Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera och karakterisera strukturen, lukt potens och beteendemässiga svar av förmodad pheromone föreningar av havet nejonöga.
Abstract
Bioassay-guidad fraktionering är en iterativ metod som använder resultaten av fysiologiska och beteendemässiga bioassays för att vägleda isolering och identifiering av en aktiv feromon förening. Denna metod har resulterat i framgångsrika karakterisering av de kemiska signalerna som fungerar som feromoner i en mängd olika djurarter. Havet nejonöga lita på luktsinnets funktion att upptäcka feromoner som förmedlar beteendemässiga eller fysiologiska svar. Vi använder denna kunskap om fisk biologi att posit funktioner av förmodad feromoner och vägleda isolering och identifiering av aktiva feromon komponenter. Kromatografi används för att extrahera, koncentrera och separata föreningar från konditionerade vattnet. Electro-olfactogram (EOG) inspelningar genomförs för att avgöra vilka fraktioner framkalla olfactory svaren. Två-val labyrint beteendemässiga analyser används sedan för att avgöra om någon av de illaluktande fraktionerna är också behaviorally aktiva och framkalla en preferens. Spektrometriska och spektroskopiska metoder ge molekylvikten och strukturell information att hjälpa till med struktur förtydligandet. Bioaktiviteten av de rena föreningarna bekräftas med EOG och beteendemässiga analyser. Beteendemässiga Svaren observerats i labyrinten bör slutligen valideras i fältet inställningen att bekräfta deras funktion i en naturlig bäck inställning. Dessa bioassays spelar en dubbel roll för att 1) styra processen fraktionering och (2) bekräfta och ytterligare definiera bioaktiviteten av isolerade komponenter. Här, rapportera vi representativa resultaten av en havet nejonöga feromon identifiering som exemplifierar nyttan av metoden bioassay-guidad fraktionering. Identifiering av havet nejonöga feromoner är särskilt viktigt eftersom en modulering av dess feromon kommunikationssystem är bland de alternativ som anses styra den invasiva havet nejonöga i Laurentian stora sjöarna. Denna metod kan lätt anpassas för att karakterisera den kemiska kommunikationen i ett brett spektrum av taxa och belysa vattenburna kemisk ekologi.
Introduction
Feromoner är specifika kemiska signaler som släpptes av individer som hjälpa dem i att hitta födokällor, upptäcka rovdjur och medla sociala interaktioner artfränder1. Feromon kommunikationen i insekter har varit studerade2; dock har kemiska identifiering och biologiska funktionen av vattenlevande ryggradsdjur feromoner inte studerats så ingående. Kunskap om identitet och funktion av de feromoner som släppt kan användas för att underlätta indrivningen av hotade arter3,4 eller kontroll pest arter5,6. Tillämpningen av dessa tekniker kräver isolering och karakterisering av bioaktiva feromon komponenter.
Feromon identifiering är en gren av naturlig produkt kemi. Framsteg i feromon forskning har varit delvis begränsade pågrund av feromon molekylerna själva. Feromoner är ofta instabila och utgivna i små mängder, och endast ett fåtal provtagning tekniker finns för att detektera minuten mängder flyktiga7,8 eller vattenlösliga föreningar9. Metoder att identifiera feromoner inkluderar 1) en riktad screening av kända föreningar, 2) metabolomik och 3) bioassay-guidad fraktionering. En riktad screeningtester av kända föreningar och kommersiellt tillgängliga metaboliska biprodukter av fysiologiska processer hypotes om för att fungera som feromoner. Detta tillvägagångssätt är begränsande eftersom forskare kan bara testa kända och tillgängliga föreningar. Dock har det resulterat i framgångsrika identifiering av könshormoner i goldfish som fungerar som feromoner10,11,12. Metabolomik är en andra feromon identifiering metod som skiljer potentiella småmolekylära metaboliska produkter inom ett biologiskt system13. En jämförelse mellan två grupper (dvs.en aktiv kontra inaktiva utdrag) metaboliska profiler möjliggör identifiering av en potentiell metabola profilen från som metaboliten renas, strukturen är klarlagd, och den bioaktivitet är bekräftade14. Additiva eller synergistiska effekter av komplexa formuleringar av särskilda blandningar är mer benägna att upptäckas med metabolomik eftersom metaboliter betraktas tillsammans i stället för som en serie av fraktioner13. Ännu, genomförandet av metabolomik beroende av tillgången på syntetiska referenser eftersom resulterande data inte underlättar förtydligandet av nya strukturer.
