Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu isolieren und zu charakterisieren, Struktur, olfaktorische Potenz und Verhaltensreaktion des vermeintlichen Pheromon Verbindungen der Meer Neunaugen.
Abstract
Bioassay-geführte Fraktionierung ist eine iterative Vorgehensweise, die die Ergebnisse der physiologischen und verhaltensbezogenen Bioassays verwendet, um die Isolierung und Identifizierung von einer aktiven Pheromon-Verbindung führen. Diese Methode führte in der erfolgreichen Charakterisierung der chemischen Signale dieser Funktion als Pheromone in einer Vielzahl von Tierarten. Meer Neunaugen setzen auf Geruchssinn, Pheromone zu erkennen, die Verhaltens- oder physiologische Reaktionen zu vermitteln. Wir nutzen dieses Wissen der Biologie der Fische, um Funktionen des vermeintlichen Pheromone zu postulieren und die Isolierung und Identifizierung von aktiven Pheromon-Komponenten führen. Chromatographie wird verwendet, um zu extrahieren, zu konzentrieren und Verbindungen aus dem konditionierten Wasser zu trennen. Elektro-Olfactogram (EOG) Aufnahmen werden durchgeführt, um festzustellen, welche Fraktionen olfaktorische Reaktionen hervorrufen. Zwei-Wahl Labyrinth Verhaltens Assays werden dann verwendet, um festzustellen, ob die duftenden Fraktionen auch verhaltensorientierte aktiv sind und eine Präferenz induzieren. Spektrometrische und spektroskopische Methoden bieten das Molekulargewicht und strukturelle Informationen gerne bei der Strukturaufklärung. Die Bioaktivität der reinen Verbindungen wird mit EOG und Verhaltensstörungen Assays bestätigt. Die Verhaltensreaktionen beobachtet im Labyrinth müssen letztlich in eine Feld-Einstellung, um ihre Funktion in einem natürlichen Bach Einstellung bestätigen überprüft werden. Diese Bioassays eine doppelte Rolle um 1) führen die Fraktionierung Prozess und (2) bestätigen und weiter zu definieren, die Bioaktivität der isolierte Komponenten. Hier berichten wir über die repräsentativen Ergebnisse einer Meerneunauge Pheromon-Identifikation, die exemplarisch für das Dienstprogramm des Bioassay-geführte Fraktionierung Ansatzes. Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone ist besonders wichtig, weil eine Modulation der Pheromon-Kommunikations-System unter den Optionen als invasive Meerneunauge im Laurentian Great Lakes zu kontrollieren ist. Diese Methode kann leicht angepasst werden der chemische Kommunikation in einer breiten Palette von Taxa zu charakterisieren und werfen Licht auf Wasserbasis Chemische Ökologie.
Introduction
Pheromone sind spezielle chemische Signale, die von Personen, die ihnen Hilfe bei der Ortung Nahrungsquellen, Erkennung von Raubtieren und Vermittlung von sozialen Interaktionen der Artgenossen1veröffentlicht. Pheromon-Kommunikation bei Insekten wurde gut untersuchte2; die chemische Identifizierung und biologische Funktion der aquatischen Wirbeltieren Pheromone haben jedoch nicht so umfassend untersucht worden. Die Identität und Funktion der Pheromone freigegeben können angewendet werden, um die Wiederherstellung der bedrohten Arten3,4 oder Kontrolle Schädling Arten5,6zu erleichtern. Die Anwendung dieser Techniken erfordern die Isolierung und Charakterisierung von bioaktiven Pheromon-Komponenten.
Pheromon-Identifikation ist ein Zweig der Naturstoffchemie. Fortschritte in der Pheromon-Forschung wurde aufgrund der Beschaffenheit der Pheromon-Moleküle sich teilweise begrenzt. Pheromone sind oft instabil und in kleinen Mengen freigegeben, und nur ein paar Sampling-Techniken existieren, um winzige Mengen von flüchtigen7,8 oder wasserlöslichen Verbindungen9zu erkennen. Ansätze, Pheromone zu identifizieren sind (1) eine gezielte Überprüfung der bekannten Verbindungen, Metabolomik (2) und (3) Bioassay-geführte Fraktionierung. Eine gezielte Überprüfung der bekannten Verbindungen testet im Handel erhältlichen metabolische Nebenprodukte der physiologischen Prozesse, die die Hypothese als Pheromone funktionieren. Dieser Ansatz begrenzt, weil Forscher nur bekannte und verfügbare Verbindungen testen können. Allerdings hat es die erfolgreiche Identifikation von Sexualhormonen in Goldfisch diese Funktion als Pheromone10,11,12geführt. Metabolomik ist ein zweiter Pheromon-Identifikation-Ansatz, der potenzielle niedermolekulare Stoffwechselprodukte innerhalb eines biologischen Systems13unterscheidet. Ein Vergleich der Stoffwechselprofile von zwei Gruppen (d. h., eine aktive im Vergleich zu inaktiven Auszug) ermöglicht die Identifizierung eines möglichen metabolischen Profils aus, der Metabolit gereinigt wird, ist die Struktur aufgeklärt, und die Bioaktivität ist bestätigten14. Additive oder synergistische Wirkungen der komplexen Formulierungen bestimmte Mischungen sind eher mit Metabolomics erkannt werden, weil Metaboliten zusammen anstatt als eine Reihe von Fraktionen13gelten. Doch hängt die Umsetzung der Metabolomik die Verfügbarkeit von synthetischen Referenzen weil die resultierenden Daten nicht die Aufklärung der neuartige Strukturen erleichtern.
