Summary
L'occlusione di filamento intraluminal dell'arteria cerebrale centrale è il modello più utilizzato in vivo di colpo sperimentale nei roditori. Approccio chirurgico alternativo per consentire la riparazione dell'arteria carotica comune avviene qui, che permette la riperfusione dell'arteria carotica comune e un completo riperfusione nel territorio dell'arteria cerebrale media.
Abstract
L'ictus ischemico è delle principali cause di disabilità a lungo termine adulto e morte in tutto il mondo. I trattamenti correnti disponibili sono limitati, con solo attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) come trattamento farmaco approvato per indirizzare i colpi ischemici. La ricerca attuale nel campo del colpo ischemico si concentra sulla migliore comprensione della patofisiologia del colpo, per sviluppare e studiare nuovi target per la farmaceutica. Modelli di colpo sperimentale affidabile sono cruciali per la progressione di potenziali trattamenti. Il modello di occlusione (MCAO) dell'arteria cerebrale centrale è clinicamente rilevante e il più delle volte usato modello chirurgico del colpo ischemico in roditori. Tuttavia, i risultati di questo modello, come il volume della lesione, sono associati con alti livelli di variabilità, in particolare nei topi. Il modello MCAO alternativo descritto qui permette la riperfusione dell'arteria carotica comune (CCA) e l'aspersione aumentata del territorio dell'arteria cerebrale centrale (MCA), utilizzando un pad di tessuto con sigillante a base di fibrinogeno per riparare la nave ed il miglioramento della benessere dei topi evitando la legatura dell'arteria carotica esterna (ECA). Questo riduce la dipendenza del cerchio di Willis, che è noto per essere altamente anatomicamente variabile nei topi. Dati rappresentativi indicano che usando questo metodo chirurgico alternativo fa diminuire la variabilità in volumi di lesione tra l'approccio MCAO tradizionale e l'approccio alternativo descritto qui.
Introduction
Delle principali cause di ictus cerebrale è ischemia focale nel territorio dell'arteria cerebrale centrale. Attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) è il trattamento farmacologico solo disponibile con efficacia provata, nonostante numerosi esperimenti clinici mirati a colpo ischemico1,2. Tuttavia, a causa di problemi di sicurezza e una ristretta finestra terapeutica (< 4,5 h), solo ~ 15% di tutti i pazienti colpiti da ictus sono idonei a ricevere tPA e i tassi di ricanalizzazione possono essere < 50%3,4.
Riproducibile e clinicamente rilevanti modelli animali del colpo sono considerati essenziali per informare lo sviluppo di trattamenti terapeutici di tempi nuovi e potenziali. Tuttavia, a causa di preoccupazioni per quanto riguarda la coerenza e la variabilità nei risultati con modelli animali, rimane importante affinare i modelli esistenti in vivo per migliorare la traduzione da studi preclinici per la clinica. La mancanza di traduzione dall'efficacia sperimentale preclinica di potenziali trattamenti per uso clinico è una preoccupazione costante per corsa ricerca5. Ragioni del fallimento della traduzione sono probabili essere più e possono essere correlati, ad esempio, la progettazione dello studio, ritardi di trattamento, eterogeneità clinica dell'ictus, e le limitazioni dei modelli animali utilizzati6. Una sfida chiave per la ricerca sull'ictus rimane lo sviluppo di trattamenti sicuri ed efficaci.
Occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) tramite l'inserzione di filamento intraluminal è il modello del roditore utilizzate più di frequente in vivo di colpo sperimentale. Questo modello permette il ripristino del flusso sanguigno dopo un'induzione di ischemia, che imita gli eventi che si verificano nel tratto umano7. Tuttavia, in particolare nei topi, volumi di lesione eterogenea con varie deviazioni standard si verificano anche se definito protocolli chirurgici sono applicate8,9,10. È tipico per vedere una distribuzione bimodale di striatal piccolo e grande lesione striato-corticali volumi11. Per indurre l'ischemia, il filamento viene in genere inserito attraverso un'incisione del CCA o ECA che poi rimangono permanentemente legato12. La legatura permanente del CCA previene il ristabilimento del flusso sanguigno nell'arteria carotica interna (AIC) e, successivamente, il territorio MCA. In questo modo riperfusione essere affidamento su rifornimento collaterale all'interno del cerchio di Willis (mucca). La struttura di mucca ha variabilità anatomica tra singoli animali, particolarmente in C57BL/6 topi-un ceppo in genere utilizzato in vivo corsa ricerca13. Un metodo alternativo, di inserimento di filamento attraverso l'ECA, consentire la perfusione continua attraverso il CCA, ma compromessi questo metodo il rifornimento arterioso per il territorio ECA, che ha dimostrato, nei ratti, di avere un effetto negativo sull'animale benessere14.
L'affidamento sulla mucca per rifornimento collaterale e la riperfusione nel modello di MCAO stabilito può, in parte, spiegare la variabilità del volume di lesione dopo l'occlusione. Descriviamo una procedura chirurgica murina alternativa dove la legatura ECA è evitata e l'incisione di CCA è riparata, permettendo così di riperfusione attraverso il CCA, indipendente della mucca. La riparazione dell'incisione CCA precedentemente è stata indicata in ratti per provocare una riperfusione di successo attraverso il CCA15. Abbiamo applicato questo approccio con successo in topi11 e riferire qui il protocollo che si traduce in una ridotta variabilità nel volume della lesione, la misura di esito principale utilizzata negli studi di colpo sperimentale.
