Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा की अनुमति Reperfusion के माध्यम से आम मन्या धमनी की मरंमत चूहों में

Published: January 23, 2019 doi: 10.3791/58191
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Department of Neuroscience, Psychology and Behaviour, University of Leicester, 2Preclinical Imaging Facility, Core Biotechnology Services, University of Leicester, 3School of Psychology, University of Nottingham

Summary

मध्य मस्तिष्क धमनी के Intraluminal रेशा रोड़ा में सबसे अधिक प्रयोग किया जाता है vivo में प्रयोगात्मक स्ट्रोक के मॉडल को कुतर । आम मन्या धमनी की मरम्मत की अनुमति देने के लिए एक वैकल्पिक शल्य दृष्टिकोण यहाँ किया जाता है, जो आम मन्या धमनी के reperfusion और मध्य मस्तिष्क धमनी क्षेत्र के लिए एक पूर्ण reperfusion की अनुमति देता है.

Abstract

कोरोनरी स्ट्रोक वयस्क दीर्घकालिक विकलांगता और मौत का एक प्रमुख कारण दुनिया भर में है । वर्तमान उपचार उपलब्ध केवल ऊतक plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) के साथ एक अनुमोदित दवा उपचार के लिए कोरोनरी स्ट्रोक लक्ष्य के रूप में सीमित हैं । कोरोनरी स्ट्रोक के क्षेत्र में वर्तमान अनुसंधान बेहतर स्ट्रोक के pathophysiology समझ पर केंद्रित है, विकसित करने और उपंयास दवा ठिकानों की जांच । विश्वसनीय प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल संभावित उपचार की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण हैं । मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) मॉडल नैदानिक रूप से प्रासंगिक है और सबसे अक्सर इस्तेमाल किया शल्य चिकित्सा मॉडल कुतर में कोरोनरी स्ट्रोक की । हालांकि, इस मॉडल के परिणाम, जैसे घाव की मात्रा, विशेष रूप से चूहों में, परिवर्तनशीलता के उच्च स्तर के साथ जुड़े रहे हैं । वैकल्पिक MCAO मॉडल यहां वर्णित आम मन्या धमनी (सीसीए) के reperfusion और मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के क्षेत्र की वृद्धि हुई छिड़काव की अनुमति देता है, फाइब्रिनोजेन आधारित सीलेंट के साथ एक ऊतक पैड का उपयोग करने के लिए पोत की मरंमत, और सुधार बाहरी मन्या धमनी (ECA) बंधाव से परहेज करके चूहों का कल्याण. इससे विलिस के सर्कल पर निर्भरता कम होती है, जिसे चूहों में अत्यधिक anatomically चर जाना जाता है. प्रतिनिधि डेटा दिखाने के लिए कि इस वैकल्पिक शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण का उपयोग पारंपरिक MCAO दृष्टिकोण और वैकल्पिक दृष्टिकोण के बीच घाव की मात्रा में परिवर्तनशीलता कम हो जाती है यहां वर्णित है ।

Introduction

मस्तिष्क स्ट्रोक का एक प्रमुख कारण मध्य मस्तिष्क धमनी के क्षेत्र में फोकल ischemia है । ऊतक plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) केवल औषधीय उपचार सिद्ध प्रभावकारिता के साथ उपलब्ध है, कई नैदानिक दवा कोरोनरी स्ट्रोक1,2के लिए लक्षित परीक्षणों के बावजूद । हालांकि, सुरक्षा चिंताओं और एक संकीर्ण चिकित्सीय खिड़की के कारण (< ४.५ ज), सभी स्ट्रोक रोगियों के केवल ~ 15% टीपीए प्राप्त करने के लिए पात्र हैं, और recanalization दरों ५०%3,4< जा सकता है ।

स्ट्रोक के Reproducible और चिकित्सकीय प्रासंगिक पशु मॉडल नए और संभावित स्ट्रोक चिकित्सकीय उपचार के विकास को सूचित करने के लिए आवश्यक माना जाता है । हालांकि, पशु मॉडल के साथ परिणामों में निरंतरता और परिवर्तनशीलता के बारे में चिंताओं के कारण, यह vivo मॉडल में मौजूदा को निखारने क्लिनिक के लिए नैदानिक अध्ययन से अनुवाद में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण रहता है । नैदानिक उपयोग करने के लिए संभावित उपचार के नैदानिक प्रयोगात्मक प्रभावकारिता से अनुवाद की कमी स्ट्रोक रिसर्च5के लिए चल रही चिंता का विषय है । अनुवाद की विफलता के लिए कारणों से कई होने की संभावना है और हो सकता है, उदाहरण के लिए, परीक्षण डिजाइन, उपचार में देरी, नैदानिक स्ट्रोक विविधता, और पशु मॉडलों की सीमाएं6इस्तेमाल किया । स्ट्रोक अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती सुरक्षित और प्रभावी उपचार के विकास रहता है ।

मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (MCAO) द्वारा intraluminal रेशा सम्मिलन प्रयोगात्मक स्ट्रोक के वीवो कुतर मॉडल में सबसे अधिक प्रयोग किया जाता है. इस मॉडल के एक ischemia प्रेरण के बाद रक्त के प्रवाह की बहाली की अनुमति देता है, घटनाओं है कि मानव स्ट्रोक में होते है नकल उतार7। हालांकि, चूहों में विशेष रूप से, विभिंन मानक विचलन के साथ विषम घावों की मात्रा हो भले ही परिभाषित शल्य प्रोटोकॉल8,9,10लागू कर रहे हैं । यह छोटे striatal और बड़े striato-cortical घाव खंड11के एक bimodal वितरण देखने के लिए विशिष्ट है । ischemia प्रेरित करने के लिए, रेशा आमतौर पर सीसीए या ECA जो तो स्थाई रूप से12ligated रहने का एक चीरा के माध्यम से डाला जाता है । सीसीएल का स्थाई बंधाव आंतरिक मन्या धमनी (ICA) में रक्त प्रवाह की पुन: स्थापना को रोकता है और, बाद में, एमसीए क्षेत्र. इसके कारण reperfusion को विलिस (गोशाला) के घेरे के भीतर जमानती आपूर्ति पर निर्भर रहना पड़ता है । गाय संरचना व्यक्तिगत पशुओं के बीच संरचनात्मक परिवर्तनशीलता है, विशेष रूप से C57BL/6 चूहों में-एक आम तौर पर vivo स्ट्रोक अनुसंधान13में इस्तेमाल किया तनाव । ECA के माध्यम से रेशा सम्मिलन का एक वैकल्पिक तरीका, सीसीएल के माध्यम से जारी छिड़काव की अनुमति देता है, लेकिन इस विधि ECA क्षेत्र के लिए धमनी की आपूर्ति समझौता है, जो चूहों में दिखाया गया है, पर एक हानिकारक प्रभाव है पशु वेल-14.

संपार्श्विक आपूर्ति और reperfusion के लिए गाय पर निर्भरता स्थापित MCAO मॉडल में, भाग में, रोड़ा के बाद घाव की मात्रा परिवर्तनशीलता के लिए खाता है । हम एक वैकल्पिक murine शल्य प्रक्रिया का वर्णन जहां ECA बंधाव से बचा है और सीसीए चीरा मरंमत की है, इस प्रकार सीसीए के माध्यम से reperfusion की अनुमति, गाय के स्वतंत्र । सीसीएल15के माध्यम से सफल reperfusion में परिणाम देने के लिए सीसीएल चीरा की मरम्मत पहले चूहों में दर्शाई गई है । हम सफलतापूर्वक चूहों11 में इस दृष्टिकोण लागू किया है और यहाँ रिपोर्ट प्रोटोकॉल जो घाव की मात्रा में एक कम परिवर्तनशीलता में परिणाम, प्रयोगात्मक स्ट्रोक अध्ययन में इस्तेमाल मुख्य परिणाम उपाय.

इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शन कैसे सीसीए पोत रेशा प्रविष्टि के माध्यम से MCAO करने के लिए सीसीए पोत मरंमत, जो एक ऊतक पैड और सीलेंट आवेदन reperfusion अनुमति शामिल है पीछा किया ।

Protocol

इस प्रोटोकॉल और रिपोर्ट डेटा के अनुसार आयोजित किए गए ब्रिटेन जानवरों (वैज्ञानिक प्रक्रियाओं) अधिनियम, १९८६ (परियोजना लाइसेंस 60/4315) और संस्थागत नैतिक अनुमोदन का पालन । सभी प्रयोगों पशु अनुसंधान के अनुसार रिपोर्ट कर रहे हैं: में Vivo प्रयोगों की रिपोर्टिंग (आने) दिशानिर्देश16.

1. तैयारी

  1. सर्जरी से पहले वयस्क पुरुष C57BL/6 चूहों को ऑपरेटिव केयर (उदा., पर्यावरण, बिस्तर, रिकवरी फूड्स) से परिचित कम से ४८ ज.
    नोट: पोस्ट-MCAO पशु अक्सर खाने और सर्जरी के बाद पीने के साथ कठिनाई होती है ।
    1. सर्जरी के बाद अत्यधिक वजन घटाने को रोकने के लिए, किसी भी पोस्ट करने के लिए पशुओं acclimatize द्वारा MCAO आहार, उदाहरण के लिए, निर्जलीकरण जेल, जेल भोजन, और भिगो/गीला सामांय आहार छर्रों सीधे पिंजरे फर्श पर ।
    2. ऐसे सफेद कागज चिप के रूप में पोस्ट को ऑपरेटिव बिस्तर, पिंजरे बिस्तर बदलें ।
  2. सर्जिकल सेट अप या प्रक्रियाओं शुरू करने से पहले सभी शल्य चिकित्सा उपकरण निष्फल ।
    1. उपकरण autoclaving (१२१ डिग्री सेल्सियस, 15 साई, 15 मिनट के लिए) या ईथीलीन ऑक्साइड के उपयोग के माध्यम से (के साथ सही निर्माता के निर्देशों का पालन, के लिए 8 के लिए-10 घंटे) ।
    2. प्रक्रिया को सेट करने से पहले सभी सतहों को संक्रमित करें । कवर सभी बाँझ शल्य पर्दे या आइटम है कि सर्जरी के दौरान हैंडलिंग की आवश्यकता के लिए autoclaved पंनी के साथ सतहों । प्रक्रिया की अवधि के लिए अपूतित तकनीक का उपयोग करें ।
      नोट: Autoclaved पंनी उपकरणों या उपकरण है कि शल्य चिकित्सा के दौरान आयोजित की जरूरत को कवर किया जा सकता है । बाँझ दस्ताने और तकनीक का उपयोग कर, पंनी और लागू किया जा सकता है, तो, आइटम बाँझ क्षेत्र में रखा जा सकता है. इस के बाद, एक बाँझ दस्ताने परिवर्तन की आवश्यकता होगी ।

2. मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा सर्जरी

  1. सर्जरी के समय 24 – 31 ग्राम वजनी वयस्क पुरुष C57BL/6 चूहों का प्रयोग करें । एक लाल प्लास्टिक संज्ञाहरण चैंबर में, 2 एल/ओ2के मिनट में 5% isoflurane का उपयोग संज्ञाहरण प्रेरित ।
  2. प्रेरण के बाद, शल्य चिकित्सा के लिए एक पर्याप्त संज्ञाहरण गहराई को बनाए रखने के लिए isoflurane को कम (जैसे, ७०% N 2 में 1.5-2% o2/30% हे2), चेहरा मुखौटा द्वारा दिया एक मेहतर कम करने के लिए प्रणाली के साथ संयुक्त है सर्जन isoflurane के लिए जोखिम ।
    नोट: नाइट्रस ऑक्साइड (एन2ओ2) ऑक्सीजन के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है (ओ2) एक पर्याप्त संज्ञाहरण गहराई के लिए isoflurane की आवश्यक राशि को कम करने के लिए ।
  3. प्रशासन प्रणालीगत analgesia पूर्व ऑपरेटिव [carprofen, 10 मिलीग्राम/किलोग्राम चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति.)] और चीरा साइट को स्थानीय संज्ञाहरण (bupivacaine, 2 मिलीग्राम/०.९% खारा में 1:10 पतला) पेरि-ऑपरेटिव ।
  4. intraperitoneal द्वारा तरल पदार्थ प्रशासन (आईपी.) के २०० µ एल के इंजेक्शन बाँझ का गरम ०.९% NaCl समाधान पूर्व-ऑपरेटिव.
  5. सही लौकिक क्षेत्र और ventral गर्दन छोटे बाल कतरनी का उपयोग करने के लिए त्वचा का पर्दाफाश क्षेत्र के फर दाढ़ी । सर्जिकल त्वचा क्षेत्र को संक्रमित, 3 मिनट के लिए एक 5% chlorhexidine समाधान का उपयोग दोनों आंखों पर आंख स्नेहक लागू होते हैं, उंहें सर्जरी के दौरान सुखाने से रोकने के लिए ।
    नोट: यदि पल्स oximetry रीडिंग के लिए आवश्यक रक्त ऑक्सीजन संतृप्ति, हृदय की दर, और श्वास दर की निगरानी करने के लिए, बालों को हटाने क्रीम का उपयोग करने के लिए बाल के हिंद पैर साफ । साफ सूती कलियों का उपयोग कर क्रीम लगाने और, बालों को हटाने के बाद, chlorhexidine समाधान पतला के साथ क्षेत्र धोने । एक पूर्व ऑपरेटिव क्षेत्र में इस कदम को ढीला फर बाँझ सर्जिकल क्षेत्र दूषित के जोखिम को कम करने के लिए प्रदर्शन. शोधकर्ताओं स्थानीय अभ्यास के अनुसार अन्य शल्य साइट की तैयारी का उपयोग करना पसंद कर सकते हैं.
  6. शल्य क्षेत्र के लिए माउस स्थानांतरण और यह एक homeothermic गर्मी एक बाँझ कपड़ा द्वारा कवर चटाई पर प्रवण स्थिति में जगह है । एक नाक शंकु के माध्यम से संज्ञाहरण बनाए रखें । एक गुदा जांच डालने के लिए माउस के शरीर का तापमान पर नजर रखने और यह ३७.० ± ०.६ डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें ।
    1. किसी भी शल्य चीरा से पहले, संज्ञाहरण गहराई की पुष्टि करने के लिए हिंद पंजा वापसी पलटा और पलक पलटा की जाँच करें ।
  7. एमसीए क्षेत्र में रक्त के प्रवाह को रिकॉर्ड करने के लिए एक लेजर डॉपलर flowmetry (एलडीएफ) जांच संलग्न करें ।
    1. एक विच्छेदन stereoscope का उपयोग करना, एक नहीं 15 स्केलपेल का उपयोग कर उजागर लौकिक त्वचा पर सही आंख और कान के बीच मध्यबिंदु पर < 1 सेमी का एक चीरा । कुंद काटना अंतर्निहित खोपड़ी को कवर ऊतक, धीरे से इस हड्डी से दूर scraping और बाँझ कपास झाड़ू के साथ सतह सुखाने ।
      नोट: देखभाल temporalis मांसपेशी को नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए ।
    2. ०.७ mm, लचीला एकल फाइबर ऑप्टिक एलडीएफ मॉनिटर से जुड़ी जांच की पकड़ ले लो, एक तेज स्केलपेल का उपयोग कर एक सपाट बढ़त हासिल करने के अंत में कटौती, डोनट के आकार का जांच धारक के माध्यम से इस धक्का, और फाइबर के अंत में ऑप्टिकल मेल जेल की एक छोटी राशि जगह है ।
    3. जांच धारक के नीचे किनारे के आसपास निविड़ अंधकार सुपर चिपकने वाला गोंद की एक छोटी राशि प्लेस; इस अनुमति के लिए आंशिक रूप से शुष्क और चिपचिपा बन जाते हैं ।
    4. लौकिक हड्डी के ऊपर खोपड़ी सूखी और हड्डी के लिए एक सर्कल में सामयिक ऊतक चिपकने वाला की एक छोटी राशि जगह, बस जांच धारक के लिए पर्याप्त है ।
    5. जांच धारक प्लेस, फाइबर ऑप्टिक पहले से ही जगह में जांच के साथ, इस क्षेत्र पर (6 मिमी पार्श्व और bregma से बाहर 2 मिमी) ।
    6. गोंद सूखी करने के लिए समय की अनुमति दें; एक बार शुष्क और संलग्न, एलडीएफ डेटा रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं ।
  8. धीरे से अधिक एक लापरवाह स्थिति के लिए पशु बारी, ध्यान लेजर डॉपलर जांच का समर्थन करने के लिए और इसकी टुकड़ी को रोकने के लिए ले । धीरे टेप सूक्ष्मदर्शी चिकित्सा टेप के साथ दो forepaws नीचे, कपास की कलियों की एक जोड़ी फिसलने (या ऐसी ही कुछ बंद संदंश के रूप में,) गर्दन के नीचे क्षेत्र उठा और तनाव पैदा करते हैं । अपूतित कवरेज बनाए रखने के लिए एक बाँझ कपड़ा के साथ माउस को कवर.
  9. सीसीएल के विच्छेदन और एक्सपोजर को शुरू करें ।
    1. एक No .15 स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर उजागर ventral गर्दन पर एक १.५ सेमी midline चीरा बनाओ ।
    2. कोमल कुंद विच्छेदन तकनीक का प्रयोग, धीरे पक्षों को लार ग्रंथियों वापस लेना, श्वासनली को उजागर ।
    3. कुंद विच्छेदन का प्रयोग, काटना आसपास के ऊतकों और वागल तंत्रिका से मुक्त सीसीए ।
      नोट: वागल तंत्रिका को किसी भी नुकसान गतिशीलता, खिला, और श्वास ख़राब कर सकते है के रूप में, सीधे वागल तंत्रिका छू से बचें ।
  10. सीसीए के नीचे एक गैर dissolvable 6-0 सीवन के दो छोटे (2 सेमी) वर्गों दर्रा, पोत और वागल तंत्रिका को ventral के लिए पृष्ठीय । सर्जन के करीब एक रेशम टाई ड्रा और सीसीए (समीपस्थ टाई) के आसपास कसकर टाई । ICA/ECA के विभाजन की ओर ढीले रूप से दूसरी रेशम टाई (बाहर की टाई) टाई ।
  11. के लिए सीसीए के एक वर्ग को अलग करने के लिए शुरू, सिर्फ बाहर टाई के ऊपर एक microvascular क्लिप लागू करते हैं लेकिन विभाजन निरोधक नहीं. माइक्रो Vannas कैंची का प्रयोग, सीसीए में एक छोटा सा छेद कर.
    नोट: ECA हर समय पेटेंट रहना चाहिए । सीसीए चीरा पोत की चौड़ाई का कोई अधिक से अधिक ४०% और एक आसानी से सुलभ ventral स्थिति में होना चाहिए; यह पोत मरम्मत स्टेज पोस्ट-MCAO में अहम भूमिका अदा करेगा ।
  12. सीसीए में 7-0 सिलिकॉन लेपित monofilament डालें, microvascular क्लिप की ओर आगे बढ़ ।
    नोट: सर्जरी से पहले माउस के वजन के आधार पर रेशा आकार स्थापित किया जाना चाहिए; निर्माता के दिशानिर्देशों का संदर्भ लें ।
    1. बाहर की टाई, पर्याप्त जगह में यह नुकसान पहुंचाए बिना रेशा जकड़ना कस । क्लिप धारकों का उपयोग कर microvascular क्लिप निकालें ।
      नोट: कोई खून की कमी को इस बिंदु पर देखा जाना चाहिए । यदि रक्त का backflow हो तो रेशा धारण करने वाली बाँध काफी टाइट नहीं होती.
  13. ICA में रेशा अग्रिम ।
    1. सुनिश्चित रेशा ICA के भीतर रहता है और pterygopalatine धमनी (PPA) में पारित नहीं है । थोड़ा उठाने और सीसीए खींच से यह मत करो, रेशम संबंधों में से एक का उपयोग कर, जानवर के शरीर के बाहरी हिस्से के लिए, और रेशा चलाने के लिए आंतरिक PPA के उद्घाटन का सामना करना पड़ अतीत मोड़ ।
      नोट: एक बार एमसीए शाखा मूल के लिए उंनत, आपूर्ति क्षेत्र के सापेक्ष रक्त प्रवाह में एक बूंद एलडीएफ मूल्यों पर दिखाई जाएगी; इससे रेशा जमावट की पुष्टि होती है.
  14. बाहर की रेशम टाई के साथ जगह में रेशा सुरक्षित, इस तंग बांधने । यह जगह में रोड़ा समय अवधि की अवधि के लिए छोड़ दें ।
    नोट: व्यक्तिगत प्रोटोकॉल पर निर्भर, पशु एक वसूली पिंजरे में ले जाया जा सकता है, घाव suturing के बाद, ठीक करने के लिए, या रोड़ा अवधि की अवधि के लिए संज्ञाहरण के तहत रहते हैं । उत्तरार्द्ध मामले में, सुनिश्चित करें कि घाव बाँझ गर्म ०.९% NaCl खारा का उपयोग करके बाहर सुखाने से रोका है ।