Bioassay-geführte Fraktionierung ist ein integrierte, iterativen Ansatz, die zwei Felder umfasst: Chemie und Biologie. Dieser Ansatz nutzt die Ergebnisse der physiologischen und verhaltensbezogenen Bioassays, die Isolierung und Identifizierung von einer aktiven Pheromon-Verbindung führen. Ein grober Extrakt ist fraktioniert durch eine chemische Eigenschaft (d.h., Molekülgröße, Polarität, etc.) und getestet mit Elektro-Olfactogram (EOG) Aufnahmen und/oder in einem Bioassay. Die bioaktiven Komponenten werden heraus durch Wiederholen Sie diese Schritte der Fraktionierung und EOGs bzw. Bioassays gezeigt. Die Strukturen der reinen Wirkstoffe sind durch spektrometrische und spektroskopische Methoden aufgeklärt, die das Molekulargewicht und Strukturinformationen herstellen eine Vorlage der Verbindung synthetisiert werden. Bioassay-geführte Fraktionierung kann nachgeben, diverse Metaboliten und potenziell neuartige Pheromone mit einzigartigen chemischen Skelette, die wahrscheinlich nicht von den biosynthetischen Bahnen vorhergesagt werden.
Hier beschreiben wir die Bioassay-geführte Fraktionierung Protokoll zu isolieren und zu charakterisieren die Bioaktivität der männlichen Meerneunauge Sex Pheromon Verbindungen verwendet. Meerneunauge (Petromyzon Marinus) ist ein ideales vertebrate Modell Pheromon Kommunikation zu studieren, weil diese Fische verlassen sich stark auf die olfaktorische Detektion von chemischen Signale zu vermitteln ihre anadrome Lebensgeschichte, bestehend aus drei Phasen: Larven, Jugendliche und Erwachsene. Meerneunauge Larven bohren sich in das Sediment von Süßwasser-Streams, eine drastische Metamorphose zu unterziehen, und Jugendliche, die an einem See oder Meer, wo sie große Host Fische parasitieren, migrieren verwandeln. Nach dem ablösen von der Host-Fisch, migrieren die Erwachsenen wieder Laich Bäche, geleitet von den wandernden Pheromone freigegeben durch Stream-Resident Larven15,16,17,18,19 . Reife Männer zu den Laichgründen aufsteigen, lassen Sie ein Mehrkomponenten Sex Pheromone um Freunde zu gewinnen, zeitweise Laichen für etwa eine Woche und dann sterben15,20. Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone ist wichtig, weil eine Modulation der Pheromon-Kommunikations-System unter den Optionen als die invasiven Meer Neunaugen in der Laurentian Great Lakes21zu kontrollieren ist.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 und 02/17-031-00) genehmigt.
1. Erfassung und Gewinnung von Meerneunauge bedingt Wasser
- Ort geschlechtsreif männliche Meer Neunaugen (15-30 Tiere) in einem Tank geliefert mit 250 L kohlensäurehaltiges Lake Huron Wasser gepflegt bei 16-18 ° C.
- Sammeln Sie die männlich konditioniertes Wasser in jeder Nacht von Juni bis Juli.
Hinweis: Meer Neunaugen sterben natürlich nach dem laichen. Wenn ein Fisch steht kurz vor diesem Punkt in seinem Leben, mit einem frischen Reifen männlichen ersetzen. - Extrahieren Sie die konditionierte Wasser durch Festphasenextraktion.
- Einweichen Sie das Harz in Methanol für 4 h, bevor Sie in eine Spalte laden. Laden Sie das Harz in die Spalte, dann Pumpe 10 Liter Wasser durch die Säule um das organische Lösungsmittel zu entfernen.
- Übergeben Sie das klimatisierte Wasser aus dem Tank halten die Fische über das Pumpsystem, das oben in der Spalte. Das Wasser fließt durch ein Bett von 2 kg mäßig polaren Polymeren Ionenaustausch-Harz (z. B.., HP Amberlite XAD-7-Harz), enthalten in einer Reihe von vier 2,5-Liter-Glas-Spalten. Pflegen Sie Last Geschwindigkeiten zwischen 400 und 600 mL/6 min. eluieren Metaboliten mit 10 L Methanol, unmittelbar gefolgt von 5 L Aceton.
Achtung: Dieser Schritt verwendet Methanol und Aceton. Beide sind brennbar und giftig.
Hinweis: Die gepoolten Restwert bei-80 ° C bis weiterverarbeitet speicherbar.
- Reaktivieren Sie die Spalte nach 1 Woche der Bereicherung durch Waschen mit Wasser (ca. 10 L).
- Entfernen Sie das organische Lösungsmittel (die Mischung von Methanol und Wasser) und Ernten des Extrakts durch rotatorische Verdampfung für 5 h unter vermindertem Druck (unter 300 Mbar) bei 40 ° C. Konzentrieren sich die Wasserrückstände durch Einfrieren Trockner Lyophilisierung für 48 h bei-20 ° C bis trocken.
2. Isolierung der Bruchteil Pools mit Chromatographie
- Die Silica-Gel (230-400 Mesh) in der ersten mobilen Phase für 30 min. Transfer des Gels mit dem Lösungsmittel (Suspension) in eine Glassäule einweichen. Öffnen Sie das Ventil der Spalte, die die mobile Phase durchlaufen lassen. Lassen Sie das Silica Gel auszufällen und bilden eine Silica-Gel-Bett.
- Die Extrakte mit Silica-Gel (70-230 Mesh) mischen und über das Silica-Gel-Bett in der Flüssigchromatographie-Spalte laden. Eluieren sie mit einem Gefälle von 95 % Kchl3 (Chloroform) / MeOH (Methanol) zu 100 % MeOH, 2,5 L Gesamtvolumen. Der Eluent in einzelnen Fläschchen (je 10 ml) zu sammeln.
Achtung: Das Chloroform verwendet in diesem Schritt ist eine giftige Reagenz. - Die Bündelung von den Eluenten in 20 Fraktionen durch eine Dünnschicht-Chromatographie (TLC)-Analyse zu führen.
- Durchführen Sie der TLC-Experiment auf vorbeschichtete Silica-Gel-Platten, indem die Probe auf die Startlinie und Eintauchen der Startlinie der Platte in den Entwicklungsländern Lösungsmittel (Wählen Sie die Polarität durch das Verhältnis der Kchl3 in Methanol 100-0 %) in einem verschlossenen Glas Tank.