In questo protocollo, dimostriamo come intraprendere MCAO attraverso l'inserimento di filamento nave CCA seguita dalla riparazione del vaso CCA, che coinvolge un'applicazione di pad e sigillante di tessuto a consentire di riperfusione.
Protocol
Il presente protocollo e i dati riportati sono stati condotti in conformità con l'atto di UK animali (procedure scientifiche), 1986 (licenza di progetto 60/4315) e a seguito di approvazione etica istituzionale. Tutti gli esperimenti sono presentati in conformità con la ricerca animale: Reporting di In Vivo esperimenti (arrivo) linee guida16.
1. preparazione
- Familiarizzare i topi C57BL/6 maschio adulto di cure post-operatorie (ad es., ambiente, biancheria da letto, gli alimenti recupero) almeno 48 h prima della chirurgia.
Nota: Gli animali Post-MCAO hanno spesso difficoltà a mangiare e bere a seguito della chirurgia.- Per evitare la perdita di peso eccessivo dopo la chirurgia, acclimatare gli animali a qualsiasi dieta post-MCAO di, ad esempio, immissione di reidratazione gel, gel di cibo e pellet di dieta normale bagnato/umido direttamente sul pavimento della gabbia.
- Cambiare la biancheria da letto di gabbia per biancheria da letto post-operatoria, come chip di carta bianca.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima di iniziare il set-up chirurgici o procedure.
- Eseguire questa operazione in autoclave degli strumenti (con un minimo di 121 ° C, 15 psi, per 15 min) o attraverso l'uso di ossido di etilene (seguendo le istruzioni del produttore corretto, per 8-10 h).
- Disinfettare tutte le superfici prima di impostare la procedura. Coprire tutte le superfici con teli chirurgici sterili o lamina in autoclave per articoli che richiedono una gestione durante l'intervento chirurgico. Usare una tecnica asettica per tutta la durata della procedura.
Nota: In autoclave lamina utilizzabile per coprire gli strumenti o attrezzature che devono essere tenuti durante l'intervento chirurgico. Utilizzando tecniche e guanti sterili, la pellicola può essere applicata e, quindi, è possibile posizionare l'elemento nel campo sterile. In seguito, un cambiamento di guanto sterile sarà richiesto.
2. arteria cerebrale occlusione chirurgia
- Utilizzare topi C57BL/6 maschio adulto 24 – 31 g di pesatura al momento dell'intervento chirurgico. Inducono anestesia utilizzando 5% isoflurane in 2 L/min di O2, in un alloggiamento di plastica rosso di anestesia.
- È possibile ridurre l'induzione, l'isoflurano per mantenere una profondità adeguata anestesia per la chirurgia (per esempio, 1,5 – 2%, 30% O 70% N2O22), consegnata da maschera di protezione combinato con un sistema di scavenger per abbassare il chirurgo esposizione a isoflurano.
Nota: protossido di azoto (N2O2) può essere utilizzato in combinazione con l'ossigeno (O2) per ridurre la quantità necessaria di isoflurane per una profondità di anestesia adeguata. - Amministrare l'analgesia sistemica pre-operatively [carprofen, 10 mg/kg sottocutaneo (SC)] e anestesia locale per l'incisione del sito (bupivacaine, SC. 2 mg/kg, diluito 01:10 in soluzione fisiologica allo 0,9%) peri-attivo.
- Somministrare fluidi di iniezioni intraperitoneali (ip.) di 200 µ l di soluzione di NaCl 0,9% preriscaldata sterile pre-operatively.
- Radere il pelo del diritto regione temporale e regione ventrale del collo utilizzando piccole tagliacapelli per esporre la pelle. Disinfettare la zona di pelle chirurgica, utilizzando una soluzione di clorexidina al 5% per un minimo di 3 applica Oculare lubrificante su entrambi gli occhi, per impedire loro di essiccazione durante l'intervento chirurgico.
Nota: Se richiesto per letture oximetry di impulso per monitor saturazione di ossigeno nel sangue, la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria, utilizzare crema depilatoria per cancellare la gamba posteriore dei capelli. Applicare la crema con cotone pulito germogli e, dopo la depilazione, lavare la zona con la soluzione di clorexidina diluito. Eseguire questo passaggio in una zona pre-operatoria per ridurre al minimo il rischio di pelo libero contaminando il campo operatorio sterile. I ricercatori potrebbero essere preferibile utilizzare altre preparazioni sito chirurgico conformemente agli usi locali. - Trasferire il mouse l'area chirurgica e collocarlo in posizione prona su una stuoia di calore omeotermi coperta da un drappo sterile. Mantenere l'anestesia tramite un cono di naso. Inserire una sonda rettale per controllare la temperatura corporea del mouse e mantenerlo a 37.0 ± 0,6 ° C.
- Prima di qualsiasi incisioni chirurgiche, controllare il riflesso di ritiro della zampa posteriore e blink reflex per confermare la profondità dell'anestesia.
- Collegare una sonda di flussometria di Doppler (LDF) laser per registrare il flusso di sangue nel territorio di MCA.