Bioassay-guidad fraktionering är en integrerad, iterativ metod som sträcker sig över två fält: kemi och biologi. Denna strategi använder resultaten av fysiologiska och beteendemässiga bioassays för att vägleda isolering och identifiering av en aktiv feromon förening. En rå extrakt är fractionated av en kemisk egenskap (dvs, molekylstorlek, polaritet, etc.) och testade med electro-olfactogram (EOG) inspelningar och/eller i en bioassay. De bioaktiva komponenterna är sållas bort genom att upprepa dessa steg fraktionering och EOGs eller bioassays. Strukturerna av ren aktiva föreningar belyses av spektrometriska och spektroskopiska metoder, som ger molekylvikten och strukturell information att producera en mall av föreningen ska är synthesizeds. Bioassay-guidad fraktionering kan ge olika metaboliter och potentiellt roman feromoner med unika kemiska skelett som sannolikt förutsägas från den biosyntetiska vägar.
Här beskriver vi bioassay-guidad fraktionering protokollet som används för att isolera och karakterisera bioaktiviteten av manliga havet nejonöga kön pheromone föreningar. Den havet nejonöga (Petromyzon marinus) är en vertebrate idealmodell att studera feromon kommunikation eftersom dessa fiskar är starkt beroende av luktsinnet detektion av kemiska ledtrådar att medla deras anadroma liv historia består av tre olika faser: larver, ungdomsbrottslighet och vuxen. Havet nejonöga larverna gräver ner sig i sediment av sötvatten strömmar, genomgå en drastisk metamorfos och omvandla till ungfisk som migrerar till en sjö eller havet där de snylta stora värd fisk. Efter demontering från värd fisken, migrera vuxna tillbaka till lekbeståndets bäckar, vägledda av de flyttande feromoner som släpptes av stream-resident larver15,16,17,18,19 . Mogna män stiga upp till lekområden, släppa en multi-Component kön feromoner för att locka kompisar, ibland leka för ungefär en vecka och sedan dör15,20. Identifiering av havet nejonöga feromoner är viktigt eftersom en modulering av feromon kommunikationssystem är bland de alternativ som anses styra invasiva havet nejonöga i Laurentian stora sjöarna21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén av Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 och 02/17-031-00).
1. insamling och utvinning av havet nejonöga luftkonditionerade vatten
- Plats könsmogna manliga havet nejonöga (15-30 djur) i en tank som medföljer 250 L kolsyrat Lake Huron vatten hålls 16-18 ° C.
- Samla det manliga-villkorade vattnet hela varje natt från juni till juli.
Obs: havet nejonöga naturligt dör efter leken. Om en fisk närmar sig denna punkt i sitt liv, ersätta den med en fräsch mogen hane. - Extrahera konditionerade vattnet genom fasta fasen extraktion.
- Blötlägg kådan i metanol för 4 h innan du laddar det i en kolumn. Läsa in kådan i kolumnen och sedan pumpa 10 L vatten genom kolonnen för att eliminera det organiskt lösningsmedlet.
- Passera konditionerade vattnet från tanken håller den fisk via pumpsystemets överst i kolumnen. Passerar vattnet genom en bädd av 2 kg av måttligt polar polymera-jonbytarharts (e.g., Amberlite XAD-7 HP kåda), som ingår i en serie av fyra 2,5 L-kapacitet glas kolumner. Upprätthålla Last hastigheter mellan 400 och 600 mL/6 min. eluera metaboliter med 10 L metanol omedelbart följt av 5 L aceton.
Varning: Det här steget använder metanol och aceton. Båda är brandfarliga och giftiga.
Obs: Poolade återstående kan lagras vid-80 ° C tills bearbetas vidare.
- Återaktivera kolumnen efter 1 vecka av berikning genom tvättning med vatten (ungefär 10 L).
- Ta bort organiska lösningsmedel (en blandning av metanol och vatten) och skörda extraktet genom roterande avdunstning i 5 h under reducerat tryck (under 300 mbar) vid 40 ° C. Koncentrera sig vatten återstoden av frysning torktumlare frystorka den för 48 h vid-20 ° C tills de är torra.
2. isolering av bråkdel pooler med kromatografi
- Blötlägg kiselgel (230-400 mesh) i den första mobila fasen för 30 min. Transfer gelen med spädningsvätskan (suspension) en glaskolonn. Öppna ventilen i kolumnen för att tillåta den mobila fasen gå igenom. Tillåta kiselgel att fällningen och bilda en kiselgel säng.
- Blanda extrakt med kiselgel (70-230 mesh) och läsa in dem i kolumnen vätskekromatografi över kiselgel sängen. Eluera dem med en gradient från 95% CHCl3 (kloroform) / MeOH (metanol) till 100% MeOH, 2,5 L i total volym. Samla eluenten i injektionsflaskor (10 ml).
Varning: Den kloroform som används i detta steg är en giftig reagens. - Guide en sammanslagning av eluenter till 20 fraktioner av ett tunt lager kromatografi (TLC) analys.
- Utföra TLC experiment på pre belagda kiselgel plattor genom att tillämpa provet på startlinjen och doppa startlinjen av plattan i de framkallande lösningsmedel (välja polariteten av förhållandet mellan CHCl3 att metanol från 100-0%) i ett förseglat glas tank.