- Wählen Sie das Verhältnis von Lösungsmittel alle TLC Flecken mit einem Zurückbehaltungsrecht Faktor (Rf) von 0,3 bis hin zu entwickeln - 0,8.
- Nachdem das entwickelnde Lösungsmittel Endzeile erreicht hat, nehmen Sie die Platte aus dem Tank und warten Sie 10 Minuten für das Lösungsmittel verdunstet.
- Visualisieren Sie die Flecken zuerst unter UV-Licht bei 254 nm und dann Fleck Sie durch Besprühen mit einer sauren Methanol-Lösung von 5 % Anisaldehyde (20 μl) durch eine Chromatographie-Spritze und Heizung sie bei 85 ° C für 3 Minuten.
Hinweis: Die bunten Flecken auf die TLC Platte zeigen die wichtigste Komponente in der Fraktion. - Kombinieren Sie das Laufmittel 20 Fraktionen basierend auf die Volltonfarbe und die R-f -Ähnlichkeit der Hauptbestandteil.
- Konzentrieren Sie den Anteil an einen Rückstand durch rotatorische Verdampfung unter vermindertem Druck (300 Mbar nach die Eigenschaft von Lösungsmitteln) bei 40 ° C für ca. 30 min.
(3) Elektro-Olfactogram (EOG) Aufnahmen, duftende Brüche/Verbindungen zu identifizieren
- Borosilikatglas Kapillaren ziehen (Außendurchmesser: 1,5 mm; Innendurchmesser: 0,86 mm; Länge: 100 mm) mit einer Mikropipette Abzieher mit der Heizung auf 65 festgelegt.
- Punkten Sie und schneiden Sie die Öffnung an der Spitze der Kapillare mit einem diamantbestückte Glasschneider und füllen Sie ihn mit geschmolzenen 0,4 % Agar in 0,9 % Kochsalzlösung. Die Öffnung an der Spitze der Kapillare sollte etwa 10 µm im Durchmesser sein.
- Füllung der gezogenen Kapillaren Elektroden aus Schritte 3.1-3.2 und Solid-State-Elektroden-Halter mit Ag/AgCl-Pellets vorgefertigt (siehe Tabelle der Materialien) mit 3 M KCl mit einer Mikropipette.
Hinweis: Luftblasen in der Kapillare oder der Elektrodenhalter zu verdrängen. - Legen Sie die gezogenen Elektroden in den Elektrodenhalter.
- Bereiten Sie 100 mL 10-5 M L-Arginin in Holzkohle-gefiltertem Wasser aus einer 10-2 M L-Arginin Vorratslösung in entionisiertem Wasser (bei 4 ° C gelagert) in einem volumetrischen Kolben. Transfer von 20 mL 10-5 M L-Arginin zu einem Glasfläschchen.
- Bereiten Sie die Konzentration-Wirkungs-Kurve 10 mL 10-divisibel Verdünnungen der Bruchteil Pools aus Schritt 2.3 in Glasfläschchen. Bereiten Sie frische Verdünnungen täglich vor den Experimenten und innerhalb eines Tages zu verwenden. Setzen Sie die Glasfläschchen von gebrauchslösungen von L-Arginin und der Bruchteil Pool Verdünnungen in einem umlaufenden Wasserbad damit die Temperatur bis auf 8 ° c equilibrate
- Das Neunauge mit 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222; 100 mg/L) zu betäuben und mit einer sterilen Spritze mit einer intramuskulären Injektion von Gallamine Triethiodide (3 mg/kg Körpergewicht, in 0,9 % Kochsalzlösung) zu immobilisieren.
Hinweis: Eine ausreichende Tiefe der Narkose wird bestimmt, durch die Beobachtung keine Gill-Bewegung, die Unfähigkeit, eine aufrechte Körperhaltung und keine Saugleistung an den Seiten des Tanks mit ihrer mündlichen Scheibe. Um eine mikrobielle Kontamination vor und während der Operation zu minimieren, sterile Handschuhe tragen und die Dissektion Werkzeuge in 70 % igem Ethanol (V: V) in entionisiertem Wasser für mindestens 10 Minuten vor der Verwendung einweichen. - Richten Sie den narkotisierten Neunaugen in einem v-förmigen Stand und wickeln Sie es mit einem feuchten Papiertuch um Austrocknung zu verhindern.
Hinweis: Behindern Sie die Kieme Öffnungen nicht. - Legen Sie eine Tube belüftete Umlaufwasser, enthält 50 mg/L MS222 in der Mundhöhle, passen Sie die Durchflussmenge und sorgen dafür, dass Wasser über die Kieme Öffnungen um die Kiemen ständig bewässern beendet wird.
- Verwenden Sie ein steriles Skalpell und Pinzette [unter dem stereoskopische Mikroskop bei 1,25 X Vergrößerung (siehe Tabelle der Materialien)], 5 mm2 Teil der Haut auf der Oberfläche der olfaktorischen Kapsel um das olfaktorische Epithel aussetzen zu entfernen.
- Spülen Sie den Duftstoff Lieferung Schlauch mit gefiltertem Wasser und schließen Sie es an das Ventil montiert auf einem Mikromanipulator. Legen Sie das Duftstoff Lieferung Kapillarrohr in den olfaktorischen Epithel Hohlraum mit dem Mikromanipulator, um gefiltertes Wasser an den olfaktorischen Epithel um Austrocknung zu verhindern, bei der Verabreichung von Geruchsstoffen nicht zu liefern.
- Montieren Sie die Aufnahme und Referenz Elektroden auf die Mikromanipulatoren. Senken Sie die Bezugselektrode auf die äußere Haut in der Nähe der Naris. Das Mikroskop stereoskopische (1,25 X), niedriger der Aufnahme-Elektrode auf das riechepithel kaum berühren.
- Übertragen Sie die Aufnahme der Geruchsstoff Lieferung Röhre aus dem Hintergrund gefilterte Wasser auf 10-5 M-L-Arginin-Lösung.
