Summary
腔内フィラメント中大脳動脈閉塞症は、齧歯動物で実験的ストロークの生体内で最も頻繁に使用されるモデルです。一般的な頚動脈修復が可能にする手術方法は、総頸動脈の再灌流と中大脳動脈領域に完全再灌流が可能ここでは、実行されます。
Abstract
虚血性脳卒中は、長期的な障害を成人と死の世界の主要な原因です。利用可能な現在の治療法が制限のみ組織プラスミノーゲン活性化因子 (tPA) 虚血性脳卒中を対象に承認された薬物治療として。虚血性脳卒中の分野の現在の研究は開発・新規医薬品のターゲットを調査するストロークの病態の理解に焦点を当ててください。信頼性の高い実験的ストローク モデルは、潜在的な治療の進行のために重要です。中大脳動脈閉塞 (MCAO) モデルは臨床的に関連する、最も頻繁に齧歯動物で虚血性脳卒中の外科的モデルを使用します。ただし、性病変の容積など、このモデルの結果は、マウスにおいて、変動性の高いレベルに関連付けられます。ここで説明した代替 MCAO モデルにより、総頸動脈 (CCA) の再灌流および容器、および改善された修復するフィブリノゲン系シーラントと組織パッドを使用中大脳動脈 (MCA) 領土増加血流(ECA) 外頸動脈結紮術を回避することによってマウスの福祉。これはマウスの変数でなければ高い解剖学的に知られているウィリス輪への依存が軽減されます。代表的なデータは、この手術方法を使用して病変ボリューム MCAO 従来とここで説明する別のアプローチの間の変動を減少させることを示しています。
Introduction
脳卒中の主な原因は、中大脳動脈領域の虚血です。組織プラスミノーゲン活性化因子 (tPA) は、のみに薬理学的治療にもかかわらず、虚血性脳卒中1,2を対象とした多数の臨床試験の実績のある効果で利用可能です。ただし、安全上の懸念と狭い治療ウィンドウ (< 4.5 h) のためすべての脳卒中患者の ~ 15% のみが tPA を受け取る資格と再開通率は、< 503,4をすることができます。
ストロークの再現性と臨床的に関連する動物モデルは、新しい、潜在的な脳卒中治療の開発に知らせる必要と見なされます。ただし、一貫性と、動物モデルでの変動についての懸念のためそのまま前臨床試験からクリニックへの翻訳を改善するために既存の体内モデルを改良することが重要。臨床使用に潜在的な治療の臨床実験的効果から翻訳の不足は、ストローク研究5の継続的な問題です。翻訳の失敗の理由は複数あるらしい、試作、治療遅延、臨床ストロークの不均一性などに関連する可能性がありの動物モデルの限界が6を使用します。ストローク研究にとって重要な課題には、安全かつ効果的な治療法の開発が残っています。
腔内のフィラメントの挿入による中大脳動脈閉塞 (MCAO) は、実験線の生体内で最も頻繁に使用される齧歯動物モデルです。このモデルは、人間ストローク7で発生するイベントを模倣した虚血誘発後の血流の回復できます。ただし、特にマウスで様々 な標準偏差と異機種混在病変ボリューム発生定義でも外科プロトコル、応用8,9,10。バイモーダル分布小さな線条体と striato 皮質病変が大きいボリューム11を参照するが一般的です。虚血を誘導して、フィラメント、通常 CCA または完全に結紮12のままで、ECA の切開して挿入されます。CCA の永久的な結紮内頸動脈 (ICA) と、その後 MCA 領域への血流の再確立を防ぐことができます。これは、ウィリス動脈輪 (牛) 内で担保の供給に依存することに再灌流を発生します。牛の構造は C57BL/6 マウスの緊張体内ストローク研究13で通常使用で特に、個々 の動物の解剖学的変動。ECA、フィラメント挿入の代替方法は、CCA がこのメソッド妥協を通して継続的な灌流動物の有害な効果がラットで示されている ECA の領土への動脈供給を許可して幸福14。
担保供給と確立された MCAO モデルで再灌流の牛への依存可能性があります、次の閉塞病変量変動のアカウントの一部。代替のマウスの外科的処置、ECA 結紮は避け、CCA 切開を修復すると、CCA、牛の独立による再灌流が可能について述べる。CCA 切開の修理は以前から CCA15成功再灌流が発生するラットで示されています。我々 はマウス11正常にこのアプローチを適用したし、プロトコル性病変の容積、脳卒中の研究で使用される主な結果メジャーで減少変動の結果をここに報告します。