- Välj förhållandet att utveckla vätska att göra alla TLC fläckar med bibehållande faktor (Rf) sträcker sig från 0,3 - 0,8.
- Efter att utveckla vätskan når slutet linje, ta plattan ur tanken och vänta 10 min för lösningsmedlet avdunsta.
- Visualisera fläckarna först under UV-ljus vid 254 nm och sedan fläcken dem genom spraya dem med sura metanol lösning av 5% anisaldehyde (20 μL) av en kromatografi spruta och värma dem vid 85 ° C under 3 minuter.
Obs: De färgglada fläckarna på TLC plattan indikerar den viktigaste komponenten i fraktionen. - Kombinera eluenten till 20 fraktioner baserat på dekorfärgen och Rf likheten av den viktigaste komponenten.
- Koncentrera sig fraktionen till rester av roterande avdunstning under reducerat tryck (300 mbar enligt egenskapen av lösningsmedel) vid 40 ° C i ca 30 min.
3. Electro-olfactogram (EOG) inspelningar att identifiera illaluktande fraktioner/föreningar
- Dra borosilikatglas kapillärer (yttre diameter: 1,5 mm, innerdiameter: 0,86 mm; längd: 100 mm) med en mikropipett avdragare med värmare inställd på 65.
- Poäng och skär öppningen på spetsen av kapillären med en diamantbestyckade glas fräs och fyll den med smält 0,4% agar i 0,9% koksaltlösning. Öppningen på spetsen av kapillären bör vara cirka 10 µm i diameter.
- Fyll drog kapillär elektroderna från steg 3,1-3,2 och solid-state elektroder innehavare prefabricerade med Ag/Granulatfyllda pellets (se Tabell för material) med 3 M KCl med hjälp av en mikropipett.
Obs: Få bort eventuella luftbubblor i kapillären eller elektrodhållare. - Infoga drog elektroderna i elektrodhållare.
- Bereda 100 mL 10-5 M L-arginin i kol-filtrerat vatten från 10-2 M L-arginin stamlösning i avjoniserat vatten (lagrad vid 4 ° C) i en mätkolv. Överför 20 mL av det 10-5 M L-arginin till en injektionsflaska av glas.
- För koncentration-respons kurva, förbereda 10 mL 10-faldig utspädningar av bråkdel poolerna från steg 2,3 i injektionsflaskor av glas. Förbereda färska utspädningar dagligen innan experimenten och använda dem inom en dag. Sätta i glasampuller med fungerande lösningar av L-arginin och bråkdel pool spädningarna i en recirkulerande vattenbad att låta temperaturen till temperera vid 8 ° C.
- Söva nejonöga med 3-aminobensoesyra acid ethyl ester (MS222; 100 mg/L) och immobilisera det med en intramuskulär injektion av gallamine triethiodide (3 mg/kg kroppsvikt, i 0,9% saltlösning) med en steril spruta.
Obs: En tillräckligt djup anestesi bestäms genom att observera inga gill rörelse, en oförmåga att bibehålla en upprätt hållning och inget sug på sidorna av tanken med dess muntliga disk. För att minimera all mikrobiell kontaminering före och under operation, bära sterila handskar och blöta dissektion verktygen i 70% etanol (v: v) i avjoniserat vatten minst 10 minuter före användning. - Orient den sövda nejonöga i en V-formad stå och slå in den med en våt pappershandduk för att förhindra uttorkning.
Obs: Täck inte gill öppningarna. - Infoga en tub med recirkulerande kolsyrat vatten som innehåller 50 mg/L MS222 i kindhålan, justera flödet och se till att vatten är spännande via gill öppningar för att kontinuerligt vattna gälarna.
- Använd en steril skalpell och pincett [i stereoskopisk Mikroskop vid 1,25 X förstoring (se Tabell för material)] ta bort ett 5 mm2 avsnitt av huden på ytan av lukt kapseln att exponera luktepitel.
- Spola luktämnet leverans slangen med filtrerat vatten och Anslut den till den ventil som är monterad på en micromanipulator. Placera det luktämnet leverans kapillärröret i luktepitel kaviteten med micromanipulator för att leverera filtrerat vatten till luktepitel att förhindra uttorkning när inte administrera odoranter.
- Montera inspelning och referens elektroderna på micromanipulators. Lägre referenselektroden på yttre huden nära naris. Använda stereoskopisk Mikroskop (1,25 X), lägre inspelning elektroden att knappt röra vid ytan på luktepitel.
- Överföra upptagningen av luktämnet inloppsrörets från bakgrunden filtreras vattnet till 10-5 M L-arginin lösningen.
- Slå på datorn, förstärkare (inställd på DC-läge), filter och digitizer. Via programvaran ventil föraren programmera förfarandet för att administrera en 4 s enda puls av luktämnet genom att kryssa i rutan för T1, inställning T 4 s, och kryssa i rutan för T2.