- Schalten Sie den Computer, Verstärker (eingestellt auf DC-Modus), Filter und Digitizer. Mit Hilfe der Ventil-Treiber-Software Programmieren das Verfahren, einen 4 s Einzelimpuls der Geruchsstoff zu verwalten, durch Anklicken des Kästchens T1, T bis 4 einstellen s, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen des T2.
- In der Datenerfassungs-Software (siehe Tabelle der Materialien), den Erwerb Modus auf eine High-Speed-Oszilloskop festzulegen, klicken Sie auf das Play-Symbol und klicken Sie dann auf Start in der Ventil-Treiber den Geruchsstoff Impuls auslösen.
Hinweis: Der Datenerfassungs-Software zeichnet automatisch die differenzielle EOG Antwort Amplitude für 20 s (3 s, 4 s während der Geruchsstoff Puls und 13 s danach). Benutzen Sie der Mikromanipulator, um die Positionen der Aufnahme Elektrode, Bezugselektrode oder Duftstoff verabreichungsschlauch erhöhen das Signal-Rausch-Verhältnis mit einer maximale Reaktion auf L-Arginin-Standard und eine minimale Reaktion auf die Blindkontrolle (manövrieren gefiltertes Wasser). Boden des Verstärkers durch die Umstellung des AC-DC-Verstärker-Schalters auf GND beim Verschieben der Elektroden. - Die Aufnahme der Blindkontrolle, L-Arginin und dann die Geruchsstoffe in Schritt 3,6 von niedrigen zu hohen Konzentrationen mit einem Flush 2 min mit gefiltertem Wasser zwischen Anwendungen vorbereitet.
- Boden Sie nach der Aufnahme Antworten auf alle Geruchsstoffe getestet werden des Verstärkers und einfahren Sie vorsichtig der Elektroden und Geruchsstoff Lieferung Kapillarrohr. Nach den genehmigten institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) Methoden, bei Beendigung des Experiments EOG narkotisierten Neunauge mit einer Überdosis MS222 einschläfern (1 g/L).
Hinweis: Prüfen Sie erfolgreiche Euthanasie mit der Feststellung mangelnder Gill Bewegung und Takt für mindestens 5 min, gefolgt von bolzenschussmethode im Gehirn. - Analysieren und darstellen der Daten-Analyse-Software mit. Bestimmen Sie die Schwelle des Nachweises der Geruchsstoffe22 duftende Brüche zu identifizieren, die größer als die leere wassersteuerung Reaktionen hervorrufen. Die Bruch-Pools, die Konzentration abhängig olfaktorische Reaktionen hervorrufen, die anders sind als das Steuerelement leer Wasser werden dann in eine Verhaltens-Assay (Schritt 4) getestet.
4. zwei-Wahl Labyrinth Verhaltens Bioassay, verhaltensorientierte Brüche/Wirkstoffe zu identifizieren
- Die geschlechtsreifen weiblichen Meerneunauge im Release Käfig in das Labyrinth zu akklimatisieren (siehe ergänzende Abbildung1) 5 min. halten die Durchflussmenge des Flusswassers im Labyrinth
Hinweis: Das Labyrinth ist mit 2,7 m Länge, das Labyrinth in zwei Kanäle am vorgelagerten Ende trennen Raumteiler aus lackierten marine Grade Holz und 6,5 m Länge und 1,2 m in der Breite misst gebaut. Wasser wird in das Labyrinth vorübergehend umgeleitet. Die Wassertiefe sollte auf 0,19 m gehalten werden und die Geschwindigkeit bei 0,07 m/s ± 0,01 beibehalten werden sollte. - Lassen Sie das Meerneunauge und kumulative aufgewendete Zeit verbringt der Neunaugen in der experimentellen und Steuerkanal jedes enthaltenden Fluss Wasser für 10 Minuten.
Hinweis: Wenn das Meerneunauge fehlschlägt, geben die experimentelle und Steuern Kanal für mindestens 10 s während dieser Zeit 10 min am Ende des Prozesses, als Beweis der Inaktivität oder starke Seite Voreingenommenheit. - Wenden Sie den Test-Stimulus (d. h., eine vermeintliche Pheromon auf 10-12 M in 50 % Methanol/entionisiertem Wasser gelöst), der nach dem Zufallsprinzip zugewiesene experimentelle Kanal und das Fahrzeug (50 % Methanol/deionisiertes Wasser) das Steuerelement Kanal mit peristaltischen Pumpen zu konstanten Preisen von 200 mL/min für 5 Minuten.
Hinweis: Die Erkennung Grenzkonzentration des Test Stimulus wie mit den Elektro-Olfactogram-Aufnahmen bestimmt sollte als die Ausgangskonzentration für Verhaltens-Test verwendet werden. - Anwenden der Test-Reiz und das Fahrzeug für eine zusätzliche 10 min und kumulative aufgewendete Zeit der Neunaugen verbringt in der experimentellen und Steuerkanal.
- Spülen Sie das Labyrinth mit Wasser für 10 min vor dem Start der nächsten Prüfung. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.4 mit mindestens 7 Neunaugen, wenn genügend Test Impulse zur Verfügung steht.
- Berechnen Sie einen Index von Präferenz22 für jeden Versuch zu und bewerten Sie die Bedeutung mit einem Wilcoxon-unterzeichnet-Rank-Test.
Hinweis: Die Ergebnisse des Index in eine einzelne Zahl, die entweder positiv oder negativ sein kann. Ein positiver Wert für den Index des Präferenz zeigt Attraktion, während ein negativer Wert für den Index des Präferenz Indikationen Abstoßung. Wenn der Index der Präferenz signifikant verschieden von NULL ist, gilt der Anteil aktiv.
Hier,
Bc = die Verweildauer der Test Neunaugen in der Steuerkanal vor der Duftstoff-Anwendung
Be = die Zeit in der experimentellen Kanal vor der Duftstoff-Anwendung
Ac = die Zeit in der Steuerkanal nach der Duftstoff-Anwendung und
Ae = die Zeit in der experimentellen Kanal nach dem Duftstoff auftragen.