このプロトコルでは CCA 船舶修理、再灌流を許可する組織シーラントとパッド アプリケーションを含む続いて CCA 容器フィラメント挿入を介して MCAO を実施する方法を示します。
Protocol
英国動物 (科学的なプロシージャ) の行為、1986 (プロジェクト ライセンス 60/4315) に基づき、以下の機関の倫理的な承認は、このプロトコルとデータが報告を行った。すべての実験動物の研究に基づいて報告される: In Vivo実験 (到着) のガイドライン16の報告します。
1. 準備
- 術後ケア (例えば環境、寝具、回復食品) に成人男性 c57bl/6 マウスを理解して手術前に少なくとも 48 時間。
注: ポスト MCAO 動物頻繁食べたり飲んだり、次の手術の難しさがあります。- 術後過度の体重減少を防ぐためには、慣らす、ポスト MCAO ダイエットに動物などのケージの床に直接補水ゲル、ゲル状食品、及び浸漬/ウェット通常国会ペレットを配置すること。
- ホワイト ペーパー チップなどの術後ベッドにケージ寝具を変更します。
- 手術の手順を開始する前にすべての手術器具を滅菌します。
- これを行うオートクレーブ (121 ° C、15 分間、15 の psi の最小) ツールまたはエチレン酸化物 (正しい製造元の指示に従って、8-10 h 以下) を使用して。
- プロシージャを設定する前にすべての表面を消毒します。滅菌外科用ドレープや手術中に処理が必要な項目のオートクレーブの箔ですべての面をカバーします。無菌技術を使用して、プロシージャの持続期間のため。
注: オートクレーブ箔は器具、手術中に開催する必要がある機器をカバーするために使用できます。滅菌した手袋とテクニックを使用して、箔を適用ことができますそして、滅菌フィールドにアイテムを配置できます。次に、滅菌手袋の変更が必要となります。
2. 中大脳動脈閉塞症の手術
- 成人男性 c57bl/6 マウス手術時体重 24-31 g を使用します。O2、赤いプラスチックの麻酔室での 2 L/分で 5% イソフルランを用いた麻酔を誘導します。
- 外科医を下げるためスカベン ジャー システムと組み合わせたフェイス マスクによって提供される (例えば70% N2O230% O2で 1.5-2%), 手術のため適切な麻酔深度を維持するためにイソフルランを減らす誘導、イソフルラン暴露。
注: 亜酸化窒素 (N2O2) は、適切な麻酔深度のイソフルランの必要量を減らすために酸素 (O2) との組み合わせで使用することができます。 - 手術前に全身麻酔を管理 [カルプロフェン、10 mg/kg 皮下 (理学博士)」と局所麻酔、切開するサイト (ブピバカイン、2 mg/kg の理学博士、希釈 1:10 0.9% 生理食塩水) ペリ作動。
- 手術前の腹腔内 (ip.) 200 μ L 滅菌 prewarmed 0.9 %nacl 水溶液の注射によって流体を管理します。
- 右の毛を剃る頭部と腹側頸部小さなバリカンを使用して肌を露出します。手術中に乾燥を防ぐために 3 分両方の目の上に潤滑剤を眼適用のため 5% クロルヘキシジン ソリューションを使用して、手術の皮膚面積を消毒します。
注: モニター血液酸素飽和度、心拍数と呼吸数にパルス酸素濃度計測定のために必要な脱毛クリームを使用して髪の後ろ足をクリアします。清潔な綿を使用してクリームを適用する芽し、クロルヘキシジン希薄溶液で領域を洗って毛の取り外し後。緩やかな毛皮滅菌手術野の汚染のリスクを最小限に抑えるため術前エリアでこの手順を実行します。研究者が現地の慣行によると他の手術部位の製剤を使用することを好みます。 - 外科領域にマウスを移動し、滅菌ドレープで覆われて恒温熱マットにうつ伏せ。麻酔を介して鼻の円錐形を維持します。マウスの体の温度を監視し、37.0 ± 維持する直腸プローブ挿入 0.6 の ° c.