3. पद-रोड़ा

  1. MCAO काल के अंत में, सफेद रेशा सिर साफ दिखाई देने तक रेशा को तुरंत वापस कर देता है.
  2. तो, बाहर सीसीए टाई ढीला बस तंतु को दूर पोत के रास्ते से ज्यादातर सिर को हटा दें ।
    नोट: रेशा पूरी तरह से इस बिंदु पर हटा दिया जा सकता है अगर सर्जन गति के साथ विश्वास है बाहर के लिए रक्त की कमी को रोकने के टाई टाई ।
  3. एक क्षैतिज स्थिति में एक microvascular क्लिप जगह बाहर टाई के बगल में सीसीए विभाजन की ओर । बाहर की टाई ढीला और रेशा पूरी तरह से हटा दें । सर्जन की ओर समीपस्थ सीसीए टाई के नीचे एक और microvascular क्लिप जोड़ें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि पोत दबाना के शूल में काफी दूर है किसी भी फिसल को रोकने के लिए । क्लिप की नियुक्ति के बाद चरणों के दौरान क्लिप पदच्युत आसान पहुँच सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है. क्लिप्स के लिए एक बेहतर निकासी और ऊतक पैच की नियुक्ति की अनुमति पोत लिफ्ट मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्लिप क्षैतिज आसपास की मांसपेशियों के पार रखने ।
  4. ध्यान से Dumont #5 संदंश या माइक्रो Vannas कैंची का उपयोग कर दोनों रेशम संबंधों को हटाने और बाँझ कपास कलियों का उपयोग कर क्षेत्र सूखी ।
    नोट: देखभाल के माध्यम से काटने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए/
  5. एक बाँझ पेट्री डिश में, फाइब्रिनोजेन और thrombin सीलेंट समाधान 1 और 2 जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें), दो पदार्थों को सुनिश्चित करने के लिए अलग रहना, बाद में मिश्रण के लिए तैयार.
    नोट: एजेंटों की केवल बहुत छोटी मात्रा (< ०.२५ मिलीलीटर प्रत्येक) की आवश्यकता है । समाधान अलग रखते हुए दो घटकों के बीच एक समयपूर्व प्रतिक्रिया रोकता है । सुनिश्चित करें कि टोपी उसी तरह प्रतिस्थापित किया जाता है के रूप में यह दो सीरिंज है, जो एजेंट प्रतिक्रिया और सिरिंज के भीतर निर्धारित करने के लिए कारण होता है की पार प्रदूषण को रोकने के लिए हटा दिया गया था. उपयोग करने से पहले, समाधान-20 ° c पर संग्रहीत करें । जब पहली सर्जरी के लिए आवश्यक हो, सीलेंट कमरे के तापमान के लिए गल । सीलेंट को फिर से फ़्रीज़ न करें; यह कमरे के तापमान पर रहना चाहिए और इस तरह से संग्रहीत किया जा सकता है । सिरिंज कई सर्जरी यह लागत प्रभावी बनाने में इस्तेमाल किया जा सकता; हालांकि, हम संक्रमण को रोकने के लिए 1 सप्ताह से अधिक समय के लिए एक ही शीशी का उपयोग नहीं करने की सलाह देते हैं ।
  6. Dumont कोई 5 संदंश और माइक्रो Vannas कैंची के साथ पेशी के साथ कुंद विच्छेदन का प्रयोग करने के लिए sternocleidomastoid मांसपेशी की एक पतली ventral टुकड़ा प्राप्त करने के लिए ऊतक पैड के लिए उपयोग करते हैं, टुकड़ा सुनिश्चित करने से अधिक नहीं है 1 मिमी मोटी और मांसपेशियों के शीर्ष तंतुओं के साथ चलाता है ।
    नोट: के माध्यम से कटौती नहीं/मांसपेशी भर में, के रूप में यह काफी अपने समारोह ख़राब होगा । ऊतक काफी बड़ा करने के लिए सीसीए चीरा आराम से कवर किया जाना चाहिए ।
  7. Dumont #5 संदंश का उपयोग कर, ऊतक पैड ले और दो फाइब्रिनोजेन और thrombin सीलेंट समाधान के पार समान रूप से ऊतक मिश्रण, दो रिएजेंट के बीच एक चैनल बनाने. जमावट जल्दी हो जाएगा; जैसे ही जमावट शुरू होती है, ऊतक पैड को हटाने के लिए सीसीए चीरा. एक मध्यम फर्म दबाव और खुले संदंश के साथ नीचे फ्लैट ऊतक पैड प्लेस ।
    1. तेजी से बाहर microvascular क्लिप whilst अभी भी धीरे जगह में ऊतक पैड पकड़ हटा दें ।
      नोट: यह फाइब्रिनोजेन और thrombin सीलेंट रिएजेंट को आगे सक्रिय करने के लिए रक्त के कुछ backflow की अनुमति देता है । बस पर्याप्त दबाव जगह में पैड को पकड़ने के लिए नहीं बल्कि पूरी तरह से पोत ब्लॉक करने के लिए आवश्यक है ।
    2. धीरे ऊतक पैड से दबाव को कम, रक्त चीरा क्षेत्र के तहत प्रवाह करने की अनुमति । अब, धीरे से एवं धीरे से समीपस्थ microvascular क्लिप से दबाव जारी है और पूरी तरह से हटा दें ।
    3. नोट: आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए पोत पूरी तरह से पेटेंट हो जाता है, ऊतक पैड की नियुक्ति और microvascular क्लिप को हटाने के लिए सीसीए के अंदर करने के लिए सील से ऊतक पैड को रोकने के लिए जल्दी घटित होना चाहिए. हालांकि, अगर वहां रक्त रिसाव की एक छोटी राशि है, फिर से ऊतक पैड पर कुछ प्रकाश दबाव जगह थक्का गठन के लिए आगे समय की अनुमति है और होने के लिए सील । यदि रक्त रिसाव पर्याप्त है या ऊतक पैड को सील नहीं दिखाई देता है, दबाव को बनाए रखने के लिए रक्त की कमी को रोकने और दोनों सीसीए microvascular क्लिप की जगह चीरा अलग और खून की कमी को रोकने के लिए ।
  8. घटना में ऊतक पैड पोत को सील नहीं करता है, एक दूसरे का प्रयास किया जा सकता है, कदम 3.3-3.7.3 निंनलिखित ।
  9. एक बार पोत सील है, dissolvable 6-0 टांके का उपयोग कर घाव टांका । यदि एलडीएफ रिकॉर्डिंग सर्जरी भर में जारी रखा गया था, खोपड़ी और टांका dissolvable 6-0 सीवन का उपयोग कर घाव से एलडीएफ को हटा दें ।

4. पोस्ट को-ऑपरेटिव केयर

  1. एक गर्म वसूली पिंजरे में पशु प्लेस (एक गरम शेल्फ पर स्थित/३५ ° c, या एक गर्म चैंबर के भीतर) ।
    नोट: शोधकर्ताओं स्थानीय अभ्यास के अनुसार अन्य तापमान और अवधि का उपयोग करने के लिए पसंद कर सकते हैं.
  2. २०० µ l के साथ सभी जानवरों को उपलब्ध कराने के साथ गरम ०.९% NaCl खारा sc. तुरंत बाद आपरेशन, 4 एच के बाद आपरेशन, और 2x के लिए दैनिक ७२ एच ।
    नोट: गरम ०.९% NaCl के प्रशासन पशु एलईडी है । यदि और अधिक आवश्यक है, अधिक तरल पदार्थ के लिए एक अच्छी वसूली सुनिश्चित करने के लिए प्रशासित किया जा सकता है ।
  3. वसूली पिंजरे में, पानी के लिए विज्ञापन libitum उपयोग के साथ, गीला आहार छर्रों, शुष्क आहार छर्रों, निर्जलीकरण जेल, और जेल खाद्य, के लिए जानवरों अप्रतिबंधित उपयोग दे ।
  4. 24 ज पोस्ट ऑपरेशन में sc. carprofen इंजेक्शन दोहराएं (२.३ कदम देखें) ।
    नोट: सभी जानवरों carprofen की एक ही खुराक प्राप्त; कोई भी न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव नगण्य होने की संभावना है ।
  5. ४८ घंटे के लिए नियमित अंतराल पर, के बाद सेशन माउस मुंह बनाना17 स्कोरिंग के लिए दर्द के स्तर का आकलन करने के लिए आगे analgesia प्रशासन निर्णय सहायता करते हैं ।
  6. सर्जरी से पहले जानवरों को तुरंत तौलना और फिर दैनिक प्रक्रिया का पालन । उनके भोजन और पानी के सेवन और नैदानिक संकेतों की निगरानी करने के लिए दैनिक टिप्पणियों और पूरा कल्याण चादरें प्रदर्शन ।
  7. 24 एच और ४८ एच के बाद आपरेशन में कार्यात्मक टिप्पणियों का कार्य । एक फोकल घाटे पैमाने पर चूहों का आकलन करें । मूल्यांकन उनके शरीर समरूपता, अनिवार्य चक्कर, चाल, ४५ ° ग्रिड चढ़ाई, चक्कर व्यवहार, सामने अंग विषमता, और मूंछ स्पर्श प्रतिक्रिया18,19,20।

5. चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और छवि प्रसंस्करण

  1. संरचनात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का उपयोग कर घाव की मात्रा (LV) को मापने ।
    नोट: वैकल्पिक विधियों, जैसे ऊतकवैज्ञानिक triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) के साथ धुंधला, पहले उपयोग किया गया है और संरचनात्मक एमआरआई डेटा के लिए सहसंबंधी बनाना । हालांकि, इस विधि केवल एक अध्ययन के समापन बिंदु पर उपयोग किया जा सकता और longitudinally नहीं है । अनुदैर्ध्य एमआरआई स्कैनिंग का प्रयोग एक अध्ययन के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या कम हो जाएगा ।
    1. ४८ ज के बाद, MCAO के प्रेरण के बाद, isoflurane के साथ माउस anesthetize (5% isoflurane में 1 एल///के लिए प्रेरण, 1.5-2% isoflurane रखरखाव के लिए) ।
    2. एमआरआई पालना करने के लिए माउस स्थानांतरण, यह श्वसन संवेदक पर अपनी श्वास दर की निगरानी के लिए जगह है, और स्कैनिंग के दौरान अपने तापमान की निगरानी के लिए गुदा तापमान जांच प्रत्यारोपण । प्लेस 2-चैनल माउस-मस्तिष्क आरएफ एक संकेत के लिए मस्तिष्क पर कुंडल प्राप्त है और एक ९.४ टी क्षैतिज बोर स्कैनर में पालना जगह है ।
      नोट: यहां, एक ७२ mm भीतरी व्यास के साथ एक मात्रा का तार आरएफ संचरण के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
    3. टी 2-भारित एक तेजी से स्पिन-इको अनुक्रम का उपयोग कर स्कैन प्राप्त । पुनरावृत्ति समय सेट करें (TR) करने के लिए ३,००० ms और प्रतिध्वनि समय (ते) करने के लिए ४० ms. दृश्य (FOV) के क्षेत्र के रूप में 18 मिमी x 18 मिमी का उपयोग करें, और लगभग 10 मिनट में 18 मिमी x ०.८ मिमी और तीन संकेत औसत के स्लाइस के साथ एक २५६ x २५६ अधिग्रहण मैट्रिक्स प्राप्त करते हैं ।
    4. प्रसार दसियों छवियों (DTI) एक तेजी से स्पिन-इको अनुक्रम का उपयोग कर प्राप्त । १,७३० ms करने के लिए टी. आर. सेट ते ३५ ms, FOV 20 मिमी x 20 मिमी, और 16 मिमी x 1 मिमी के स्लाइस के साथ एक १२८ x १२८ अधिग्रहण मैट्रिक्स प्राप्त करते हैं, दो संकेत औसत, 14 प्रसार दिशाओं एंकोडिंग, और एक अधिकतम b-मान १,०२४ s/
    5. टी 2-भारित छवियों पर LV एक छवि प्रदर्शन और मापने सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर उपाय । घाव क्षेत्र को मापने, कुल घाव की मात्रा की गणना करने के लिए एक साथ मूल्यों collating, जबकि खाते में एमआरआई टुकड़ा मोटाई (एमआरआई स्कैन के दौरान सेट) ले रही है ।
    6. पूर्ण contralateral और ipsilateral गोलार्द्धों को मापने के दौरान किसी भी सूजन और क्षेत्र के घावों की मात्रा का प्रतिशत ध्यान में रखें । किसी भी मस्तिष्क सूजन के लिए सही एक अप्रत्यक्ष विधि का उपयोग कर के रूप में घाव की मात्रा को मापने के लिए पहले से ही वर्णित21,22। केवल एक मानक माउस मस्तिष्क एटलस के अनुसार प्रांतस्था ऊतक और नहीं ललाट पालि या सेरिबैलम ऊतक होते है कि स्लाइस शामिल करने के लिए अधिक से अधिक सुधार ।
  2. घाव प्रसार मापदंडों को मापने और ब्याज की कोर और penumbra क्षेत्रों प्राप्त करते हैं ।
    1. उचित एमआरआई विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रसार दसियों छवियों से स्पष्ट प्रसार गुणांक (ADC) और आंशिक anisotropy (एफए) नक्शे उत्पन्न.
    2. टी 2-भारित छवियों के एक रैखिक पंजीकरण प्रदर्शन करने में सक्षम उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चित्रों के साथ DTI छवियों संरेखित करें । पंजीकरण के बाद, penumbra क्षेत्र का अनुमान लगाने के लिए टी-भारित घावों मास्क (कोरोनरी कोर और penumbra) से प्रसार भारित घावों मास्क (कोरोनरी कोर) घटाना । परिणामी मास्क (कोर और penumbra) लागू करने के लिए ADC और एफए नक्शे कोर और penumbra के भीतर प्रसार मापदंडों को बढ़ाता है.
    3. ipsilateral कोर और मस्तिष्क midline के बारे में penumbra मास्क का अनुवाद करने के लिए contralateral ADC प्राप्त करने के लिए और तुलना के लिए एफए मूल्यों ।

Representative Results

सर्जरी के समय 24 – 31 जी के बीच वजनी कुल 24 व्यस्क पुरुष C57BL/6 चूहों का अध्ययन में उपयोग किया गया । एक जानवर के बाद मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) मर गया और एक शल्य चिकित्सा जटिलताओं के कारण बाहर रखा गया था । यहां प्रस्तुत आंकड़ों को लेखकों द्वारा पहले से प्रकाशित काम से लिया जाता है । ये MCAO परिणाम11पर पोत की मरंमत के प्रभाव वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । सभी डेटा के रूप में के रूप में व्यक्त कर रहे है डेटा सांख्यिकीय D'Agostino-पियरसन सर्वग्राही सामान्यीकृत परीक्षण का उपयोग कर सामांय के लिए मूल्यांकन किया गया । पैरामीट्रिक डेटा की तुलना छात्र के टी-टेस्ट (दो अर्थों के लिए) और Sidak टेस्ट (मल्टीपल अर्थ) के साथ एक-तरफा ANOVA से की गई । नॉन-पैरामीट्रिक डेटा की तुलना मान-Whitney यू टेस्ट के इस्तेमाल से की गई । पैरामीट्रिक डेटा की परिवर्तनशीलता का मूल्यांकन एक F-परीक्षण का उपयोग करके किया गया था, और Levene के परीक्षण का उपयोग करके गैर-पैरामीट्रिक डेटा परिवर्तनशीलता का मूल्यांकन किया गया था ।

सामान्यतया, MCAO प्रक्रियाओं में, occluding रेशा सीसीए में डाला जाता है और ECA ECA के बजाय ICA में गुजरने से इस रेशा को रोकने के लिए ligated है । ECA बंधाव के एक परिहार और analgesia के अलावा ४८ एच पोस्ट में कम वजन घटाने की ओर एक प्रवृत्ति दिखाई MCAO, जब पिछले अध्ययनों से एक ही MCAO समय के लिए एक ही सर्जन द्वारा किए गए के आंकड़ों की तुलना में कोई ECA के साथ बंधाव analgesia का उपयोग कर, जबकि एल. वी. अप्रभावित दिखाई दिया, चित्र 1देखें ।

चूहों एक ६० मिनट MCAO प्रेरित ischemia सीसीए पोत की मरंमत के साथ या सीसीए दृष्टिकोण के ठेठ बंधाव के साथ reperfusion द्वारा पीछा किया गया । ligated और unligated मरंमत सीसीए का एक योजनाबद्ध चित्र 2में दिखाया गया है ।