(5) chromatographische Isolation von reinen Verbindungen aus aktiven Brüche
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.4 mit den Bruch-Pools, die olfaktorische Antworten (Schritt 3) induzieren und entlocken Sie Verhaltensreaktionen (Schritt 4) zu.
- Weiter zu reinigen Sie die aktiven Fraktionen in Verbindungen mit Größe-Ausschluss-Chromatographie mit einer Sephadex LH-20 Spalte.
- Vorbereitung die Probe in 0,5 mL in der Anfangsphase mobile [Kchl3- MeOH (1:1) oder MeOH 100 %], laden Sie in die entsprechende Spalte ein Kchl3- MeOH (1:1) Spalte und dann eine Spalte MeOH (100 %) und eluieren sie um die Verbindungen zu erzielen.
(6) Strukturaufklärung einer reinen Verbindung mit Massenspektrometrie (MS) und Kernspinresonanz (NMR)
- Auflösen und die gereinigte Verbindung in der ersten mobilen Phase (in der Regel, Methanol, Wasser, 1:1, V: V) der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) zu einer 10 μl Lösung von ca. 1 μg/mL zu verdünnen.
- Übertragen der Beispiellösung auf HPLC Vials und setzte sie in den Autosampler HPLC. Injizieren der Probe (10 μl) in der Elektrospray-Ionisation Massenspektrometrie (ESIMS) und notieren Sie die hochauflösende Electrospray Ionisierung Massenspektrometrie (HRESIMS) Spektren einer Chromatographie Massenspektrometer23.
- Vorhersagen der Summenformel laut Datenbank in der Massenspektrometer-Software (siehe Tabelle der Materialien)24.
- Öffnen Sie das Chromatogramm der injizierten Probe und erhalten Sie seine Massenspektrum durch Auswahl den chromatographischen Gipfel zu.
- Geben Sie die gemessenen Masse Ion (m/Z) Wert (4 Dezimalstellen) in elementare Zusammensetzung im Modul " Werkzeug ". Legen Sie die Toleranz-Parameter auf PPM < 5.
- Passen Sie die Symbol-Parameter um die Elementzusammensetzung der gemessenen Moleküls zu passen. Die Software erzeugt eine Vorhersage der Summenformel anhand der einzelnen Masse Analyse.
- Wählen Sie die deuterierte Lösungsmittel (600 μL, CH3OH -d4 oder DMSO -d6) gemäß dem Protokoll25 , die Muster aufzulösen.
- Vollständig auflösen der Probe in den ausgewählten deuterierte Lösungsmittel zu einer Lösung mit einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 mg/mL. Übertragen Sie die Beispiellösung in ein NMR-Röhrchen die 1D (1H, 13C) aufzeichnen und 2D NMR [1H -1H Korrelation Spektroskopie (GEMÜTLICHE), Heteronuclear Quantum Kohärenz (HSQC-), Heteronuclear single mehrere Bond Korrelation (HMBC)] Spektren auf einem 900 MHz NMR-Spektrometer-26.
- Ort der NMR-Röhrchen mit der Probe in der Spinner-Turbine. Verwenden Sie die tiefenbegrenzer um sicherzustellen, dass die Probe Höhe in der Mitte des messfensters ist. Öffnen Sie die NMR-Software (siehe Tabelle der Materialien) und heben Sie klicken um die Probe in den Magneten zu ändern.
Hinweis: Halten Sie eine Hand über der Oberseite des Magneten, die Gas aus der Spitze des Magneten zu fühlen. Zur gleichen Zeit sollte ein pfeifendes Geräusch hörbar sein. - Sanft legen Sie die Probe auf das Luftkissen auf den Magneten und drücken Sie erneut, um die Probe in der NMR-Magneten hinabsteigen auf heben .
Hinweis: Achten Sie auf ein "Klick" Geräusch um anzugeben, dass die Probe in der richtigen Position ist. - Erstellen Sie ein neues Dataset und laden Sie die Default-Parameter von der NMR-Gerät empfohlen (siehe Tabelle der Materialien).
- Geben Sie "Sperre", die automatische Verriegelung Prozedur aufzurufen, und wählen das Lösungsmittel auf der schnellen Seite.
- Für die Feinabstimmung, im manipulieren Panel, passen Sie die Schaltfläche in der Unlock -Modell, stellen Sie den Cursor im Feld manipulieren und den Magneten wieder zu sperren.
- Stellen Sie auf der Eingabeaufforderung Atma Seite den Parameter im Bedienfeld "manipulieren" tuning-Verfahren, was einige Minuten dauern kann. Warten Sie, bis die Abstimmung abgeschlossen ist, um den Vorgang fortzusetzen.
- Starten Sie die automatische Shimmen Routine durch Eingabe von "Topshim" in der Eingabeaufforderung. Warten Sie, bis die Shims abgeschlossen ist, um den Vorgang fortzusetzen.
- Typ "Rga" Automatische festzulegende empfangen Gewinn Anpassungen, dann Typ "d1", legen Sie die Verzögerung zwischen den Pulsen, dann Typ "Zg" die Übernahme starten und warten, bis die Übernahme beendet.
- Geben Sie "Ef" oder "Efp" die Daten zu verarbeiten und geben Sie dann "Apk" für automatische Ausstieg. Verarbeiten Sie die Daten über die NMR-Processing-Software.
- Die chemische Struktur von einer Interpretation von NMR-Daten-Analyse zu erhellen.
- Zählen Sie die Kohlenstoff-Signale in den 13C-NMR-Spektrum. Wählen Sie die übereinstimmenden Molekulare Formel aus dem prognostizierten Ergebnis in der hochauflösenden Massenspektrometrie (HR-MS).
- Integrieren Sie die Proton-Signale in der 1H-NMR-Spektrum zu, und weisen Sie die Konnektivität von der Kohlenstoff - und Proton-basierte auf die Signale des HSQC-Spektrums.
- Weisen Sie die Konnektivität das Kohlenstoffskelett anhand der Korrelationen in der 1H -1H gemütlich und HMBC-Spektrum.