- I programvaran data förvärv (se Tabell för material), anger förvärv läget till en höghastighets oscilloskop, klicka på play-ikonen och klickar på Starta i ventilen drivrutinen att utlösa luktämnet pulsen.
Obs: Data förvärv programvaran automatiskt registrerar differentiell EOG svar amplituden för 20 s (3 s innan, 4 s under luktämnet pulsen och 13 s efteråt). Använd micromanipulator för att manövrera positionerna för den inspelningen elektrod, referenselektrod eller luktämnet inloppsrörets att öka signal-brus-förhållandet med ett maximalt svar till L-arginin standard och en minimal svar till Tom kontrollen ( filtrerat vatten). Jorda förstärkaren genom att byta växeln AC-DC förstärkare till GND medan du flyttar elektroderna. - Starta inspelning blankprovet, L-arginin och sedan de doftämnen som bereddes i steg 3.6 från låga till höga koncentrationer med en 2 min flush filtrerat vatten mellan program.
- Efter inspelningen Svaren till alla de doftämnen som ska testas, marken förstärkaren och dra försiktigt tillbaka de elektroder och luktämnen leverans kapillärrör. Efter de godkända metoderna för institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC), vid uppsägning av EOG experimentet, avliva den sövda nejonöga med en överdos av MS222 (1 g/L).
Obs: Kontrollera framgångsrika dödshjälp genom att notera avsaknaden av gill rörelse och heartbeat för minst 5 min följt av nackstick hjärnan. - Analysera och plotta data med hjälp av analysprogrammet. Fastställa tröskeln till upptäckt av odoranter22 att identifiera illaluktande fraktioner som framkallar Svaren större än tom vatten kontroll. Fraktion poolerna som framkallar koncentrationsberoende olfactory svaren som är annorlunda än kontrollen tom vatten testas sedan i en beteendevetenskaplig analys (steg 4).
4. två-val labyrint beteendemässiga Bioassay att identifiera Behaviorally aktiva fraktioner/föreningar
- Vänja den könsmogna kvinnliga havet nejonöga i release buren i labyrinten (se kompletterande Figur1) för 5 min. bibehålla flödet av floden bevattnar i labyrinten
Obs: Labyrinten är byggd från lackad marin kvalitet trä och åtgärder 6,5 m i längd och 1,2 m i bredd med en avdelare som mäter 2,7 m i längd att separera labyrinten i två kanaler i uppströms slutet. Vatten leds tillfälligt i labyrinten. Vattendjupet bör bibehållas på 0,19 m och hastigheten bör bibehållas på 0,07 m/s ± 0,01. - Släpp den havet nejonöga och registrera kumulativa beloppet av tiden nejonöga tillbringar i de experimentella och Kontrollkanal varje innehållande älvvattnet i 10 min.
Obs: Om den havet nejonöga underlåter att ange de experimentella och styra kanal för minst 10 s under 10 min avsluta rättegången, eftersom detta är en indikation av inaktivitet eller starka sida bias. - Tillämpa den test stimulansen (dvs.en förmodad feromon på 10-12 M upplöst i 50% metanol/avjoniserat vatten) att slumpmässigt tilldelade experimentella kanalen och fordonet (50% metanol/avjoniserat vatten) till kontroll kanal med peristaltiska pumpar till konstanta priser 200 mL/min för 5 min.
Obs: Den upptäckt tröskelkoncentration av test stimulans som bestämts med electro-olfactogram inspelningar bör användas som den ursprungliga koncentrationen för beteendemässiga testet. - Applicera den test stimulansen och fordonet för en ytterligare 10 min och registrera kumulativa beloppet av tiden nejonöga tillbringar i de experimentella och kontrollkanalen.
- Spola igenom labyrinten med vatten i ca 10 min innan nästa rättegången. Upprepa steg 4.1-4.4 med minst 7 nejonöga om tillräcklig test stimulus är tillgängliga.
- Beräkna ett index av preferens22 för varje prövning och bedöma betydelsen använder en Wilcoxon undertecknat-rank-test.
Obs: Indexet resulterar i en enda siffra som kan vara antingen positiva eller negativa. Ett positivt värde om preferens anger attraktion, medan ett negativt värde på index för preferens indikationer repulsion. Om index för preferens skiljer sig väsentligt från noll, som bråket aktiv.
Här
Bc = den tid som den test nejonöga i kontrollkanalen innan luktämnet ansökan,
Be = tid i den experimentella kanalen innan luktämnet ansökan,
C = tiden i kontrollkanalen efter luktämnet ansökan, och
Ene = den tid som tillbringas i experimentell kanalen efter programmet luktämnet.