- Utilizzando uno stereoscopio di dissezione, fare un'incisione di < 1 cm a metà tra l'occhio destro e l'orecchio sulla pelle esposta temporale usando un bisturi n. 15. Senza mezzi termini sezionare il tessuto sottostante che copre il cranio, delicatamente questo raschiare dall'osso e asciugatura della superficie con tamponi di cotone sterile.
Nota: Prestare attenzione a non danneggiare il muscolo di temporalis. - Prendere in mano il 0,7 mm, sonda a fibre ottiche flessibile singolo collegato al monitor LDF, tagliare la sua fine utilizzando un bisturi affilato per ottenere un bordo piatto, spingere questo attraverso la porta sonda a forma di ciambella e mettere una piccola quantità di gel corrispondente ottico all'estremità della fibra.
- Mettere una piccola quantità di colla super-adesivo impermeabile intorno al bordo inferiore del titolare sonda; permettere questo parzialmente asciugare e diventare cattivo gusto.
- Asciugare il cranio sopra l'osso temporale e mettere una piccola quantità di adesivo del tessuto d'attualità in un cerchio all'osso, quel tanto che basta per il portasonda.
- Collocare il supporto per sonda, con la sonda a fibra ottica già in atto, su quest'area (laterale di 6 mm e 2 mm distale dal bregma).
- Attendere che la colla si asciughi; una volta asciutto e annesso, iniziare a registrare i dati LDF.
- Utilizzando uno stereoscopio di dissezione, fare un'incisione di < 1 cm a metà tra l'occhio destro e l'orecchio sulla pelle esposta temporale usando un bisturi n. 15. Senza mezzi termini sezionare il tessuto sottostante che copre il cranio, delicatamente questo raschiare dall'osso e asciugatura della superficie con tamponi di cotone sterile.
- Capovolgere delicatamente l'animale in posizione supina, avendo cura di sostenere la sonda Doppler laser e prevenire il distacco. Delicatamente il nastro le due zampe anteriori giù con nastro medico microporosa, scorrevole un paio di cotone boccioli (o qualcosa di simile, quali pinze chiuse) sotto il collo per sollevare la zona e creare tensione. Coprire il mouse con un telino sterile per mantenere la copertura asettica.
- Iniziare la dissezione e l'esposizione del CCA.
- Fare un'incisione del midline di 1,5 cm sul collo ventrale esposto utilizzando una lama per bisturi n. 15.
- Utilizzando tecniche di dissezione smussa delicato, ritrarre delicatamente le ghiandole salivari ai lati, esponendo la trachea.
- Mediante dissezione smussa, sezionare il CCA gratuito dal tessuto circostante e del nervo vagale.
Nota: Evitare di toccare il nervo vagale direttamente, come danni al nervo vagale possono alterare la mobilità, alimentazione e la respirazione.
- Passare due sezioni di piccole dimensioni (2 cm) di un non-solubile 6-0 suturare sotto il CCA, dorsale alla nave e ventrale del nervo vagale. Disegnare una cravatta di seta più vicino al chirurgo e legarlo strettamente intorno il CCA (prossimale cravatta). Senza stringere legare la cravatta in seta seconda (distale cravatta) verso la biforcazione della ICA/Corte dei conti.
- Per iniziare a isolare una sezione del CCA, applicare una clip microvascolare appena sopra la cravatta distale ma non ostruiscano la biforcazione. Utilizzando micro-forbici Allerød, fare un piccolo buco in CCA.
Nota: La Corte dei conti deve rimanere brevetto in ogni momento. L'incisione di CCA deve essere non più del 40% della larghezza della nave e in posizione ventrale facilmente accessibile; questo giocherà un ruolo importante nella nave riparazione fase post-MCAO. - Inserire un monofilamento di siliconato di 7-0 il CCA, avanzando verso la clip microvascolare.
Nota: La dimensione di filamento deve essere stabilita in base al peso del mouse prima dell'intervento; fare riferimento alle linee guida del produttore.- Stringere la cravatta distale, abbastanza per fissare il filamento in luogo senza danneggiarlo. Rimuovere la clip microvascolare usando supporti clip.
Nota: Nessuna perdita di sangue dovrebbe essere visto a questo punto. Se c'è un riflusso di anima, il legame che tiene il filamento non è abbastanza stretto.
- Stringere la cravatta distale, abbastanza per fissare il filamento in luogo senza danneggiarlo. Rimuovere la clip microvascolare usando supporti clip.
- Avanzare il filamento in ICA.
- Garantire il filamento rimane all'interno di ICA e non passa nell'arteria pterygopalatine (PPA). Farlo leggermente sollevando e tirando il CCA, utilizzando una delle cravatte di seta, sulla parte esterna del corpo dell'animale, e guidare il filamento per piegare oltre l'apertura internamente affiancata del PvP.
Nota: Una volta avanzato all'origine del ramo MCA, una goccia nel flusso sanguigno relativo al territorio fornito sarà visibile sui valori LDF; Questo conferma il posizionamento di filamento.
- Garantire il filamento rimane all'interno di ICA e non passa nell'arteria pterygopalatine (PPA). Farlo leggermente sollevando e tirando il CCA, utilizzando una delle cravatte di seta, sulla parte esterna del corpo dell'animale, e guidare il filamento per piegare oltre l'apertura internamente affiancata del PvP.