- 任意の外科的切開の前に後肢逃避反射をチェックし、麻酔深度を確認するための反射が点滅します。
- MCA 領域への血流を記録するレーザ (LDF) レーザードップラー血流計プローブを接続します。
- 郭清万国実体写真を使用すると、右目と第 15 メスによる一時的な皮膚の露出部に耳の中間に < 1 cm の切開を行います。露骨に頭蓋骨を覆う、そっと離れて骨からこれを削り落とし、滅菌綿棒で表面を乾燥の基になる組織を分析します。
注: 側頭筋に損傷を与えないように注意する必要があります。 - 0.7 mm、柔軟な単一光ファイバープローブ フラット エッジを得るため、ドーナツ型プローブ ホルダーを介してこれをプッシュ、繊維の端で光の一致するゲルの少量を配置して鋭いメスを使用して端をカット、LDF モニターに接続のホールドを取る。
- プローブ ホルダー; の下端の周り防水スーパー接着剤接着剤の少量を配置します。部分的に乾燥し、粘着性になるのためにこれを許可します。
- 側頭骨上の頭蓋骨を乾燥し、骨丸に局所組織接着剤の少量を配置だけで十分なプローブ ホルダー。
- このエリア (6 mm 横と前から 2 mm) 上の場所で既に光ファイバー プローブとプローブ ホルダーを配置します。
- 接着剤が乾燥のための時間を許可します。一度乾燥、添付、LDF データの記録を開始します。
- 郭清万国実体写真を使用すると、右目と第 15 メスによる一時的な皮膚の露出部に耳の中間に < 1 cm の切開を行います。露骨に頭蓋骨を覆う、そっと離れて骨からこれを削り落とし、滅菌綿棒で表面を乾燥の基になる組織を分析します。
- 優しく世話をレーザーのドップラー プローブをサポートし、の剥離を防ぐために、仰臥位に動物を裏返します。優しく多孔質医療テープ、スライド領域を持ち上げ、張力を作成する綿の芽 (または鉗子閉鎖など、類似した何か) の首の下のペアを 2 つ前足をテープします。無菌維持するために滅菌ドレープとマウスをカバーします。
- 郭清と CCA の露出を開始します。
- 第 15 メス刃を使用して露出腹側の首に 1.5 cm 正中切開を行います。
- 気管を公開する側に唾液腺を撤回優しく穏やかな鈍的切離技術を使用して。
- 鈍的切離を使用すると、周囲の組織と迷走神経から無料の CCA を解剖します。
注: は、迷走神経への損傷は、モビリティ、給餌と呼吸を損なうことができるよう、迷走神経に直接、触れることを避けてください。
- CCA は、容器と迷走神経神経の腹側の背側下 6-0 縫合非溶ける 2 つの小さな (2 cm) セクションを渡します。外科医に近い 1 つの絹のネクタイを描画し、CCA (近位タイ) 周りにはしっかりとネクタイします。緩く結ぶ ICA/ECA の分岐に向かって 2 つ目のシルク ネクタイ (遠位タイ)。
- CCA のセクションを隔離し始めると、遠位のネクタイがない分岐を妨害のすぐ上の微小血管クリップに適用します。マイクロ Vannas はさみを使って、CCA に小さな穴を作る。
注: すべての回では、ECA が特許に残らなければなりません。CCA 切開は容器のと、簡単にアクセスできる腹位置の幅の 40% 以上にする必要があります。船舶修理段階ポスト MCAO の重要な役割を果たします。 - 血管クリップに進みつつ、CCA に 7-0 シリコーン コーティング モノフィラメントを挿入します。
注: フィラメント サイズは; 手術前にマウスの重量に基づいてを確立する必要があります。製造元のガイドラインを参照してください。- それを損なうことがなく場所にフィラメントを固定する十分な遠位ネクタイを締めます。クリップ ホルダーを使用して微小血管クリップを取り外します。
注: 出血見るべきでないこの時点で。血液の逆流がある場合、フィラメントを保持しているネクタイはタイトな十分なありません。
- それを損なうことがなく場所にフィラメントを固定する十分な遠位ネクタイを締めます。クリップ ホルダーを使用して微小血管クリップを取り外します。
- フィラメントを ICA に進出します。
- 保ち、フィラメント ICA 内、翼口蓋動脈 (PPA の) には渡しません。少し持ち上げ、引っ張って CCA は、動物の体の外側に、シルクのネクタイのいずれかを使用してこれを行うし、過去の PPA の内部ネットワーク上の開口部を曲げるフィラメントを操縦します。
注: 一度、MCA の枝起源に高度な指定された領土への相対的な血流の低下は LDF の値に表示されます。これはフィラメントの配置を確認します。
- 保ち、フィラメント ICA 内、翼口蓋動脈 (PPA の) には渡しません。少し持ち上げ、引っ張って CCA は、動物の体の外側に、シルクのネクタイのいずれかを使用してこれを行うし、過去の PPA の内部ネットワーク上の開口部を曲げるフィラメントを操縦します。
- フィラメントを確保で厳しく、場所これを結び遠位のシルク ネクタイ。閉塞期間の持続期間のための場所でそれを残します。
注: 依存回復ケージに移動できる動物個々 のプロトコルに、次の回復、するため、縫合の傷または閉塞期間中の麻酔の下に残る。後者の場合、傷口を滅菌 prewarmed 0.9% 塩化ナトリウム塩を使用して乾燥から防止を確認します。
3. 後咬合
- MCAO 期間の終わりに、白いフィラメント頭がはっきり表示されるまですぐにフィラメントを撤回します。