- Weisen Sie versuchsweise die chemische Struktur, basierend auf der Struktur Begründung27. Suchen Sie die vorläufige Struktur in der chemischen Struktur Datenbanken. Vergleichen Sie die vorläufige Struktur mit der Analoga in Referenzen.
- Weisen Sie die relative Konfiguration mit dem Nuclear Overhauser Effekt Spektroskopie (NOESY) Spektrum.
Hinweis: Da die Identitätseigenschaften Enantiomeren Spektrometrie und spektroskopische Methoden angezeigt identisch sind, die absolute Konfiguration einige Verbindungen, insbesondere mit Alkohol 2' und 2'-NH2, muss mit ermittelt werden eine Derivatisierung Reaktion. Nach der Reaktion Derivatisierung erleichtern die Unterschiede auf den Spektren angegeben die eindeutige Zuordnung der absoluten Konfigurationen von den meisten Verbindungen28.
7. EOG und Bioassay reinen Verbindungen zu bestätigen sind Geruchs- und verhaltensorientierte aktiv
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.5.
- Vorbereitung der Konzentration-Wirkungs-Kurve 10-divisibel Verdünnungen der reinen Verbindungen von 10-6 M - 10-13 M von einer 10-3 M Pheromon Vorratslösung in 50 % Methanol/Wasser gespeichert bei-20 ° C basierend auf das Molekulargewicht bestimmt 10 mL Schritt 6.2. Setzen Sie die Glasfläschchen mit der gebrauchslösungen von L-Arginin und die reinen Verbindungen in einem umlaufenden Wasserbad damit die Temperatur bis auf 8 ° c equilibrate
- Wiederholen Sie die Schritte 3,7-3.18.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.2.
- Der nach dem Zufallsprinzip zugewiesene experimentelle Kanal und das Fahrzeug (50 % Methanol/deionisiertes Wasser), der Steuerkanal mit einer peristaltischen Pumpe zu konstanten Preisen von 200 mL/min für 5 min zuweisen Sie reine Verbindung bei der EOG-Erkennung-Grenzkonzentration.
- Wiederholen Sie die Schritte 4,4-4,6.
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Representative Results
Ein Diagramm einer Zusammenfassung des Protokolls der Bioassay-geführte Fraktionierung beschriebenen Schritte ist in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll erfolgt in Schritten zu isolieren und zu charakterisieren, die Struktur, die olfaktorische Potenz und Verhaltensstörungen Tätigkeitsbereich 5 vermeintliche Meerneunauge Pheromone (Abbildung 2). Mit der Masse spektrometrische und NMR-Daten (Abbildung 3 und Abbildung 4), wurden die Strukturen der Petromyzene A-B und Petromyzone A-C aus dem Wasser mit Reifen männlichen Meer Neunaugen22,29konditioniert aufgeklärt.
Unsere repräsentativen Daten aus der EOG-Aufnahmen (Abbildung 5) belegen, dass Petromyzene A-B und Petromyzone A-C alle potenten Geruchsstoffe waren, die stimuliert die Erwachsenen Meerneunauge olfaktorischen Epithel und hatte niedrige Grenzwerte der Erkennung (Abbildung 6) . Besonders hervorzuheben der EOG-Aufnahmen benötigen eine richtige Platzierung der Aufnahme-Elektrode auf der Oberfläche des olfaktorischen Epithel im Verhältnis zu den Reiz Lieferung Schlauch ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis für zuverlässige Geruchsstoff zur Folge Antwort Aufnahmen ( Abbildung 5 b). Wenn dieser wichtige Schritt nicht befolgt wird, wird es schwierig, das Signal induziert durch den Geruchsstoff unter die hohen Rauschen zu erkennen sein. Die rückläufige Durchbiegung der EOG Ablaufverfolgung nach der Geruchsstoff Exposition ist ein negatives Potenzial. Ein gutes EOG-Signal sollte eine Duftstoff-Verwaltung, wodurch eine schnelle und scharfe Reaktion gefolgt von einer Erholung der Grundlinie zeigen. Die olfaktorischen Antworten auf die vermeintliche Pheromone wurden auch normiert auf die Antworten von 10-5 M L-Arginin, eine Positivkontrolle Geruchsstoff in das Meerneunauge, während das Experiment um die Integrität der Aufnahmen getestet wurde beibehalten.
In der zwei-Wahl Labyrinth Verhaltens Assays (Abb. 7A) Eisprung weibliche Meer Neunaugen wurden angezogen, Petromyzone A, Petromyzene A und Petromyzene B, und von Petromyzone erschien C. Ovulated Weibchen von Petromyzone B zurückgeschlagen werden zurückgeschlagen; die Verhaltensreaktion war jedoch nicht signifikanten (Abb. 7 b). Eine höhere Fallzahl war nicht möglich wegen der begrenzten Zahl von Petromyzone B. Um die Verhaltensreaktion auf einen Geruchsstoff richtig einschätzen zu können, ist es wichtig, die Vorbehandlung Vorspannung für die Kontrolle und experimentelle Kanal jedes Neunaugen aufzeichnen.