- Fissare il filamento a posto con la cravatta di Seta distale, legando questo più stretto. Lasciarla sul posto per tutta la durata dell'occlusione periodo di tempo.
Nota: In funzione su singoli protocolli, l'animale può essere spostato in una gabbia di recupero, segue ferita sutura, per recuperare, o rimanere nell'ambito dell'anestesia per tutta la durata del periodo di occlusione. In quest'ultimo caso, garantire che la ferita viene impedita di essiccazione utilizzando soluzione fisiologica NaCl 0,9% preriscaldato sterile.
3. post-occlusione
- Alla fine del periodo di MCAO, immediatamente ritirare il filamento fino a quando la testa di filamento bianco è chiaramente visibile.
- Quindi, allentare il CCA distale cravatta appena sufficiente a rimuovere il filamento più testa del modo fuori della nave.
Nota: Il filamento può essere completamente rimosso a questo punto se il chirurgo è fiducioso con velocità per annodare la cravatta distale per evitare la perdita di sangue. - Inserire una clip microvascolare in posizione orizzontale verso la biforcazione di CCA accanto la cravatta distale. Allentare la cravatta distale e rimuovere completamente il filamento. Aggiungere un altro clip microvascolare sotto la cravatta CCA prossimale verso il chirurgo.
Nota: Assicurarsi che la nave è abbastanza lontano nei rebbi del morsetto per evitare qualsiasi slittamento. Il posizionamento delle clip è essenziale per garantire un facile accesso per togliere clip durante le fasi successive. Le clip possono essere utilizzate per aiutare a sollevare il vaso per consentire una migliore liquidazione e posizionamento della patch di tessuto, inserire la clip orizzontalmente attraverso i muscoli che circondano. - Con attenzione rimuovere entrambi cravatte di seta utilizzando Dumont #5 pinze o micro-forbici Allerød e asciugare la zona utilizzando bastoncini di cotone sterile.
Nota: Prestare attenzione a non tagliare attraverso/nel recipiente. - In una piastra Petri sterile, aggiungere fibrinogeno e trombina sigillante soluzioni 1 e 2 (Vedi la Tabella materiali), garantendo le due sostanze soggiorno separati, pronto per la miscelazione più tardi.
Nota: Solo piccoli volumi degli agenti sono richiesti (< 0,25 mL ciascuno). Tenere le soluzioni separate impedisce una reazione precoce tra i due costituenti. Assicurarsi che il tappo viene sostituito allo stesso modo come è stato rimosso per evitare la contaminazione incrociata delle due siringhe, che causerebbe l'agente a reagire e all'interno della siringa. Prima dell'uso, conservare le soluzioni a-20 ° C. Quando richiesto per il primo intervento, scongelare il sigillante a temperatura ambiente. Non ricongelare il sigillante; esso deve rimanere a temperatura ambiente e può essere memorizzato in questo modo. La siringa può essere utilizzata attraverso gli ambulatori multipli, rendendo conveniente; Tuttavia, si consiglia di non utilizzare il flaconcino stesso per più di 1 settimana per evitare la contaminazione. - Utilizzare una dissezione smussa lungo il muscolo con Dumont no 5 pinze e le forbici di Allerød micro per ottenere una fetta sottile ventrale del muscolo sternocleidomastoideo da utilizzare per il rilievo di tessuto, garantendo la fetta è non più di 1 mm di spessore e corre lungo le fibre superiore del muscolo.
Nota: Non tagliare attraverso/attraverso il muscolo, in quanto ciò potrebbe compromettere significativamente la sua funzione. Il tessuto deve essere sufficiente a coprire l'incisione di CCA comodamente. - Usando il forcipe Dumont #5, prendere il pad di tessuto e mescolare il tessuto in modo uniforme tra i due del fibrinogeno e trombina sigillante soluzioni, formando un canale tra i due reagenti. Della coagulazione si verifica rapidamente; appena inizia la coagulazione, rimuovere il tampone di tessuto per l'incisione di CCA. Posizionare il cuscinetto di tessuto pianamente giù con una media pressione costante e aperto il forcipe.
- Rapidamente rimuovere la clip microvascolare distale mentre ancora premuto delicatamente il tessuto pad in luogo.
Nota: In questo modo alcuni riflusso di anima per attivare ulteriormente i reagenti di sigillante di fibrinogeno e trombina. Appena sufficiente pressione è necessaria per tenere il pad sul posto ma non di bloccare completamente la nave. - Lentamente ad alleviare la pressione dal tastierino del tessuto, permettendo al sangue di fluire sotto l'area di incisione. Ora, lentamente e delicatamente rilasciare la pressione dalla clip microvascolare prossimale e rimuovere completamente.
- Nota: Al fine di garantire che il vaso diventa completamente brevetto, il posizionamento del pad del tessuto e la rimozione delle clip microvascolare deve avvenire rapidamente per evitare che il cuscinetto di tessuto dalla sigillatura all'interno del CCA. Tuttavia, se c'è una piccola quantità di perdite ematiche, ri-inserire qualche leggera pressione sul blocchetto di tessuto per permettere ulteriore tempo per la formazione di coaguli e tenuta a verificarsi. Se la perdita di sangue è notevole o il pad del tessuto non sembra essere tenuta, mantenere la pressione per evitare la perdita di sangue e sostituire entrambi clip microvascolare di CCA per isolare l'incisione e prevenire l'ulteriore perdita di sangue.