5. kromatografiska isolering av rena föreningar från aktiva fraktioner
- Upprepa steg 2.1-2.4 i bråkdel pooler som inducerar olfactory svaren (steg 3) och framkalla beteendemässiga svaren (steg 4).
- Ytterligare rena aktiva fraktioner till föreningar med storlek-utslagning kromatografi med en Sephadex LH-20 kolonn.
- Förbereda provet i 0,5 mL i mobila inledningsfasen [CHCl3- MeOH (1:1) eller MeOH 100%], Fyll i motsvarande kolumn en CHCl3- MeOH (1:1) kolumn och sedan en kolumn med MeOH (100%) och eluera dem för att ge föreningarna.
6. struktur förtydligandet av en ren förening med masspektrometri (MS) och kärnmagnetisk resonans (NMR)
- Lös och späd den rena föreningen i den inledande mobila fasen (vanligtvis metanol-vatten, 1:1, v: v) av högpresterande vätskekromatografi (HPLC) att bilda en 10 μL lösning av ungefärligt 1 μg/mL.
- Överföra provlösning för HPLC injektionsflaskor och ställa dem till autosampler för HPLC. Injicera provet (10 μL) i den elektrospray jonisering masspektrometri (ESIMS) och spela in högupplösta elektrospray jonisering masspektrometri (HRESIMS) spektra använder en kromatografi masspektrometer23.
- Förutsäga formeln enligt databasen i programvaran masspektrometer (se Tabell för material)24.
- Öppna kromatogrammet injicerade provets och få dess masspektrum genom att välja kromatografiska topp.
- Mata in den uppmätta massan till ion (m/z) värde (4 decimaler) i elementär sammansättning under modulen verktyg . Anger parametern tolerans till PPM < 5.
- Justera parametrarna symbol för att passa element sammansättningen av uppmätta molekylen. Programvaran ger en förutsägelse av molekylformel baserat på en enda massa analys.
- Välj de deutererade lösningsmedel (600 μL, CH3OH -d4 eller DMSO -d6) enligt de protokoll25 att upplösa proven.
- Upplös provet i de valda deutererade lösningsmedel att bilda en lösning med en koncentration som sträcker sig ungefär från 0,1 till 10 mg/mL. Överför provlösningen till ett NMR-röret för att spela in 1D (1H, 13C) och 2D NMR [1H -1H korrelation spektroskopi (mysiga), heteronuclear enda quantum samstämmighet (HSQC), heteronuclear flera bond korrelation (HMBC)] Spectra på en 900 MHz NMR spectrometer26.
- Placera NMR röret med provet inuti spinner turbinen. Använda djupmätare för provet höjd är i mitten av mäta fönstret. Öppna programvaran NMR (se Tabell av material) och klicka på knappen lyft att ändra urvalet i magneten.
Obs: Håll en hand över toppen av magneten att känna den gas som kommer från toppen av magneten. Samtidigt bör ett visslande ljud hörbara. - Försiktigt placera provet på luften dynan ovanpå magneten och tryck knappen lyft att sjunka provet i NMR magneten.
Obs: Lyssna efter ett ”klick” ljud visar provet är i rätt position. - Skapa en ny datauppsättning och ladda de standardparametrar som rekommenderas av NMR instrumentet (se Tabell för material).
- Skriv ”lås” för att åberopa förfarandet för automatisk låsning och välj lösningsmedlet på snabb sida.
- För finjustering, manipulera panelenjustera knappen i Lås upp modellen, justera markören på panelen manipulera och låsa magneten igen.
- På prompten Atma sidan justera parametern i panelen manipulera det trim förfarandet, vilket kan ta några minuter. Vänta tills sökningen är klar för att fortsätta.
- Starta automatisk shimming rutin genom att skriva ”topshim” i prompten. Vänta tills den mellanlägg har slutförts för att fortsätta.
- Typ ”rga” för att ställa in automatisk ta emot vinst justeringar, då typ ”d1” att ställa in fördröjningen mellan pulser, då typ ”zg” att starta förvärvet och vänta tills förvärvet slutförs.
- Skriv ”ef” eller ”efp” att bearbeta data och skriv sedan ”apk” för automatisk fasa. Bearbeta data på NMR bearbetning programvara.
- Belysa den kemiska strukturen av en tolkning av NMR dataanalys.
- Räkna kol signalerna i 13C NMR spectrumen. Välj formeln matchade förutspått resultatet i högupplösande masspektrometri (HR-MS).
- Integrera proton signalerna i 1H NMR spectrumen och tilldela anslutning av den kol och proton-baserade på signaler i HSQC spektrum.
- Tilldela anslutning av kol skelettet baserat på korrelationer i 1H -1H COSY och HMBC spektrum.
- Preliminärt tilldela den kemiska strukturen baserat på struktur logiken27. Sök trevande strukturen i kemisk struktur databaser. Jämför den trevande strukturen med analoger i referenser.