लेजर डॉपलर flowmetry MCAO पर एमसीए के क्षेत्र में रक्त प्रवाह छिड़काव की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, पहले और बाद सीसीए पोत की मरंमत । चित्र 3 दर्शाता है कि 5 मिनट रेशा हटाने के बाद, क्षेत्रीय मस्तिष्क रक्त प्रवाह (rCBF) काफी एमसीए के मस्तिष्क क्षेत्र में वृद्धि हुई है । छिड़काव पोत मरंमत करने के लिए बनाए रखा गया था, छिड़काव में वृद्धि के साथ MCA सीसीएल पोत की मरंमत के बाद दिखाया क्षेत्र को, सुझाव है कि सीसीए मरंमत की अनुमति एक वृद्धि हुई रक्त छिड़काव कोरोनरी क्षेत्र के लिए पर निर्भरता की तुलना में अकेले विलिस का गोला ।

टी 2-भारित एमआरआई कुल lv निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और DTI स्कैन MCAO के बाद कोर lv, ४८ ज निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चित्रा 4a सुधार और ligated प्रक्रिया समूहों के बीच कुल या कोर LV में कोई महत्वपूर्ण अंतर से पता चलता है. तथापि, दोनों के लिए डेटा परिवर्तनशीलता कुल और कोर LV, के रूप में गैर के लिए Lavene परीक्षण का उपयोग कर मूल्यांकन-पैरामीट्रिक या पैरामीट्रिक डेटा के लिए एफपरीक्षण, सीसीएल मरंमत समूह के भीतर काफी कम था । कुल LV cortical और subcortical lv में टूट गया था, जैसा कि चित्रा 4Bमें दिखाया गया है । cortical भाग सीसीए मरंमत समूह में काफी कम चर रहा था, जबकि उप-cortical भाग के घावों के दो प्रक्रियात्मक समूहों के बीच अप्रभावित था ।

एक शक्ति विश्लेषण संकेत दिया कि उपचार समूह के प्रति कम पशुओं के लिए एक 30% में कमी प्रदर्शित करने के लिए आवश्यक होगा LV निंनलिखित MCAO विशिष्ट सीसीए-ligated प्रक्रिया बनाम सीसीए मरंमत का उपयोग कर, 1 तालिकादेखें । 1 पावर की एक धारणा-β = ०.८ और माहात्म्य स्तर α = ०.०५ और काल्पनिक नियंत्रण और परीक्षण समूहों के बीच LV में 30% की कमी की भविष्यवाणी शक्ति विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया. इसके अलावा, एक समान प्रसरण समूहों के बीच मान लिया गया था । तालिका 1 परीक्षण और नियंत्रण समूह के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या दिखाता है जब या तो विशिष्ट सीसीए-ligated विधि का उपयोग किया जाता है या अद्यतन किए गए सीसीए मरंमत विधि, जैसा कि यहां वर्णन किया गया है । ध्यान दें कि परीक्षण समूह जानवरों के एक काल्पनिक स्वास्थ्यकर्मी समूह को संदर्भित करता है और नियंत्रण समूह एक काल्पनिक नियंत्रण समूह को संदर्भित करता है; दोनों गुटों को MCAO से गुजरना होगा.

Figure 1
चित्रा 1: संयुक्त analgesia उपचार और MCAO निंनलिखित परिणामों पर ECA बंधाव की चूक । (एक) शरीर के वजन, पूर्व MCAO वजन के एक प्रतिशत के रूप में दिखाया गया है, दोनों समूहों के लिए MCAO के बाद पहली 2 डी में कमी आई । ECA-unligated समूह (analgesia-बंधाव में कोई ECA MCAO के साथ इलाज) MCAO के बाद दूसरे दिन कम वजन घटाने की ओर एक प्रवृत्ति दिखाया । (ख) इस पैनल के MCAO के बाद मानक triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला ४८ एच द्वारा मापा घाव की मात्रा (मिमी3) से पता चलता है. दिखाया गया डेटा मतलब ± मानक विचलन कर रहे हैं । ECA ligated: n = 17, ECA unligated: n = 10. यह आंकड़ा Trotman-लुकास एट अल से संशोधित किया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: योजनाबद्ध मानक सीसीए विधि दिखा रहा है और वैकल्पिक सीसीए की मरंमत विधि निंनलिखित MCAO । (क) इस योजनाबद्ध एक स्थाई रूप से ligated सीसीए गैर dissolvable सीसीए चीरा के दोनों ओर से लागू टांके का उपयोग कर, सही सीसीए के स्थाई बंधाव में जिसके परिणामस्वरूप चित्रित किया । (ख) इस योजनाबद्ध वैकल्पिक सीसीए की मरम्मत पद्धति को दर्शाया गया है. फाइब्रिनोजेन और thrombin सीलेंट के साथ लेपित एक छोटे ऊतक पैड सीसीए चीरा को कवर करने के लिए प्रयोग किया जाता है, यह सही सीसीए की पूर्ण छिड़काव अनुमति देने के लिए सील. यह आंकड़ा Trotman-लुकास एट अल से संशोधित किया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: क्षेत्रीय मस्तिष्क रक्त प्रवाह (rCBF) MCAO निंनलिखित मापदंडों । rCBF के दौरान मापी गई MCAO के सापेक्ष सीसीएल-ligated और सीसीए-रिपेयर्ड ग्रुप (पोस्ट-MCAO) दोनों के लिए MCAO रेशा हटाने के बाद rCBF 5 मिनट बदल गया । यह पैनल सीसीएल पोत मरम्मत (पूर्व मरम्मत) और 5 मिनट बाद सीसीएल मरम्मत (रिपेयर) के बाद rCBF डाटा को तुरंत दिखाता है । rCBF में महत्वपूर्ण वृद्धि दोनों समूहों में रेशा हटाने (पोस्ट-MCAO) के बाद 5 मिनट दिखाए जाते हैं । rCBF में एक अतिरिक्त वृद्धि सीसीए सुधार (पोस्ट-मरंमत) के बाद सीसीएल मरंमत समूह में दिखाया गया है । rCBF में कोई अंतर नहीं 5 मिनट के बाद MCAO और पूर्व मरंमत के बीच दिखाया गया है । दिखाया गया डेटा विश्लेषण समय-पाठ्यक्रम डेटा रिपोर्टिंग कुंजी समय बिंदुओं से गाढ़ा कर रहे हैं, यहाँ मतलब ± मानक विचलन के रूप में. सीसीए ligated: n = 10, सीसीए मरंमत: n = 10; * *p < ०.०१, * * *p < ०.००१, ns: गैर-महत्वपूर्ण । यह आंकड़ा Trotman-लुकास एट अल से संशोधित किया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एमआरआई तकनीक द्वारा प्राप्त घावों की मात्रा का विश्लेषण । (क) इस पैनल से पता चलता है कि घाव की मात्रा (LV; mm3) at ४८ h म् MCAO, टी 2 से ली गई कुल lv-भारित एमआरआई छवियों (कुल lv), और कोर lv से लिया DTI स्कैन और विश्लेषण (कोर lv) । प्रतिनिधि छवियों DTI कोर घाव मात्रा मुखौटा लागू के साथ एक टी 2 स्कैन स्लाइस छवि से कुल घाव की मात्रा को दिखाते हैं । समूहों के भीतर परिवर्तनशीलता दोनों कुल lv के लिए काफी कम था (पी = ०.०१५, सीसीए मरंमत: n = 10, सीसीए ligated: n = 10, एफपरीक्षण) और कोर LV (p = ०.०४३, सीसीए मरंमत: n = 9, सीसीए ligated: n = 6, Lavene का परीक्षण), गैर-पैरामीट्रिक डेटा के लिए पैरामीट्रिक डेटा या Levene के परीक्षण के लिए F-परीक्षण का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया । (ख) इस पैनल से पता चलता है ४८ एच पर LV निंनलिखित MCAO, टी 2 से लिया-भारित एमआरआई छवियों और cortical और subcortical घावों क्षेत्रों में विभाजित है । सीसीए मरम्मत काफी कम डेटा परिवर्तनशीलता (P = ०.०३, F-परीक्षण) cortical भाग में घाव, लेकिन subcortical भाग में डेटा परिवर्तनशीलता पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया गया था । सीसीए मरंमत: n = 10, सीसीए ligated: n = 10 । दिखाया गया डेटा मतलब ± मानक विचलन कर रहे हैं । # p < ०.०५ (F-test), xp < ०.०५ (Lavene ' s test). यह आंकड़ा Trotman-लुकास एट अल से संशोधित किया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