- Rapidamente rimuovere la clip microvascolare distale mentre ancora premuto delicatamente il tessuto pad in luogo.
- Nel caso in cui il pad tessuto non salda alla nave, un secondo tentativo può essere fatto, seguendo passi 3.3 – 3.7.3.
- Una volta che la nave è sigillata, suturare la ferita usando i suturare dissolvable 6-0. Se la registrazione di LDF è stata continuata durante chirurgia, rimuovere il LDF dal cranio e sutura della ferita usando dissolvable sutura 6-0.
4. post-operatorio
- Metti l'animale in una gabbia di recupero preriscaldata (situata su una ripiano/stuoia riscaldata a 35 ° C, o all'interno di una camera riscaldata).
Nota: I ricercatori che preferiscono utilizzare altre temperature e durate conformemente agli usi locali. - Forniscono tutti gli animali con 200 µ l di preriscaldati 0,9% NaCl soluzione salina SC. immediatamente dopo l'intervento, a 4 h post-operazione e 2 x ogni giorno per 72 h.
Nota: L'amministrazione di preriscaldati 0,9% NaCl è animale ha portato. Se più è necessario, più liquidi possono essere amministrati per garantire un buon recupero. - Nella gabbia recupero, dare l'accesso senza restrizioni di animali molliccie dieta pellet, pellet di dieta asciutta, gel di reidratazione e gel di cibo, a fianco ad libitum accesso all'acqua.
- Ripetere l'iniezione di carprofen SC. al post-funzionamento 24 h (Vedi punto 2.3).
Nota: Tutti gli animali hanno ricevuto la stessa dose di carprofen; qualsiasi effetto neuroprotective rischia di essere trascurabile. - A intervalli regolari per 48 h, eseguire smorfia del mouse post-op segnando17 per valutare i livelli di dolore per facilitare la decisione di somministrare ulteriormente l'analgesia.
- Pesare gli animali immediatamente prima della chirurgia e poi ogni giorno seguendo la procedura. Eseguire osservazioni quotidiane e benessere completo lenzuola per monitorare il loro cibo e assunzione di acqua e segni clinici.
- Intraprendere le osservazioni funzionali alle h 24 e 48 h post-operazione. Valutare i topi su una scala di deficit focale. Valutare la loro simmetria del corpo, un cerchietto obbligatoria, andatura, griglia 45° arrampicata, un cerchietto di comportamento, asimmetria degli arti anteriori e Baffo tocco risposta18,19,20.
5. risonanza magnetica ed elaborazione di immagini
- Misurare il volume di lesione (LV) usando la formazione immagine a risonanza magnetica strutturale (MRI).
Nota: Metodi alternativi, come la colorazione istologica con cloruro di triphenyltetrazolium (TTC), sono state precedentemente utilizzate e correlano ai dati MRI strutturali. Tuttavia, questo metodo utilizzabile solo presso il punto finale di uno studio e non longitudinalmente. Utilizzando la scansione MRI longitudinali ridurrà il numero di animali necessari per uno studio.- Dopo 48 h, dopo l'induzione di MCAO, anestetizzare il mouse con isoflurano (5% isoflurane in 1 L/min di O2 per induzione), isoflurane 1,5 – 2% per la manutenzione.
- Trasferire il mouse nella culla di MRI, posizionarlo sul sensore di respirazione per monitorare il tasso di respirazione e impiantare la sonda rettale temperatura per monitorare la temperatura durante la scansione. Posto il cervello di topo 2 canali RF ricevere bobina sopra il cervello per un segnale e posto la culla in un 9,4 T orizzontale del foro dello scanner.
Nota: Qui, una bobina di volume con un diametro interno di 72 millimetri è stata usata per la trasmissione di RF. - Acquisire scansioni di T2-weighted utilizzando una sequenza di eco di rotazione veloce. Impostare il tempo di ripetizione (TR) a 3.000 ms e il tempo di eco (TE) a 40 ms. uso 18 x 18 mm come il campo visivo (FOV) e ottenere una matrice di acquisizione di 256 x 256 con fette di 18 x 0,8 mm e tre medie di segnale in circa 10 min.
- Acquisire immagini di tensore di diffusione (DTI) utilizzando una sequenza di eco di rotazione veloce. Impostare il TR a 1.730 ms, il TE a 35 ms, il FOV a 20 mm x 20 mm e ottenere una matrice di 128 x 128 acquisizione con fette di 16 mm x 1 mm, due segnale medie, 14 diffusione codifica indicazioni e una massima b-valore di 1.024 s/mm2.
- Misurare il LV sulle immagini di T2-weighted utilizza uno schermo di immagine e pacchetto software di misura. Misurare l'area leso, confrontano i valori insieme per calcolare il volume di lesione totale, tenendo conto dello spessore di fetta di MRI (impostato durante l'esplorazione di MRI).
- Prendere in considerazione qualsiasi gonfiore e la percentuale dei volumi di lesione di zona mentre gli emisferi completa controlaterali ed ipsilateral di misura. Corretta per qualsiasi cervello gonfiore dovuto l'edema usando un metodo indiretto per misurare il volume di lesione come descritto in precedenza21,22. Includere solo le sezioni che contengono tessuto di corteccia e non del lobo frontale o cervelletto tessuto secondo un Atlante del cervello del mouse standard per evitare ipercorrezione.