- Tilldela den relativa konfigurationen med nukleära Overhauser verkställer spektroskopi (NOESY) spektrumet.
Obs: Eftersom identitetsegenskaperna för enantiomererna visas på spektrometri och spektroskopiska metoder är identiska, absolut konfigurationen av vissa föreningar, särskilt de med 2'-alkohol och 2'-NH2, har skall bestämmas med en derivatisering reaktion. Efter derivatisering reaktionen underlätta skillnaderna anges på spektra entydig tilldelning av absoluta konfigurationer av de flesta föreningar28.
7. EOG och Bioassay bekräfta rena föreningar är illaluktande och behaviorally aktiva
- Upprepa steg 3.1-3.5.
- För koncentration-respons kurva, förbereda 10 mL 10-faldig spädningar av de rena föreningarna från 10-6 M - 10-13 M av en 10-3 M feromon stamlösning i 50% metanol/vatten lagras vid-20 ° C baserat på den molekylära vikten bestäms i steg 6,2. Sätta i injektionsflaskor av glas med fungerande lösningar av L-arginin och de rena föreningarna i ett recirkulerande vattenbad att låta temperaturen till temperera vid 8 ° C.
- Upprepa steg 3,7-3.18.
- Upprepa steg 4.1-4.2.
- Gälla slumpmässigt tilldelade experimentella kanalen och fordonet (50% metanol/avjoniserat vatten) till Kontrollkanal använder en Peristaltisk pump till konstanta priser 200 mL/min för 5 min ren föreningen EOG upptäckt tröskel koncentration.
- Upprepa steg 4,4-4,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett diagram som summerar stegen som beskrivs i protokollet av den bioassay-guidad fraktioneringen visas i figur 1. Protokollet omfattar steg för att isolera och karakterisera struktur, lukt potens och beteendemässiga aktiviteten av 5 förmodad havet nejonöga feromoner (figur 2). Med hjälp av massa spektrometriska och NMR data (figur 3 och figur 4), var petromyzene A-B och petromyzone A-C strukturer klarlagd från vatten luftkonditionerade med mogen manlig havet nejonöga22,29.
Våra representativa data från EOG inspelningarna (figur 5) visar att petromyzene A-B och petromyzone A-C var alla potenta odoranter som stimuleras vuxen havet nejonöga luktepitel och hade låga trösklar för upptäckt (figur 6) . Observera EOG inspelningarna kräver en lämplig placering av inspelning elektroden på ytan av luktepitel i förhållande till stimulans inloppsrörets att resultera i en bra signal-brus-förhållande för tillförlitlig luktämnet svar recordings ( Figur 5B). Om denna kritiska steg inte följs, kommer det vara svårt att urskilja signalen inducerad av luktämnet bland höga buller. Den nedåtgående omläggning av EOG spårningen efter luktämnet exponeringen är en negativ potential. En bra EOG signal bör visa en luktämnet administration vilket resulterar i en snabb och skarp svar följdes av en återhämtning till baslinjen. De förmodade feromoner lukt Svaren var också normaliserade till svaren från 10-5 M L-arginin, en positiv kontroll luktämnet i det havet nejonöga, testade hela experimentet att säkerställa integriteten av inspelningarna bibehölls.
I två-val labyrint beteendemässiga analyserna (figur 7A), ägglossning kvinnliga havet nejonöga lockades till petromyzone A, petromyzene A och petromyzene B, och tillbaka från petromyzone C. Ovulated honor föreföll vara avsky från petromyzone B; den beteendemässiga Svaren var dock inte signifikant (figur 7B). En större urvalsstorlek var inte möjligt på grund av den begränsade mängden petromyzone B. För att korrekt bedöma beteendemässiga svar på en luktämnen, är det viktigt att registrera förbehandling bias för kontroll och experimentella kanal för varje nejonöga.