Abbildung 1: Flussdiagramm der Bioassay-geführte Fraktionierung von Pheromonen. Diese Zahl ist aus Abbildung 2 in Li, Buchinger und Li adaptiert30. Die Felder zeigen das resultierende chemische Produkt aus der Technik im Oval angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: die chemischen Strukturen der Petromyzene A-B und Petromyzone A-C. Diese Figur ist aus den Abbildungen 1 in Li Et Al. geändert. 22 , 29. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3:1-NMR-Spektren. 1D-NMR-Spektren von Petromyzene A: (A) das Spektrum 1H NMR (900 MHz) und (B) die 13C-NMR (225 MHz) Spektrum. Diese Zahl ist von den unterstützenden Informationen in Li Et al. 29. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: 2D NMR-Spektren. 2D NMR-Spektren der Petromyzene A: (A) das HSQC-Spektrum, (B) 1H -1H-COSY Spektrum, (C) die HMBC-Spektrum und (D) die NOESY-Spektrum. Diese Zahl ist von den unterstützenden Informationen in Li Et al. 29. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Elektro-Olfactogram (EOG) Vorbereitung und Vertreter-Spur-Aufnahmen aufzeichnen. (A) Dies ist eine EOG-Vorbereitung zeigt der exponierten Meerneunauge olfaktorischen Epithel mit der Aufnahme-Elektrode, die Bezugselektrode, Geruchsstoff Lieferung Schlauch und sauerstoffreiches Wasser mit der Narkose. (B) dieses Panel zeigt repräsentative Spur Aufnahmen zeigen gut (oben) oder schlecht (unten) Signal-Rausch-Verhältnis. Ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis ist für zuverlässige Geruchsstoff Antworten Aufnahmen notwendig. Die rückläufige Durchbiegung der EOG Ablaufverfolgung nach der Geruchsstoff Exposition ist ein negatives Potenzial. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: ein halb logarithmischen Plot des Elektro-Olfactogram (EOG) Konzentration-Wirkungs-Kurven. Petromyzone A-C und Petromyzene A und B waren zu den Erwachsenen Meerneunauge riechepithel stimulierende und niedrigen detektionsschwellen. Die Daten werden als die mittlere normalisierte EOG Amplitude ± S.E.M dargestellt Die Stichprobengröße waren wie folgt: Petromyzone A, Petromyzene A und Petromyzene B (n = 7), und Petromyzone B und Petromyzone C (n = 5). Der Einschub ist eine erweiterte Ansicht der EOG Antworten zeigen Reaktion Schwelle Konzentrationen. Diese Zahl wurde von Abbildung 3 in Li Et Al. modifiziert 22 und Abbildung 4 in Li Et al. 29. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: einen Schaltplan und die Ergebnisse des zwei-Wahl Labyrinths verwendet, um die Verhaltensreaktionen der Eisprung weibliche Meer Neunaugen, Geruchsstoffe auszuwerten. (A) der Pfeil gibt die Richtung des Wasserflusses (0,07 m s-1 ± 0,01). Die Kreise repräsentieren die Geruchsstoff Verwaltung Punkte. Die kleinen gestrichelten Linien repräsentieren feinmaschigen verwendet, um die Bewegung der das Meerneunauge zu den Confines des Labyrinths zu beschränken. Die großen gestrichelten Linien repräsentieren Flow Boards verwendet, Wasser Turbulenzen zu reduzieren. Das graue Rechteck repräsentiert den Freigabe-Käfig. Die Maßstabsleiste = 1 m. Diese Zahl ist aus Abbildung S1 in Li Et al. 29. (B) Weibchen waren angezogen, Petromyzone A, Petromyzene A und Petromyzene B. Der Zeitaufwand der Neunaugen in jedem Kanal des Labyrinths vor und nach die Geruchsstoff Exposition (10-12 M) verwendet wurde, um einen Index der Vorzug zu beurteilen, seine Verhaltensreaktion auf den Geruchsstoff zu berechnen. Ein positiver Wert für den Index des Präferenz zeigt Attraktion. Der Stichprobenumfang n, wird außerhalb der Klammer gemeldet, und die Zahl in Klammern gibt die Anzahl der Weibchen über Versuche, die mehr in die experimentelle Kanal im Vergleich zu der Kontrolle Zeit. Die Daten werden dargestellt, wie meine ± S.E.M (* p < 0,05; Wilcoxon-unterzeichnet-Rank-Test) die verhaltensbezogene Einstellung vor und nach der Geruchsstoff zu vergleichen. Diese Zahl wurde aus Abbildung 4 in Li Et Al. modifiziert 22 und Abbildung 5 in Li Et al. 29. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung1: ein Foto des Labyrinths. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Fische leben in einer chemischen Welt voller Verbindungen noch identifiziert werden. Bioassay-geführte Fraktionierung bewährt wesentlich zu identifizieren und zu charakterisieren, bioaktive Moleküle, die viele chemische Interaktionen, wie bei Masu-Lachs31, Asiatische Elefanten32und Meer Neunaugen33zu vermitteln, 34,35. Bioassay-geführte Fraktionierung ist ein effektives Vorgehen genau verfolgen und Pinpoint, die bioaktiven Verbindungen, die vom Ausgangspunkt, der gereinigte Wirkstoff extrahieren. Mithilfe dieses Ansatzes können die identifizierten bioaktiven Verbindungen, die einen Verbindung mit einem einzigartigen chemischen Skelett Roman enthalten, die unwahrscheinlich, dass aus den bekannten biosynthetischen Bahnen vorhergesagt werden kann.
EOG-Aufnahmen werden durchgeführt, um festzustellen, welche Brüche oder Verbindungen olfaktorische Reaktionen hervorrufen. Mehrere technische Überlegungen sind unerlässlich für die olfaktorischen Antworten auf die vermeintliche Pheromone mit EOG Aufnahmen genau zu messen. Zunächst nach den institutionellen Animal Care und Use Committee genehmigt Verfahren, müssen die Fische tief mit 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) betäubt und immobilisiert mit eine intramuskuläre Injektion von Gallamine Triethiodide. Die Aufnahme-Elektrode erkennt jede Bewegung der Kiemen und Herzschlag aufgrund einer unzureichenden Immobilisierung, was kann eine Quelle für elektrische Störungen. Zweitens sollte das olfaktorische Epithel sofort Holzkohle-gefiltertem Wasser nach der Dissektion um Austrocknung zu verhindern ausgesetzt werden. Anpassung der Standort der Aufnahme und Referenz Elektrode mit der Mikromanipulatoren, die Erdung und der Geruchsstoff Lieferung Schlauch kann helfen, die Antwort auf die Positivkontrolle Geruchsstoff zu maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der Reaktion auf die Blindkontrolle ( gefiltertes Wasser). Drittens muss nach der Identifizierung eines sensiblen Aufnahmeort in der olfaktorischen Epithel, Datensatz aus einer ähnlichen Position auf die Lamellen Variante zu minimieren. Um konsequent von einer ähnlichen Lage aufzunehmen, halten Sie den Tank und die v-förmige Kunststoff-Ständer hält die Fische, das Mikroskop, der Geruchsstoff Lieferung Schlauch und die Mikromanipulatoren in der gleichen Position. Die Narkose Röhre muss in die Fische Mundhöhle bleiben, für die Dauer des Experiments um sicherzustellen, dass es betäubt bleibt. Die Platzierung innerhalb der Mundhöhle und der Durchflussmenge des Betäubungsmittels kann jedoch geändert werden, wenn die Aufnahme-Elektrode ist die Bewegung des Wassers, was zu einer sprunghaften Basislinie des elektrischen Signals erkennen.