- Misurare i parametri di diffusione di lesione e ottenere il core e penombra regioni di interesse.
- Generare il coefficente di diffusione apparente (ADC) e l'anisotropia frazionaria (FA) mappe dalle immagini del tensore di diffusione utilizzando appropriato software di analisi di MRI.
- Allineare le immagini DTI con le immagini di T2-weighted utilizzando software di analisi di immagine appropriata in grado di eseguire una registrazione lineare delle immagini. Dopo la registrazione, è necessario sottrarre le maschere di lesione diffusione-appesantita (core ischemico) dalle maschere di lesione T2-weighted (core ischemico e penumbra) per stimare la regione di penombra. Applicare le maschere risultante (core e penumbra) alla ADC e FA le mappe per quantificare i parametri di diffusione all'interno del nucleo e la penombra.
- Tradurre il nucleo ipsilateral e le maschere di penombra sulla linea mediana del cervello al fine di ottenere valori di ADC e FA controlaterali per il confronto.
Representative Results
Un totale di 24 topi C57BL/6 maschio adulto, peso compreso tra 24 – 31 g al momento della chirurgia, sono stati utilizzati nello studio. Un animale è morto dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) e uno è stato escluso a causa di complicazioni chirurgiche. I dati qui presentati sono presi da un lavoro precedentemente pubblicato dagli autori. Questi sono stati utilizzati per illustrare l'effetto della riparazione del vaso su MCAO risultati11. Tutti i dati sono espressi come thr media ± deviazione standard. I dati sono stati valutati statisticamente per la normalità con il test di normalità omnibus D'Agostino-Pearson. Dati parametrici sono stati confrontati usando di Student t-test (per due mezzi) e One-way ANOVA con il test di Sidak (mezzi multipli). Dati non-parametrici sono stati confrontati con il test U di Mann-Whitney. La variabilità dei dati parametrici è stata valutata utilizzando un F-prova, e la variabilità dei dati non-parametrica è stata valutata utilizzando il test di Levene.
In genere, nelle procedure di MCAO, il filamento d'occlusione viene inserito il CCA e la Corte dei conti è legato per impedire questo filamento di transito verso la Corte dei conti, piuttosto che la ICA. Un'elusione della legatura di ECA e l'aggiunta di analgesia ha mostrato una tendenza verso la perdita di peso ridotta a 48 h post-MCAO, rispetto ai dati da precedenti studi condotti dallo stesso chirurgo per lo stesso tempo MCAO mediante legatura ECA con nessun analgesia, considerando che il LV sono sembrato inalterati, Vedi Figura 1.
Topi hanno subito un'ischemia indotta da MCAO 60 min seguita da riperfusione con riparazione del vaso CCA o con la legatura tipica dell'approccio CCA. Un disegno schematico del CCA riparato legato e deossiHb è illustrato nella Figura 2.
Flussometria del laser Doppler è stato utilizzato per confermare il flusso aspersione di anima nel territorio del MCA a MCAO, prima e dopo la riparazione del vaso CCA. Nella figura 3 viene illustrato che 5 minuti dopo la rimozione del filamento, il flusso sanguigno cerebrale regionale (rCBF) aumentato significativamente nella regione del cervello del MCA. La perfusione è stata mantenuta fino alla riparazione del vaso, con un aumento della perfusione nel territorio di MCA mostrato dopo la riparazione di nave CCA, suggerendo che la riparazione CCA ha permesso un'aspersione di anima aumentata al territorio ischemico rispetto all'affidamento su il cerchio di Willis da solo.
T2-weighted MRI è stato usato per determinare il totale LV e DTI scansioni sono stati utilizzati per determinare il nucleo LV, 48 h dopo la MCAO. Figura 4A non mostra nessuna differenza significativa nel LV totale o core tra la riparazione e la procedura dei gruppi. Tuttavia, la variabilità dei dati sia per totale e core LV, come valutato tramite test di Edgar per non parametrica o F-test per dati parametrici, è stata ridotta significativamente all'interno del gruppo di riparazione CCA. Il totale LV è stato suddiviso in LV corticali e sottocorticali, come mostrato in Figura 4B. La porzione corticale era significativamente meno variabile nel gruppo di riparazione del CCA, considerando che la parte sub-corticale della lesione era inalterata fra i due gruppi procedurali.
Un'analisi di potenza ha indicato che un minor numero di animali per gruppo di trattamento sarebbe necessari per dimostrare una riduzione del 30% nel LV dopo MCAO utilizzando CCA riparazione contro la tipica procedura CCA-legati, Vedi tabella 1. Un presupposto di potenza 1-β = 0,8 e livello di significatività α = 0.05 e una previsione di riduzione del 30% nel LV tra l'ipotetico controllo e prova i gruppi sono stati usati per l'analisi di potenza. Inoltre, è stato presupposto un'uguale varianza tra i gruppi. La tabella 1 Mostra il numero di animali necessari per il test e gruppi di controllo quando viene utilizzato il metodo CCA-legati tipico o il metodo di riparazione CCA aggiornato, come descritto qui, è usato. Nota che il gruppo di test fa riferimento a un ipotetico gruppo trattato di animali e il gruppo di controllo si riferisce ad un ipotetico controllo gruppo; entrambi i gruppi subirebbe MCAO.