Figur 1: ett flödesschema av den bioassay-guidad fraktioneringen av feromoner. Denna siffra är anpassade från figur 2 i Li, Buchinger och Li30. Rutorna ange kemiska produkten från den teknik som anges i ovalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: petromyzene A-B och petromyzone A-C. kemiska strukturer Denna siffra är modifierad från siffrorna 1 i Li et al. 22 , 29. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3:1 d NMR spectra. 1D NMR spectra petromyzene A: (A), 1H NMR (900 MHz) spektrumet och (B) den 13C NMR (225 MHz) spektrum. Denna siffra är från den stödjande informationen i Li et al. 29. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: 2D NMR spectra. 2D NMR-spektra av petromyzene A: (A), det HSQC spektrumet, (B), 1H -1H mysiga spektrum, (C) HMBC spektrum och (D), NOESY spektrum. Denna siffra är från den stödjande informationen i Li et al. 29. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: Electro-olfactogram (EOG) inspelning förberedelse och representant trace inspelningar. (A) Detta är en EOG förberedelse visar exponerade havet nejonöga luktepitel med inspelning elektroden, referenselektroden, luktämnen inloppsrörets och syresatt vatten med bedövningsmedlet. (B) denna panel visar representativa trace inspelningar visar bra (överst) eller dåliga (nederst) signal-brus-förhållanden. En bra signal-brus-förhållande är nödvändigt för tillförlitlig luktämnet Svaren inspelningar. Den nedåtgående omläggning av EOG spårningen efter luktämnet exponeringen är en negativ potential. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: en semi logaritmisk tomt på electro-olfactogram (EOG) koncentration-responskurvorna. Petromyzone A-C och petromyzene A och B var stimulerande att vuxna havet nejonöga luktepitel och hade låg upptäckten tröskelvärden. Data presenteras som den genomsnittliga normaliserade EOG amplitud ± S.E.M. Urvalsstorlekarna var följande: petromyzone A, petromyzene A och petromyzene B (n = 7), och petromyzone B och petromyzone C (n = 5). Infällt är en expanderad vy av EOG svaren visar svar tröskelkoncentrationer. Denna siffra har ändrats från figur 3 i Li et al. 22 och figur 4 i Li et al. 29. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7: en schematisk och resultaten av de två-val labyrint används för att utvärdera de beteendemässiga svar på ägglossning kvinnliga havet nejonöga odoranter. (A), pilen representerar riktningen av vattenflödet (0,07 m s-1 ± 0,01). Cirklarna representerar de luktämnet administration punkterna. De små streckade linjerna representerar finmaskigt som används för att begränsa förflyttning av den havet nejonöga reaktion mot labyrinten. De stora streckade linjerna representerar flödet styrelser används för att minska vatten turbulens. Den grå rektangeln representerar release buren. Skalstapeln = 1 m. Denna siffra är från figur S1 i Li et al. 29. (B) Honor lockades till petromyzone A, petromyzene A och petromyzene B. Tiden nejonöga tillbringade i varje kanal av labyrinten innan och efter luktämnet exponeringen (10-12 M) användes för att beräkna ett index av preferens att bedöma dess beteendemässiga svar på luktämnet. Ett positivt värde om preferens anger attraktion. Provstorleken, n, rapporteras utanför parentesen, och siffran inom parentes visar antalet honor över prövningar som tillbringade mer tid i den experimentella kanal jämfört med kontroll. Uppgifterna presenteras som menar ± S.E.M. (* p < 0,05; Wilcoxon undertecknat-rank-test) att jämföra inställningen beteende före och efter luktämnet exponeringen. Denna siffra har ändrats från figur 4 i Li et al. 22 och figur 5 i Li et al. 29. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande bild1: ett fotografi av labyrinten. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fisken lever i en kemisk värld full av föreningar ännu identifieras. Bioassay-guidad fraktionering har visat sig nödvändigt att identifiera och karaktärisera bioaktiva molekyler som förmedlar många kemiska interaktioner, såsom de som observerades i masu lax31, asiatiska elefanter32och havet nejonöga33, 34,35. Bioassay-guidad fraktionering är ett effektivt tillvägagångssätt till korrekt spår och pinpoint de bioaktiva föreningarna från start extraktet till den renade aktiv föreningen. Använder denna metod, kan de identifiera bioaktiva föreningarna avslöja en roman som är sammansatta med en unik kemisk skelett som är osannolikt att förutsägas från den kända biosyntetiska vägar.
EOG inspelningar genomförs för att avgöra vilka fraktioner eller föreningar framkalla olfactory svaren. Flera tekniska överväganden är absolut nödvändigt att noggrant mäta de lukt Svaren till de förmodade feromoner med EOG inspelningar. Först, i enlighet med de institutionella djur vård och användning kommittén godkänt förfaranden, fisken måste vara djupt sövda med 3-aminobensoesyra acid ethyl ester (MS222) och orörlig med en intramuskulär injektion av gallamine triethiodide. Inspelningen elektroden kommer att upptäcka någon rörelse över gälarna och hjärtslag på grund av en otillräcklig immobilisering, vilket kan vara en källa till elektriska störningar. Det andra bör luktepitel omedelbart utsättas för kol-filtrerat vatten efter dissektion att förhindra uttorkning. Justera placeringen av den inspelning och referenselektrod med micromanipulators, elektriska marken och luktämnen inloppsrörets kan hjälpa till att maximera svaret på positiv kontroll luktämnet samtidigt minimera tom kontrollen (svar filtrerat vatten). Tredje, efter att identifiera en känslig inspelningsplats i luktepitel, är det viktigt att spela in från en liknande position på lamellerna att minimera variationen. Konsekvent inspelning från ett liknande läge ska hålla tanken och V-formad plast stativet håller fisken, Mikroskop, luktämnen inloppsrörets och micromanipulators i samma position. Bedövningsmedel röret måste förbli i fiskens kindhålan för varaktigheten av experimentet att säkerställa den fortfarande sövda. Placering inom kindhålan och flödet av bedövningsmedlet kan dock ändras om inspelning elektroden är att upptäcka förflyttning av vatten vilket resulterar i en ojämn baslinje på den elektriska signalen.