- その後、遠位の CCA を緩めネクタイ フィラメント容器から道の頭のほとんどを削除するのに十分で、です。
注: フィラメント完全に削除できますこの時点で外科医が血損失を防ぐために遠位のネクタイを結ぶスピードに自信を持って場合。 - 遠位ネクタイの横にある CCA 分岐方向の水平方向の位置に 1 つの微小血管クリップを配置します。遠位のネクタイを緩め、フィラメントを完全に取り外します。外科医への近位の CCA ネクタイの下の別の血管クリップを追加します。
注: は、船舶が任意のすべりを防ぐためにクランプの突起に十を確認します。クリップの配置は、クリップ駆除後の手順の中に簡単にアクセスを確保するために不可欠です。クリップより良いクリアランスと周囲の筋肉の間で水平方向にクリップを配置すること、組織のパッチの配置を許可するように容器を解除するために使用できます。 - 慎重にデュモン #5 鉗子またはマイクロ Vannas はさみを使用して両方のシルク ネクタイを削除し、滅菌綿棒を使用して区域を乾燥します。
注: 容器を切らないように注意する必要があります。 - 滅菌シャーレでフィブリノゲンとトロンビン シール ソリューション 1 と 2 (材料の表を参照してください)、2 つの物質を確保する別々 のご滞在、準備ができて後のミキシングのためを追加します。
注: エージェントの非常に少量だけ、必要な (< 0.25 ミリリットルそれぞれ) です。ソリューションを個別に維持する 2 つの要素間の早期反応を防止します。キャップは置換と同じように反応し、シリンジ内のエージェントを原因となる 2 つの注射器のクロス汚染を防ぐために削除されましたを確認します。使用前に-20 ° C でソリューションを格納します。最初の手術に必要なときは、部屋の温度にシーリング材を解凍します。シール材は再冷凍しないでください。それは部屋の温度のままにする必要があります、この方法を保存することができます。注射器で使用できることが費用対効果; 複数の手術ただし、1 週間以上の汚染を防ぐために同じのバイアルを使用する勧めします。 - デュモンない 5 鉗子、マイクロ Vannas はさみ筋肉に沿って鈍的切離を使用して、腹薄切りスライスは以上 1 mm 厚と筋の上部線維に沿って実行されますを確保する組織パッドに使用する胸鎖乳突筋を取得します。
注: はこれが大きくその機能が損なわれると、筋肉全体を切らない。組織は、快適 CCA 切開をカバーするのに十分な大きさである必要があります。 - デュモン #5 鉗子を使用して、取る組織パッドと混ぜる組織均等に 2 つのフィブリノゲンとトロンビンのシール ソリューションは、2 つの試薬間のチャネルを形成します。迅速に凝固が発生します凝固が開始されると、すぐには、CCA 切開する組織パッドを取り外します。フラット ダウン中のしっかりした圧力と開く鉗子組織パッドを配置します。
- 素早く場所にそっとティッシュ パッドを保持まだながら、遠位血管クリップを削除します。
注: これはさらにフィブリノゲン トロンビン剤試薬をアクティブに血液のいくつかの逆流をことができます。だけで十分な圧力が船を完全に遮ることがないが、代わりに、パッドを保持する必要です。 - ゆっくり切開区域の下で流れる血を許可する組織パッドからの圧力を緩和します。今、近位血管クリップからの圧力をゆっくりと優しく開放し、完全に削除します。
- 注: 容器が完全に特許になるために、組織パッドの配置や微小血管クリップの削除する必要がありますすぐに防ぐために起こる組織パッド シールから CCA の内側に。しかし、血液の漏出量が少ない場合、さらに血栓形成と発生するシールのための時間を許可する組織パッドにいくつかの光の圧力を再配置します。血液の漏出は実質的な組織パッド シールが表示されない場合、血損失を防ぐため、切開部を分離し、さらに血損失を防ぐために両方の CCA の微小血管クリップを置き換えるに圧力を維持します。
- 素早く場所にそっとティッシュ パッドを保持まだながら、遠位血管クリップを削除します。
- 組織パッドを容器にシールは、イベントで 2 番目の試みことである次のステップ 3.3-3.7.3。
- 容器を密閉すると、一度溶ける 6-0 縫合糸を使用して傷を縫合します。LDF 記録手術を通して続いた場合は 6-0 縫合の頭蓋骨とコイルは溶ける縫合から LDF を削除します。
4. 手術後のケア
- (加熱棚/マット 35 ° c または加熱チャンバー内に位置しています) prewarmed 回復ケージに動物を配置します。
注: 他の温度および現地の慣行によると期間を使用する研究者を好む場合があります。 - Prewarmed 0.9 %nacl 食塩理学 4 h 後操作と 2 x で、術後すぐに 200 μ L を毎日 72 時間のすべての動物を提供します。
注: prewarmed 0.9% の NaCl は led 動物です。詳細が必要な場合より多くの液体は良い回復を確実に管理できます。 - 回復ケージで水浸しダイエット ペレット、ペレット乾燥食、補水ゲル、ゲル状食品、水へのアクセスの自由と一緒にする動物の無制限のアクセスを与えます。
- 24 h 後操作で理学博士カルプロフェン注入を繰り返します (手順 2.3 を参照してください)。
注: すべての動物カルプロフェン; の同じ線量を受け取った任意の神経保護効果は無視する可能性があります。 - 48 時間の定期的な間隔で得点17さらに鎮痛を管理する意思決定を支援するために痛みのレベルを評価するために手術後マウスしかめっ面を実行します。
- 手術と、毎日の手順の直前に動物の重量を量る。毎日の観察を行い、食品と水の摂取量、臨床症状を監視する完全な福祉シート。
- 24 時間と 48 時間後操作機能の観察を行います。焦点の赤字規模でマウスを評価します。その本体の対称性、強制的旋回、歩行、登山、旋回動作、前肢の非対称性、ウィスカー タッチ応答18,19,2045 ° グリッドを評価します。
5. 磁気共鳴画像と画像処理
- 構造の磁気共鳴画像 (MRI) を用いた病変ボリューム (LV) を測定します。
注: 塩化トリフェニルテトラゾリウム (TTC) と組織染色などの代替方法以前使用されて、構造 MRI データに関連付けます。ただし、このメソッドはない縦方向の研究のエンドポイントでのみ使用できます。縦の MRI スキャンを使用すると、研究に必要な動物の数が少なくなります。- 48 h、MCAO の誘導後イソフルラン (1 L/min O2誘導におけるイソフルラン 5%)、メンテナンスのため 1.5-2% イソフルランとマウスを麻酔します。
- MRI クレードルにマウスを転送、その呼吸数を監視するため呼吸センサー上に配置し、直腸温度プローブ走査中に、温度を監視するためのインプラントします。場所 2 ch マウス脳の RF 信号を脳経由でコイルを受信、場所 9.4 T 水平にクレードル穴スキャナー。
注: ここでは、72 mm 内径のボリューム コイルは、RF 伝送に使われました。 - 高速スピンエコー系列を用いた T2 強調スキャンを取得します。視野 (FOV) として mm 3,000 ms とエコー時間 (TE) 40 さん使用 18 mm × 18 繰り返し時間 (TR) を設定し、18 ミリメートル x 0.8 ミリメートルと約 10 分で 3 つの信号の平均のスライスと 256 x 256 買収行列を取得します。
- 高速スピンエコー系列を用いた拡散テンソル画像 (DTI) を取得します。1,730 ms に TR、TE 35 ms に 20 mm × 20 mm、FOV を設定し、16 mm x 1 mm、2 信号の平均値、14 拡散エンコーディング方向、および最大bのスライスと 128 x 128 買収マトリックスを取得-1,024 s/mm2の値。
- 画像表示を使用して、ソフトウェア パッケージを測定、T2 強調画像の LV を測定します。一緒に (MRI スキャン時に設定) MRI スライス厚を考慮しながら合計性病変の容積を計算する値を照合、破壊面積を測定します。
- 完全対側と同側の半球を測定しながら任意の腫れと領域病変ボリュームの割合を考慮取る。任意の脳浮腫として性病変の容積を測定する間接方式による膨潤の正しい説明以前21,22。前頭葉や矯正を避けるために標準的なマウスの脳アトラスによると小脳組織ではなく、皮質組織を含むスライスを含めるだけです。
- 病変の拡散パラメーターを測定し、関心の中心と周縁地域を取得します。
- 適切な MRI 解析ソフトウェアを用いた拡散テンソル画像から見かけの拡散係数 (ADC) および小数部異方性 (FA) マップを生成します。
- 画像の線形登録を行うことができる適切なイメージ解析ソフトウェアを使用して、T2 強調画像で DTI 画像に合わせます。次の登録、T2 強調病変マスク (虚血性コアと半影) 半影領域を推定するから拡散強調病変マスク (虚血性コア) を減算します。結果のマスク (コアと半影) をコアと半影内の拡散パラメーターを定量化する ADC と FA のマップに適用されます。
- 比較のため反対側の ADC と FA の値を取得するために同側のコアおよび脳の正中線の半影のマスクを変換します。
Representative Results
24 大人男性 c57bl/6 マウス、24-31 g 外科の時の重さの合計は、研究で使用されました。中大脳動脈閉塞 (MCAO)、次 1 つの動物の死亡し、1 つは外科的合併症のため除外されました。ここで表示されるデータは、著者によって以前に出版された仕事から取得されます。これらは、MCAO の成果11血管修復の効果を説明するために使用されました。すべてのデータは、thr 平均 ± 標準偏差で表されます。データは、ダゴスティーノ ピアソン オムニバス正規性検定を用いて, 統計学的に評価されました。パラメーター データは、スチューデントのtを用いて比較した-(2 つの) テストと Sidak テスト (複数という意味) と一方向の分散分析。非パラメトリック データは、マン ・ ホイットニーの U 検定を用いて比較した.パラメーターのデータの変動は、 Fを使用して査定された-テスト、レーベンのテストを使用して非パラメトリック データ変動が評価されたと。
通常、MCAO の手順で遮蔽のフィラメントが CCA に挿入されます、ECA は、ICA よりもむしろ ECA に渡してからこのフィラメントを防ぐために結紮と。ECA 結紮の回避と鎮痛の傾向が認められた重減 48 h のポスト-MCAO で一方ない鎮痛と ECA 結紮を使用して同じ MCAO 時間を同じ外科医によって行われた以前の研究からのデータと比較した場合、LV影響を受けない登場、図 1を参照してください。
マウスは、60 分 MCAO 誘発虚血再潅流 CCA 船舶修理、CCA アプローチの典型的な結紮術を施行した.結紮と unligated の修復された CCA の模式図は、図 2に示すです。
レーザードップラー血流灌流地域で MCAO で MCA の CCA 船修理の前後を確認する使用されました。図 3は、フィラメントの除去、局所脳血流量 (rCBF) MCA の脳の領域で有意に増加したその 5 分を示しています。船舶修理、CCA 修理許可の信頼と比較して虚血性の領土に増加した血液灌流であることを示唆している CCA 船舶修理、次に示した MCA 領域に血流の増加と、血流が維持されウィリス輪だけ。
T2 強調 MRI は合計 LV を決定する使用され、コア、LV、MCAO 後 48 h を決定する DTI スキャンを使用しました。図 4 aは修理や結紮プロシージャ グループ間またはコアの合計 LV の大きな違いを示します。ただし、両方のデータの変動の合計し、LV をコアの Lavene のテストを使用して評価した非パラメトリックまたはF-パラメーター データをテスト、CCA 修理グループ内で有意に減少しました。図 4 bに示すように、合計の LV は皮質と皮質下の LV に分割されました。サブ皮質病変部は 2 つの手順グループ間影響されなかったに対し、皮質の部分だった CCA 修理グループで大幅に少ない変数です。
パワー解析を示した治療群あたりが少ない動物が MCAO CCA 修理対CCA 結紮の通常の手順を使用して、次の LV の 30% の減少を示して、表 1を参照してください必要になります。電源 1 β の仮定 = 0.8 と有意水準 α = 0.05 と予測電力解析のため使用されたグループという仮想のコントロールとテストの間の LV の 30% 削減。さらに、等しい分散グループ間としました。表 1は、テストに必要な動物の数を示しています、コントロール グループいずれか、典型的な CCA 結紮法を使用する場合または更新された CCA 修理方法前述のようが使用されます。メモ テスト グループが動物の仮説的治療群と対照群を指すという仮想のコントロール グループを参照します。両方のグループは、MCAO を受けるでしょう。
図 1: 複合鎮痛治療と転帰 MCAO ECA 結紮後の省略。(A) 事前 MCAO 重量の割合として表示されます体重減少 MCAO 両方のグループに続く最初の 2 d。ECA unligated 群 (鎮痛 - MCAO ない ECA 結紮) では、2 番目の翌日、MCAO 減少体重減少傾向が認められました。(B) このパネルは、標準塩化トリフェニルテトラゾリウム)、MCAO 後 48 h を染色によって測定される性病変の容積 (3mm) を示しています。表示されるデータは、平均 ± 標準偏差です。結紮 ECA: n = 17、ECA unligated: n = 10。この図は、Trotman ルーカスらから変更されています。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 図標準的な CCA 方法と代替 CCA 修理方法次の MCAO 。(A) この回路図は完全に結紮 CCA CCA 切開のいずれかの側に適用される非溶ける縫合糸を使用して右の CCA の永久的な結紮術の結果を示しています。この回路図 (B) は、CCA の修理方法を示しています。フィブリノゲンをコーティングした小さな組織パッド、トロンビン シールはシール右 CCA の完全血流を許可するように、CCA 切開をカバーするため使用されます。この図は、Trotman ルーカスらから変更されています。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: MCAO の後に局所脳血流量 (rCBF) パラメーター 。190. は、MCAO 測定 CCA 結紮し、CCA 修理グループの両方 (ポスト-MCAO) 190. 基準 MCAO フィラメント除去後 5 分で変更。このパネルは、CCA 船舶修理 (修復前) の直前に、次の CCA 修理 (修復後) 5 分 rCBF データを示します。190. の有意な増加は、両方のグループにフィラメント除去 (ポスト MCAO) 後 5 分を示します。CCA 修理グループで CCA 修理 (修復後) に続く 190. 追加増加が表示されます。5 分のポスト MCAO と修復前の間、脳血流量の違いは表示されません。表示されるデータは、分析された時間経過データ レポート キー時刻ポイント、平均 ± 標準偏差としてここから凝縮されています。結紮 CCA: n = 10、CCA の修復: n = 10;P < 0.01、* * *P < 0.001、 ns: 有意ではないです。この図は、Trotman ルーカスらから変更されています。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: MRI 技術によって得られた性病変の容積の分析。(A) このパネルは、MCAO、MRI の T2 強調画像 (合計 LV) から合計 LV と DTI スキャンと分析 (コア LV) から撮影したコア LV 48 h で性病変の容積 (LV; mm3) を示しています。代表的な画像は、DTI コア病変ボリューム マスクを適用した T2 スキャン スライス画像から合計性病変の容積を示しています。両方合計 LV のグループ内での変動を有意に減少した (P = 0.015、CCA 修理: n = 10、結紮 CCA: n = 10、 F-テスト) とコア LV (P = 0.043、CCA 修理: n = 9、結紮 CCA: n= 6、Lavene のテスト)、 Fを使用して評価-パラメトリック データまたは非パラメトリック データのレーベンのテストのためのテスト。(B) このパネルには、48 h MCAO、MRI の T2 強調画像から撮影し、皮質と皮質下の病変領域に分かれて、次に LV が表示されます。CCA 修理データ変動を大幅に削減 (P = 0.03、 F-テスト) 皮質病変ですがデータに影響しない部皮質病変部の変動を示した。CCA 修理: n = 10、結紮 CCA: n = 10。表示されるデータは、平均 ± 標準偏差です。#P < 0.05 (F-テスト)、 xP < 0.05 (Lavene のテスト)。この図は、Trotman ルーカスらから変更されています。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| アプローチ | 性病変の容積 (LV; mm3平均 ± 標準偏差) |
電源 | 有意水準 | Anticiapted 違い | 必要なグループ サイズ |
| CCA 結紮 (従来の方法) | 94.08 ± 53.79 | 0.8 | 0.05 | 30% | n = 58 |
| CCA 修理 (新しい方法) | 51.73 ± 22.78 | 0.8 | 0.05 | 30% | n = 35 |
表 1: CCA 修理方法をここで説明した代替と伝統的な CCA 結紮を比較する代表的な電力解析します。このテーブルは、コントロール グループ、伝統的なまたは代替の (新しい) アプローチ (予測) テスト グループの LV で有意差を検出するために必要な予想されるグループのサイズを計算するために実施する電力解析を示しています。グループとしてサイズ表必要かどうか 0.8 の力を想定、0.05 の重要性レベルを適用すると、し予測テスト グループで 30% の差を示している場合、LV と比較対照群。両方 MCAO 方法 (CCA 結紮し、CCA 修理) LV の 30% の差を得るために必要な動物の数に違いがあるかを決定するための結果を表します。両方のメソッドは、等分散テストとコントロール グループの間とみなされます。この図は、Trotman ルーカスらから変更されています。11。
Discussion
齧歯動物で過渡 MCAO のフィラメント誘導は頻繁に使用する実験的ストローク モデル臨床虚血性脳卒中7の後のイベントの発生を模倣した患部に再灌流ことができます。マウスにおけるフィラメント誘起過渡 MCAO の従来の方法に代わる手術アプローチは、ここで報告します。代替アプローチは、MRI および組織学的染色法11を使用して評価すると低 LV 変動の鎮痛治療、ECA 結紮回避、および CCA 切開修理の結果を含みます。
主 MCAO を誘導するために従来の依存、断裂や少なくとも結紮、ECA は、飲酒行動と MCAO14以降体重の増加に影響を与える、ラットで示されています。ECA 結紮と鎮痛添加の回避を持つマウスで、ここで定義されたプロトコルは、体重減少しても性病変の容積に影響 MCAO の次の減少を提案しました。鎮痛の使用は避ける、または、少なくとも、ない実験結果への交絡影響が原因の脳卒中研究の大半で、報告します。鎮痛を完全に避けることは常に正当化されないし、科学的調査の目的の達成と動物の福祉のニーズのバランスをとる必要があります。
動物のサイズ、歪み、およびフィラメントのサイズと種類のバリエーションに加え、脳の解剖学の違いはすべてのストロークの結果23,24に影響を与える示唆されました。ここで説明した方法は、したがって、少なくとも部分で、可変性を減らす性病変の容積の動物の間に見、再灌流時の牛依存を回避できます。牛の解剖学は、C57BL に特に高いマウス、変数/6ひずみ実験的脳卒中の研究で頻繁に使用されます。c57bl/6 マウスの 90% があるために、様々 な後部通信 (PcomA) 動脈の開存性、MCA 領域13,の外の構造の不十分な血流による虚血性損傷の量に影響を及ぼす可能性のある不完全な牛25します。 ここで示すように、マウスで CCA の修復、血液の再確立の結果を介して虚血領域、ラット15で述べたように CCA 流れ。ここに代表的なデータは、CCA の血流量は直接計測していませんが CCA の修理が再灌流を増加させることを示します。しかし、外科医は近位および遠位修理場所にトランクに沿ってパルスとフル状態に戻ります、船舶修理の後の血を持つ CCA reperfuse を視覚化することが可能です。虚血領域のレーザー レーザードップラー血流計の測定値と一緒に、この視覚的に確認を使用して、血管の修復が成功を確認できます。CCA から血管クリップの除去や組織 pad アプリケーション間の時間することができます組織 pad アプリケーションの間の時間を減らす、CCA の結果開存に影響があるし、組織パッドの o 付着防止、クリップの取り外しCCA の pposite 側。技術的に困難なここで説明した代替 MCAO プロシージャにマウス MCAO の手術誘導を実行に必要なものよりも任意の追加のスキルは不要です。
伝統的アウトカム指標の高変動に関連付けられている、実験的ストローク研究はパワー不足になりがちをかもしれません。倫理的・福祉要件経済的かつ実用的な懸念との組み合わせでパワー不足される研究に貢献するかもしれない。結果の可変性を減らすと、したがって、実験グループ全体でより一貫性のある病変の成果を生産、適切に動力を与えられる研究の究極の目的をより効果的な電力計算を実行できます。
結論としては、マウスで、この代替の CCA 修理手順の実験的脳卒中病変容積のより少ない可変性の結果、適切な治療効果をテストするために必要になる有効小さいの実験グループの電源を計算使用されます。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
| 7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
| 9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
| Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
| Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
| C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
| Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
| Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
| Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
| Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
| dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
| Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
| dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
| Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL |
| Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
| Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
| Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
| LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
| micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
| Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
| microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
| MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
| no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
| Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
| Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
| Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
| Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
| Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
| Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
| Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
| sterile Petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required. |
| Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
| Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
| White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |
References
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