Figura 1: combinato trattamento l'analgesia e l'omissione della legatura di ECA sugli esiti dopo MCAO. (A) peso corporeo, indicato come percentuale del peso di pre-MCAO, diminuito il primo 2 d seguendo la MCAO per entrambi i gruppi. Il gruppo ECA-deossiHb (analgesia-trattati con nessuna legatura ECA a MCAO) ha mostrato una tendenza verso la perdita di peso ridotta il secondo giorno successivo il MCAO. (B), questo pannello mostra il volume di lesione (mm3) misurato dal cloruro di triphenyltetrazolium standard (TTC) colorazione 48 h dopo la MCAO. I dati riportati sono la media ± deviazione standard. ECA legato: n = 17, ECA deossiHb: n = 10. Questa figura è stata modificata da Trotman-Lucas et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: schema mostrando il metodo standard di CCA e il CCA alternativo ripara metodo dopo MCAO. (A) questo schema raffigura un CCA permanentemente legato con punti di sutura non dissolvable applicati a entrambi i lati dell'incisione CCA, conseguente la legatura permanente del CCA giusto. (B), questo schema descrive il metodo di riparazione alternativo di CCA. Un pad piccolo tessuto rivestito con fibrinogeno e trombina sigillante viene utilizzato per coprire l'incisione di CCA, tenuta a consentire la perfusione completa del diritto CCA. Questa figura è stata modificata da Trotman-Lucas et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: parametri di flusso (rCBF) sanguigno cerebrale regionale dopo MCAO. Il rCBF ha cambiato 5 min dopo la rimozione di filamento MCAO per entrambi i CCA-legati e CCA-riparato gruppi (post-MCAO), riguardante il rCBF misurato durante MCAO. Questo pannello mostra i dati di rCBF immediatamente prima della riparazione di nave CCA (pre-ripristino) e 5 min dopo la riparazione CCA (post-riparazione). Un aumento significativo del rCBF è mostrato 5 min dopo la rimozione del filamento (post-MCAO) in entrambi i gruppi. Un ulteriore aumento del rCBF è indicato dopo la riparazione CCA (post-riparazione) nel gruppo di riparazione CCA. Nessuna differenza nel rCBF è indicata fra 5 min post-MCAO e pre-riparazione. I dati riportati sono condensati dai dati di tempo-corso analizzati segnalazione punti chiave temporale, qui come media ± deviazione standard. CCA legato: n = 10, CCA riparato: n = 10; P < 0.01, * * *P < 0,001, ns: non significativo. Questa figura è stata modificata da Trotman-Lucas et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: analisi del volume lesione ottenuti mediante tecniche di MRI. (A) questo pannello mostra il volume di lesione (LV; mm3) a 48 h dopo MCAO, LV totale tratte da immagini di T2-weighted MRI (Totale LV) e il nucleo LV sottratti DTI scansioni e analisi (Core LV). Immagini rappresentative mostrano il volume di lesione totale da un'immagine di fetta di scansione T2 con la DTI core lesione volume maschera applicata. La variabilità all'interno dei gruppi è stata significativamente ridotta per entrambi il LV totale (P = 0,015, riparazione CCA: n = 10, CCA legato: n = 10, F-test) e il nucleo LV (P = 0,043, riparazione CCA: n = 9, CCA legato: n = 6, prova di Edgar), valutata facendo uso di un F-test per dati parametrici o test di Levene per dati non parametrici. (B) questo pannello mostra il LV a 48 h dopo MCAO, tratte da immagini di T2-weighted MRI e diviso in aree corticali e subcortical lesione. La riparazione CCA ha ridotto significativamente la variabilità di dati (P = 0,03, F-prova) nella porzione corticale della lesione, ma nessun effetto sui dati è stata indicata la variabilità nella porzione della lesione subcortical. Riparazione CCA: n = 10, CCA legato: n = 10. I dati riportati sono la media ± deviazione standard. # P < 0.05 (F-prova), xP < 0.05 (prova di Edgar). Questa figura è stata modificata da Trotman-Lucas et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Approccio | Volume della lesione (LV; mm3; media ± s.d.) |
Potenza | Livello di significatività | Anticiapted differenza | Dimensione di gruppo richiesta |
| CCA legato (approccio tradizionale) | 94.08 ± 53,79 | 0,8 | 0.05 | 30% | n = 58 |
| CCA riparato (nuovo approccio) | 51.73 ± 22,78 | 0,8 | 0.05 | 30% | n = 35 |
Tabella 1: analisi della potenza rappresentativa confrontando la legatura tradizionale di CCA con l'alternativa di CCA riparazione metodo spiegato qui. Questa tavola mostra l'analisi di potenza condotta per calcolare la dimensione di gruppo previsto richiesta per rilevare una differenza significativa nel LV tra un gruppo di controllo, l'approccio tradizionale o alternativo (nuovo) e un gruppo di test (preannunciata). La tabella mostra il gruppo dimensioni come richiesto se presuppone una potenza pari a 0.8, viene applicato un livello di significatività di 0,05 e se il gruppo di test previsto presenta una differenza di 30% in LV rispetto al gruppo di controllo. La tabella mostra i risultati per entrambi gli approcci MCAO (CCA-legati e CCA-riparato) per determinare se c'è una differenza nel numero di animali necessari per ottenere una differenza di 30% in LV. Per entrambi i metodi, si presume una varianza uguale tra il test e il gruppo di controllo. Questa figura è stata modificata da Trotman-Lucas et al. 11.