दृष्टिकोण घाव की मात्रा
(LV; mm3; मतलब ± s.d.)		 शक्ति माहात्म्य तर Anticiapted अंतर समूह आकार आवश्यक
सीसीए Ligated (पारंपरिक दृष्टिकोण) ९४.०८ ± ५३.७९ ०.८ ०.०५ 30 n = ५८
सीसीए मरंमत (नया दृष्टिकोण) ५१.७३ ± २२.७८ ०.८ ०.०५ 30 n = ३५

तालिका 1: प्रतिनिधि शक्ति वैकल्पिक सीसीए की मरंमत विधि के साथ पारंपरिक सीसीए बंधाव की तुलना यहां समझाया । यह तालिका एक नियंत्रण समूह, पारंपरिक या वैकल्पिक (नया) दृष्टिकोण, और एक परीक्षण समूह (अनुमानित) के बीच LV में एक महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने के लिए आवश्यक प्रत्याशित समूह आकार की गणना करने के लिए किए गए विद्युत विश्लेषण से पता चलता है । तालिका ०.८ की एक शक्ति मान लिया जाता है, तो आवश्यक के रूप में समूह आकार दिखाता है, ०.०५ का एक महत्व स्तर लागू किया जाता है, और यदि अनुमानित परीक्षण समूह में 30% अंतर से पता चलता है कि नियंत्रण समूह में LV की तुलना में । तालिका दोनों MCAO दृष्टिकोण (सीसीए-ligated और सीसीए-मरंमत) के लिए परिणाम दिखाता है कि वहां के लिए अगर एल. वी. में 30% अंतर हासिल करने के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या में कोई अंतर है निर्धारित करने के लिए । दोनों विधियों के लिए एक बराबर प्रसरण परीक्षण और नियंत्रण समूह के बीच मान लिया है । यह आंकड़ा Trotman-लुकास एट अल से संशोधित किया गया है । 11.

Discussion

यह नैदानिक कोरोनरी स्ट्रोक7के बाद की घटनाओं की नकल उतार, प्रभावित क्षेत्र के लिए reperfusion की अनुमति देता है के रूप में कुतर में परिवर्तनीय MCAO के रेशा प्रेरण सबसे अक्सर इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल है । यहां रिपोर्ट चूहों में रेशा प्रेरित क्षणिक MCAO की पारंपरिक विधि के लिए एक वैकल्पिक शल्य दृष्टिकोण है । वैकल्पिक दृष्टिकोण, analgesia उपचार, ECA बंधाव परिहार शामिल है, और सीसीए चीरा मरंमत, एक कम LV परिवर्तनशीलता में परिणाम जब दोनों एमआरआई और ऊतकवैज्ञानिक के तरीके11धुंधला का उपयोग कर आकलन किया ।

पारंपरिक दृष्टिकोण MCAO प्रेरित करने के लिए काफी हद तक transection पर भरोसा करते हैं, या ECA है, जो चूहों में, दिखाया गया है की कम से बंधाव, पीने के व्यवहार को प्रभावित करने के लिए और शरीर के वजन में वृद्धि MCAO14के बाद नुकसान. यहां परिभाषित प्रोटोकॉल, चूहों में, ECA बंधाव और analgesia अलावा के परिहार के साथ, घाव की मात्रा पर कोई प्रभाव के साथ MCAO के बाद शरीर के वजन घटाने में कमी का सुझाव दिया । analgesia के उपयोग से बचा जाता है, या कम नहीं रिपोर्ट प्रयोगात्मक स्ट्रोक अध्ययन के बहुमत में, प्रयोगात्मक परिणाम पर संभव पाया प्रभाव के कारण. हालांकि, analgesia से परहेज करना हमेशा उचित नहीं है और वैज्ञानिक उद्देश्यों की उपलब्धि के साथ पशुओं की कल्याणकारी जरूरतों को संतुलित करने की जरूरत है ।

पशु का आकार, तनाव में अंतर, और मस्तिष्कवाहिकीय शरीर रचना विज्ञान, रेशा आकार और प्रकार रूपों के अलावा, सभी स्ट्रोक23,24परिणामों को प्रभावित करने के लिए सुझाव दिया है । वैकल्पिक दृष्टिकोण यहां वर्णित reperfusion के दौरान गाय पर निर्भरता से बचा जाता है, इस प्रकार कम, कुछ हिस्से में, परिवर्तनशीलता घावों की मात्रा में पशुओं के बीच देखा । गाय एनाटॉमी चूहों में अत्यधिक परिवर्तनशील है, विशेष रूप से C57BL/6 तनाव में, जो अक्सर प्रयोगात्मक स्ट्रोक अध्ययन में प्रयोग किया जाता है । C57BL/6 चूहों के ९०% एक अधूरी धमनी (PcomA) प्रत्यक्षता, जो कोरोनरी के बाहर संरचनाओं के अपर्याप्त छिड़काव के कारण क्षति की मात्रा पर एक प्रभाव हो सकता है संचार के पीछे के कारण गाय है13एमसीए क्षेत्र, 25. चूहों में सीसीए की मरंमत, जैसा कि यहां दिखाया गया है, सीसीए के द्वारा रक्त प्रवाह की पुनः स्थापना में कोरोनरी क्षेत्र में परिणाम, के रूप में पहले चूहों में वर्णित15। यहां के प्रतिनिधि आंकड़ों से बताते हैं कि सीसीएल की मरम्मत reperfusion बढ़ जाती है, हालांकि सीसीएल में रक्त का प्रवाह सीधे मापा नहीं गया । हालांकि, यह सर्जन के लिए संभव है पोत की मरंमत के बाद रक्त के साथ सीसीए reperfuse कल्पना, के रूप में यह एक स्पंदन और पूर्ण राज्य के लिए सभी ट्रंक, समीपस्थ और मरंमत स्थान के बाहर के साथ वापस । कोरोनरी क्षेत्र के लेजर डॉपलर flowmetry रीडिंग के साथ इस दृश्य पुष्टि, पोत के सफल मरम्मत की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ऊतक पैड आवेदन और सीसीए से पोत क्लिप को हटाने के बीच का समय सीसीए के परिणामी प्रत्यक्षता पर प्रभाव हो सकता है, के रूप में ऊतक पैड आवेदन और क्लिप हटाने के बीच समय को कम करने के लिए ओ का पालन करने से ऊतक पैड को रोकने जाएगा सीसीएल की ओर से pposite । हालांकि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, वैकल्पिक MCAO प्रक्रिया यहां समझाया चूहों में MCAO के सर्जिकल प्रेरण प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक उन से किसी भी अतिरिक्त कौशल की आवश्यकता नहीं है ।

परंपरागत रूप से परिणाम के उपायों में एक उच्च परिवर्तनशीलता के साथ जुड़े, प्रयोगात्मक स्ट्रोक अध्ययन एक प्रवृत्ति हो सकता है के लिए शक्ति हो । नैतिक और आर्थिक और व्यावहारिक चिंताओं के साथ संयोजन में कल्याणकारी आवश्यकताओं को बढ़ावा दिया जा रहा अध्ययन में योगदान कर सकते हैं । परिणाम में परिवर्तनशीलता को कम करने और, इसलिए, एक प्रयोगात्मक समूह में और अधिक सुसंगत घावों के परिणाम के उत्पादन, और अधिक प्रभावी शक्ति गणना उचित संचालित किया जा रहा अध्ययन के अंतिम उद्देश्य के साथ किया जा सकता है ।