Das Design des Verhaltens Assays sollte auf der Verhaltensökologie der Proband und die Fragestellung von Interesse zugeschnitten sein. Zwei-Wahl Labyrinth Verhaltens Assays werden verwendet, um festzustellen, ob eines der duftenden Fraktionen auch verhaltensorientierte aktiv sind. Da gereinigte Verbindungen oft nur in sehr kleinen Mengen verfügbar sind, ist das Labyrinth ein positiven Verhaltens Bioassay im Vergleich zu den Strom durch eine geringere Entlastung. Wir waren interessiert bei der Beurteilung der in der Nähe von Quelle Präferenz der vermeintlichen Sexualpheromone veröffentlicht von Reifen Männern vorhergesagt, Reife weibliche Kumpels in unmittelbarer Nähe zu gewinnen und bewahren Sie sie auf ein Nest zum Laichen. Der Verhaltens-Test wurde entwickelt, um die natürlichen Gegebenheiten einer ovulated weibliche Wahl zwischen die Geruchsstoffe der Reife Männchen zu replizieren. Daher war es für Eisprung Weibchen als der Proband in unseren Experimenten Verhalten zu testen. Je nach den Geruchsstoff getestet, möglicherweise jedoch anderen Probanden (d. h., andere Lebensphase oder Männchen) besser geeignet. Variationen über die Dimensionen des zwei-Wahl Labyrinths ggf. abhängig von der Größe der Proband und den vorhergesagten aktiven Raum die Pheromone (d. h., in der Nähe von Quelle vs. Langstrecke)36. Ebenso sind Verhaltensreaktionen oft Konzentration abhängig. Wenn eine Verhaltensreaktion nicht beachtet wird, wenn die vermeintliche Pheromone auf die Erkennung Grenzkonzentration bestimmt mit EOG angewendet wird, sollte die Konzentration der Pheromone angepasst werden. Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass auch wenn eine Verbindung eine potente Geruchsstoff ist, es nicht unbedingt eine erhebliche Verhaltensstörungen Präferenz auslösen kann. Letztlich sollte die Verhaltensreaktionen beobachtet im Labyrinth in einem Feld Einstellung mit synthetische Verbindung zu bestätigen, die Funktion des vermeintlichen Pheromon überprüft werden.
Eine erhebliche Einschränkung der Bioassay-geführte Fraktionierung ist die sequentielle Prüfung der einzelnen Fraktionen oder Verbindungen in einem Bioassay (EOG oder Verhalten). Bisherige Arbeit ergab Insekt Sexualpheromone sind in der Regel Mischungen aus mehreren Komponenten, um bestimmte Kennzahlen37 diese Funktion unabhängig als Komponenten38 oder synergistisch als verbindet39 induzieren die entsprechenden Antworten in Artgenossen. Daher können Verbindungen, die nur aktiv, wenn Sie in bestimmten Mischungen sind mit Bioassay-geführte Fraktionierung übersehen werden, weil sie kombinatorische Tests bestätigen die Bioaktivität erfordern. Andere Einschränkungen der Bioassay-geführte Fraktionierung umfassen: 1) eine große Menge an Ausgangsmaterial ist notwendig, eine ausreichende Menge für die Strukturanalyse, EOG und Verhaltensstörungen Assays; (2) der Prozess ist aufgrund der iterative Prozess zeitaufwendig; und 3) winzige oder instabile Verbindungen sind unwahrscheinlich erkannt werden. Überwindung der technischen Einschränkungen der Bioassay-geführte Fraktionierung kann in Zukunft einen hybridisierten Ansatz Bioassay-geführte Fraktionierung und Metabolomik erfordern. Mit einem hybridisierten Ansatz, Pheromon additive oder synergistische Effekte sind eher erkennbar13 und instabile Verbindungen sind eher erkannt werden.
Die beschriebenen Bioassay-geführte Fraktionierung Prozess ist speziell für die Identifikation von Meerneunauge Pheromone. Jedoch chemische Kommunikation ist allgegenwärtig im Tierreich1 und dieser Prozess kann leicht angepasst werden, um die Pheromone in einer breiten Palette von Taxa charakterisieren. Pheromon-Identifizierung und Charakterisierung sind wichtig, weil Pheromone Verhaltensreaktionen resultierenden in der Steuerung der invasiven Arten oder bei der Wiederherstellung der gefährdet heimische Arten modulieren angewendet werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken der US geologischen Umfrage Hammond Bay biologische Station für die Nutzung ihrer Forschung Einrichtungen und das Personal der US Fish and Wildlife Service und Fischerei und Ozeane Kanada für die Bereitstellung Meer Neunaugen. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der Great Lakes-Fischerei-Kommission Weiming Li und Ke Li unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
- Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
- Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
- Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
- Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
- Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
- Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , Springer Science & Business Media. (2013).
- Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
- Stacey, N., Sorensen, P. Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , Elsevier Inc. (2011).
- Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
- Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
- Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
- Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
- Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
- Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
- Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
- Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
- Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour? Animal Behaviour. 78, (2009).
- Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
- Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).
- Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
- Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
- Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692 (2007).
- Kaiser, B., Wright, A. Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , BRUKER. Madison, WI. (2008).
- Breitmaier, E., Sinnema, A. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).
- Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
- Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
- Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , In press (2018).
- Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
- Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
- Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
- Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
- Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
- De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
- De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
- Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
- Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).