Discussion
Induzione di filamento di MCAO transitorio nei roditori è il più frequentemente usato modello sperimentale del colpo, in quanto permette riperfusione all'area colpita, che imita il verificarsi di eventi segue clinica dell'ictus ischemico7. È segnalato qui un approccio chirurgico alternativo al tradizionale metodo di MCAO transitorio filamento-indotta in topi. L'approccio alternativo, che coinvolge il trattamento di analgesia, l'evitare di legatura di ECA e CCA incisione riparazione, si traduce in una ridotta variabilità di LV quando valutata facendo uso di metodi colorazione istologica11e di MRI.
Gli approcci tradizionali per indurre MCAO in gran parte si basano sul transection, o almeno la legatura, della Corte dei conti, che ha dimostrato, nei ratti, di influenzare il comportamento bevente e un aumento nella perdita di peso del corpo seguendo la MCAO14. Il protocollo definito qui, nei topi, con l'evitare la legatura ECA e aggiunta di analgesia, ha suggerito una riduzione di perdita di peso corporeo dopo MCAO con nessun effetto sul volume della lesione. L'uso di analgesia è evitato, o almeno non segnalato, nella maggior parte degli studi sperimentali ictus, a causa di possibili effetti confondenti sui risultati sperimentali. Tuttavia, evitando completamente l'analgesia non è sempre giustificata e c'è la necessità di bilanciare le esigenze di benessere degli animali con il raggiungimento degli obiettivi scientifici.
Differenze nella dimensione animale, deformazione e anatomia cerebrovascolare, oltre alle variazioni di dimensioni e tipo di filamento, ha suggerite di influenzare colpo risultati23,24. L'approccio alternativo descritto qui evita la dipendenza la mucca durante la riperfusione, riducendo così, almeno in parte, la variabilità osservata tra gli animali in volume della lesione. Anatomia di mucca è altamente variabile in topi, in particolare nella C57BL /6 ceppo, che è spesso utilizzata negli studi di colpo sperimentale. 90% dei topi C57BL/6 hanno una mucca incompleta a causa di una variegata posteriore comunicante dell'arteria (PcomA) l'evidenza, che può avere un effetto sul volume di danno ischemico dovuto la perfusione insufficiente di strutture di fuori del territorio MCA13, 25. riparazione del CCA in topi, come illustrato di seguito, si traduce nel ristabilimento del sangue flusso tramite il CCA alla zona ischemica, come precedentemente descritto in ratti15. Qui i dati rappresentativi dimostrano che la riparazione del CCA aumenta riperfusione, anche se il flusso di sangue in CCA non è stato misurato direttamente. Tuttavia, è possibile per il chirurgo di visualizzare il CCA rifluisca con sangue dopo la riparazione del vaso, come si ritorna ad uno stato palpitante e completo lungo tutto il tronco, prossimale e distale rispetto alla posizione di riparazione. Questa conferma visiva, insieme a letture di flussometria Doppler laser della zona ischemica, può essere utilizzata per confermare la riuscita riparazione della nave. Il tempo tra l'applicazione di rilievo del tessuto e la rimozione della clip nave da CCA possono avere un impatto sulla pervietà risultante del CCA, come riducendo il tempo tra l'applicazione di rilievo del tessuto e la rimozione di clip impedirà il pad tessuto aderendo all'o lato di trecenteschi del CCA. Anche se tecnicamente impegnativi, la procedura alternativa di MCAO spiegata qui non richiede alcuna abilità supplementari rispetto a quelli necessari per eseguire l'induzione chirurgica di MCAO nei topi.
Tradizionalmente associato con un'alta variabilità nelle misure di risultato, studi di colpo sperimentale possono avere la tendenza a essere sottodimensionato. Requisiti etici e di assistenza sociale in combinazione con preoccupazioni economiche e pratiche possono contribuire agli studi essere sottodimensionato. Riducendo la variabilità nel risultato e, di conseguenza, producendo esiti di lesione più coerente attraverso un gruppo sperimentale, i calcoli di potenza più efficaci possono essere eseguiti con l'obiettivo ultimo di studi viene alimentato in modo appropriato.
In conclusione, questa procedura di riparazione alternativa di CCA, nei topi, si traduce in minore variabilità nel volume della lesione sperimentale colpo seguente e calcoli di potenza più piccoli gruppi sperimentali consente di essere necessario per i test un effetto del trattamento quando appropriato vengono utilizzati.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal centro nazionale per la sostituzione, la raffinatezza e la riduzione degli animali nella ricerca (NC3Rs; NC/M000117/1 al centro di gravità). Gli autori ringraziano il personale della divisione di servizi biomediche, Università di Leicester, per la loro cura degli animali sperimentali e Maria Viskaduraki per la sua consulenza statistica. I risultati rappresentativi sono adattati con il permesso da modelli di malattia & meccanismi11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
| 7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
| 9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
| Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
| Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
| C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
| Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
| Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
| Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
| Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
| dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
| Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
| dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
| Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL |
| Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
| Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
| Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
| LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
| micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
| Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
| microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
| MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
| no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
| Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
| Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
| Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
| Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
| Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
| Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
| Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
| sterile Petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required. |
| Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
| Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
| White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |
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