अंत में, इस वैकल्पिक सीसीए की मरंमत की प्रक्रिया, चूहों में, प्रयोगात्मक स्ट्रोक के बाद घाव मात्रा में कम परिवर्तनशीलता में परिणाम और सक्षम बनाता है छोटे प्रयोगात्मक समूहों के लिए एक इलाज के प्रभाव के परीक्षण के लिए आवश्यक हो जब उचित बिजली गणना उपयोग किया जाता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य के लिए राष्ट्रीय केंद्र द्वारा वित्त पोषित किया गया था प्रतिस्थापन, शोधन और अनुसंधान में पशुओं की कमी (NC3Rs; M000117/1 से तटरक्षक) नेकां । लेखक जैव चिकित्सा सेवा, लीसेस्टर विश्वविद्यालय के विभाजन के कर्मचारियों को धंयवाद, प्रयोगात्मक पशुओं और उसके सांख्यिकीय सलाह के लिए मारिया Viskaduraki की उनकी देखभाल के लिए । प्रतिनिधि परिणाम रोग मॉडल &11तंत्र से अनुमति के साथ अनुकूलित कर रहे हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.7 mm flexible single fibre optic probe Moor Instruments, UK P10d Use with master probe code: VP10M200ST
7-0 silicone coated monofilament Doccol, USA 701956PKRe Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article.
9.4T Preclinical MRI system Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA MY11520101 Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging
Animal monitoring and gating equipment SA Instruments, Stony Brook, New York, USA 22124005 MRI compatible temperature and respiration monitoring
Bupivacaine National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK 512345 Marcaine
C57BL/6 Mice Charles River, Oxford, UK B6JSIMA49D
Carprofen Norbrook Laboratories 143658 Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution VWR International Ltd, Lutterworth, UK MOLN10008780 HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care
Cotton buds National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK 213512 Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving.
Dissecting stereoscope Carl Zeiss OPMI99 Resident piece of equipment.
Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable.
dissolvable 6-0 sutures National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK 9544 Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981)
Donut probe holder Moor Instruments, UK PHDO Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine.
dumont #5 forceps World Precision Instruments, Hertfordshire, UK 500342
Fibrinogen and thrombin sealant Baxter, Berkshire, UK 1502243 TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL
Gel food Datesand group, Manchester, UK 72065022 Diet Gel Recovery
Image display and measuring software package 3D Slicer https://www.slicer.org/ Version 4.0
Image display and measuring software package NIH, Maryland, USA https://imagej.nih.gov/ij/index.html NIH/ImageJ
LDF monitor Moor Instruments, UK moorVMS-LDF
micro vannas scissors InterFocus Ltd, Linton, UK 15000-08 Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required.
Microvascular clip World Precision Instruments, Hertfordshire, UK 15911 10 G Vessel Clip
microvascular clip holders World Precision Instruments, Hertfordshire, UK 14189
MRI acquisition and analysis software Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA VnmrJ Version 4.2 Revision A
no. 15 scalpel Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK INS4678 Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available.
Non-disolvable 6-0 suture National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK W529 Ethicon Mersilk Sutures
Ocular lubricant National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK 847288 Lacrilube (5100G13)
Optical matching gel Moor Instruments, UK PMG
Pulse Oximetry Reader Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA MouseOx MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor
Use with mouse thigh sensor.
Rehydration gel Datesand group, Manchester, UK 70015022 HydroGel
Small hair clippers vetproductsuk.com HS61 Contura Cordless trimmer/clippers
Sterile 0.9 % NaCl Solution VWR International Ltd,
Lutterworth, UK		 LOCA3528286 SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS
sterile Petri dish VWR International Ltd, Lutterworth, UK 5168021 50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required.
Topical tissue adhesive World Precision Instruments, Hertfordshire, UK 503763 GLUture topical Tissue Adhesive
Waterproof superglue Loctite Loctite Superglue Precision Max Available at most hardware shops.
White paper chip Datesand group, Manchester, UK CS1BPB Pure-O'Cel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Collins, V. E., et al. 1,026 Experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
  2. Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for Ischaemic Stroke: Translation from the Bench to the Bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
  3. Reeves, M. J., et al. Acute Stroke Care in the US: Results from 4 Pilot Prototypes of the Paul Coverdell National Acute Stroke Registry. Stroke. 36 (6), 1232-1240 (2005).
  4. Wardlaw, J. M., Murray, V., Berge, E., del Zoppo, G. J. Thrombolysis for acute ischaemic stroke. Cochrane Database of Systematic Reviews. (7), CD000213 (2014).
  5. Pangalos, M. N., Schechter, L. E., Hurko, O. Drug development for CNS disorders: strategies for balancing risk and reducing attrition. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (7), 521-532 (2007).
  6. Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathologica. 47 (3), 213-227 (2009).
  7. Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-289 (1992).
  8. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: Size, mechanism, and purpose. NeuroRX. 2 (3), 396-409 (2005).
  9. Dirnagl, U. Bench to Bedside: The Quest for Quality in Experimental Stroke Research. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26 (12), 1465-1478 (2006).
  10. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6, 21086 (2016).
  11. Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
  12. Macrae, I. M. Preclinical stroke research - advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1062-1078 (2011).
  13. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Research. 997 (1), 15-23 (2004).
  14. Trueman, R. C., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Translational Stroke Research. 2 (4), 651-661 (2011).
  15. Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Experimental Neurology. 195 (2), 372-378 (2005).
  16. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. Plos Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
  17. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-479 (2010).
  18. Orsini, F., et al. Targeting Mannose-Binding Lectin Confers Long-Lasting Protection With a Surprisingly Wide Therapeutic Window in Cerebral Ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
  19. Simoni, M. G. D., et al. Neuroprotection by Complement (C1) Inhibitor in Mouse Transient Brain Ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 23 (2), 232-239 (2003).
  20. Clark, W., Gunion-Rinker, L., Lessov, N., Hazel, K. Citicoline Treatment for Experimental Intracerebral Hemorrhage in Mice. Stroke. 29 (10), 2136-2140 (1998).
  21. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of Brain Edema on Infarct Volume in a Focal Cerebral-Ischemia Model in Rats. Stroke. 24 (1), 117-121 (1993).
  22. Loihl, A. K., Asensio, V., Campbell, I. L., Murphy, S. Expression of nitric oxide synthase (NOS)-2 following permanent focal ischemia and the role of nitric oxide in infarct generation in male, female and NOS-2 gene-deficient mice. Brain Research. 830 (1), 155-164 (1999).
  23. Connolly, E. S., Winfree, C. J., Stern, D. M., Solomon, R. A., Pinsky, D. J. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
  24. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse Strain Differences in Susceptibility to Cerebral Ischemia are Related to Cerebral Vascular Anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  25. Kitagawa, K., et al. Cerebral Ischemia after Bilateral Carotid Artery Occlusion and Intraluminal Suture Occlusion in Mice: Evaluation of the Patency of the Posterior Communicating Artery. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).

Tags

चिकित्सा १४३ अंक तंत्रिका विज्ञान स्ट्रोक क्षणिक MCAO मस्तिष्क ischemia मध्यम मस्तिष्क धमनी
मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा की अनुमति Reperfusion के माध्यम से आम मन्या धमनी की मरंमत चूहों में
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E.,… More

Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Gibson, C. L. Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice. J. Vis. Exp. (143), e58191, doi:10.3791/58191 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter