestemt med EOG, skal konsentrasjonen av feromon justeres. Det bør imidlertid bemerkes at selv om et sammensatt er en potent odorant, det ikke kan nødvendigvis få en betydelig atferdsmessige preferanser. Til slutt, de atferdsdata svarene observert i labyrinten skal valideres i feltet omgivelser med syntetisk sammensatte å bekrefte funksjonen til den antatte feromon.
Ettall større begrensningen av bioassay-guidede fraksjoneres er den sekvensielle testing av personlige brøker eller forbindelser i en bioassay (EOG eller atferd). Tidligere arbeid har vist insekt sex feromoner er vanligvis blandinger av flere komponenter på spesifikke formater37 som fungerer uavhengig som komponenter38 eller synergi som blander39 å indusere hensiktsmessige reaksjoner i fra art. Derfor kan stoffer som er bare aktive når i bestemte blandinger bli oversett med bioassay-guidede fraksjoneres fordi de krever kombinasjon tester for å bekrefte bioactivity. Andre begrensninger i bioassay-guidede fraksjoneres inkluderer: 1) et stort antall starter materiale er nødvendig å ha en tilstrekkelig mengde for strukturelle analysen, EOG og atferdsmessige analyser; 2) prosessen er tidkrevende på grunn av en iterativ renselsesprosess; og 3) minuscule eller ufrankert forbindelser er usannsynlig å bli oppdaget. I fremtiden, kan overvinne noen av de tekniske begrensningene i bioassay-guidede fraksjoneres kreve en hybridisert tilnærming til bioassay-guidede fraksjoneres og metabolomics. Bruker en hybridisert tilnærming, additiv eller synergistisk feromon effektene er mer sannsynlig å bli kresne13 og ustabil forbindelser er mer sannsynlig å bli oppdaget.
Beskrevet bioassay-guidede fraksjoneres prosessen er spesielt utformet for identifikasjon av havet lamprey feromoner. Imidlertid kjemisk kommunikasjon er allestedsnærværende i dyreriket1 og denne prosessen kan lett tilpasses betegner feromoner i et bredt spekter av taxa. Feromon identifikasjon og karakterisering er viktig fordi feromoner kan brukes for å modulere atferdsdata svar resulterer i kontroll av invasiv art eller restaurering av imperiled arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker den amerikanske geologiske undersøkelse Hammond Bay biologiske stasjon for bruk av deres forskningsfasiliteter og personalet på US Fish og Wildlife Service og fiskeri og hav Canada for å gi havet niøyer. Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra Great Lakes fiskeri-kommisjonen til Weiming Li og Ke Li.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
- Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
- Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
- Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
- Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
- Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
- Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , Springer Science & Business Media. (2013).
- Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
- Stacey, N., Sorensen, P. Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , Elsevier Inc. (2011).
- Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
- Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
- Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
- Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
- Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
- Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
- Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
- Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
- Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour? Animal Behaviour. 78, (2009).
- Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
- Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).
- Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
- Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
- Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692 (2007).
- Kaiser, B., Wright, A. Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , BRUKER. Madison, WI. (2008).
- Breitmaier, E., Sinnema, A. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).
- Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
- Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
- Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , In press (2018).
- Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
- Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
- Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
- Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
- Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
- De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
- De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
- Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
- Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).