Utformningen av den beteendemässiga assay bör anpassas till testpersonen beteende ekologi och forskningsfrågan av intresse. Två-val labyrint beteendemässiga analyser används för att avgöra om någon av de illaluktande fraktionerna är också behaviorally aktiva. Eftersom renad föreningar finns ofta bara i minut belopp, är labyrinten ett fördelaktigt beteendemässiga bioassay jämfört med strömmen på grund av en lägre utsläpp. Vi var intresserade av att bedömningen av nära-source preferensen av förmodad kön feromoner släpptes av mogna män förutspådde att attrahera mogna kvinnliga kompisar i närheten och behålla dem på ett fågelbo för lek. Beteendemässiga analysen utformades för att replikera de naturliga förutsättningarna för en ovulated kvinnlig att välja mellan doftämnen de mogna män. Därför var det relevant att testa ägglossning honor som testpersonen i vårt beteende experiment. Beroende på luktämnet testade, kan andra försökspersoner (dvs, annorlunda liv scenen eller hanar) dock lämpligare. Variationer på dimensioner av två-val labyrinten kan vara nödvändigt beroende på storleken av testpersonen och förutspådda aktiva utrymmet av feromonet (dvs.nära källa kontra långa avstånd)36. Beteendemässiga svaren är också ofta koncentrationsberoende. Om en beteendemässiga svar inte beaktas när de förmodade feromonet tillämpas på upptäckt tröskel koncentrationen bestäms med EOG, bör koncentrationen av pheromone justeras. Det bör dock noteras att även om en förening är en potent luktämnen, det inte kan nödvändigtvis inducerar en betydande beteendemässiga preferens. Slutligen, de beteendemässiga svar som observerades i labyrinten ska valideras i fältet miljö med den syntetiska föreningen att bekräfta funktionen av det förmodade feromonet.
En stor begränsning av bioassay-guidad fraktionering är den sekventiell provning av enskilda fraktioner eller föreningar i en bioassay (EOG eller beteende). Tidigare arbete har visat insekt kön feromoner är oftast blandningar av flera komponenter på specifika förhållanden37 som fungerar självständigt som komponenter38 eller synergistiskt som blandar39 att inducera lämplig svaren i artfränder. Därför kan föreningar som enbart är aktiva när de förekommer i särskilda blandningar förbises med bioassay-guidad fraktionering eftersom de kräver kombinatoriska tester för att bekräfta bioaktiviteten. Andra begränsningar av bioassay-guidad fraktionering är: 1) en stor mängd utgångsmaterial är nödvändigt att ha en tillräcklig mängd för strukturanalys, EOG och beteendemässiga analyser; (2) processen är tidskrävande på grund av iterativa reningsprocessen; och 3) minimala eller instabila föreningar är osannolikt att upptäckas. I framtiden, kan att övervinna några av de tekniska begränsningarna av bioassay-guidad fraktionering kräva en hybridiserade strategi av bioassay-guidad fraktionering och metabolomik. Använda en hybridiserade strategi, additiv eller synergistisk feromon effekter är mer benägna att vara skönjas13 och instabila föreningar är mer sannolikt att upptäckas.
Processen beskrivs bioassay-guidad fraktionering är särskilt utformad för identifiering av havet nejonöga feromoner. Kemisk kommunikation är allestädes närvarande i djurriket1 dock och denna process kan lätt anpassas för att karakterisera feromoner i ett brett spektrum av taxa. Feromon identifiering och karakterisering är viktiga eftersom feromoner kan användas för att modulera beteendemässiga Svaren resulterar i kontroll av invasiva arter eller återställande av imperiled inhemska arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar den amerikanska geologiska undersökning Hammond Bay biologiska stationen för användningen av deras forskningsanläggningar och personalen av U.S. fisken och djurlivet Service och fiske och Oceans Kanada för att tillhandahålla havet nejonöga. Denna forskning stöds av bidrag från det stora sjöarna fiskerådet till Weiming Li och Ke Li.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
- Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
- Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
- Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
- Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
- Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
- Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , Springer Science & Business Media. (2013).
- Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
- Stacey, N., Sorensen, P. Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , Elsevier Inc. (2011).
- Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
- Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
- Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
- Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
- Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
- Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
- Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
- Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
- Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour? Animal Behaviour. 78, (2009).
- Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
- Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).
- Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
- Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
- Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692 (2007).
- Kaiser, B., Wright, A. Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , BRUKER. Madison, WI. (2008).
- Breitmaier, E., Sinnema, A. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).
- Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
- Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
- Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , In press (2018).
- Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
- Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
- Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
- Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
- Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
- De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
- De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
- Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
- Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).
