Summary
Внутрипросветная накаливания окклюзией средней мозговой артерии является наиболее часто используемым в vivo модель экспериментальной инсульта в грызунов. Альтернативный хирургический подход к позволить общей сонной артерии ремонт производится здесь, что позволяет реперфузии общей сонной артерии и полной реперфузии на территорию средней мозговой артерии.
Abstract
Ишемический инсульт является одной из основных причин взрослых долгосрочной инвалидности и смерти во всем мире. Современные методы лечения доступны ограничены, с только ткани плазминогена активатор (ДТС) как утвержденные наркологической целевой ишемических инсультов. Текущие исследования в области ишемического инсульта фокусируется на лучшего понимания патофизиологии инсульта, развивать и расследовать Роман фармацевтических целей. Надежный ход экспериментальной модели имеют решающее значение для прогрессирования потенциальных методов лечения. В средней мозговой артерии окклюзии (СМАо) модель клинически значимых и наиболее часто используемые хирургические модель ишемического инсульта в грызунов. Однако итоги этой модели, такие как объем поражения, связанные с высоким уровнем изменчивости, особенно у мышей. Альтернативная модель СМАо, описанные здесь позволяет реперфузии общей сонной артерии (ОСО) и повышенной перфузии на территории средней мозговой артерии (MCA), используя блокнот ткани с фибриноген основанные герметик для ремонта судна и улучшенной благосостояние мышей, избегая перевязки наружной сонной артерии (ЭКА). Это уменьшает зависимость от круга Уиллиса, который считается весьма анатомически переменной у мышей. Репрезентативные данные показывают, что используя этот альтернативный хирургический подход уменьшается изменчивости объема поражения между традиционным подходом СМАо и альтернативный подход, описанный здесь.
Introduction
Одной из основных причин церебрального инсульта является фокуса ишемии на территории средней мозговой артерии. Ткани активатор плазминогена (ДТС) является только медикаментозное лечение, доступных с доказанной эффективностью, несмотря на многочисленные испытания лекарств, предназначенных для ишемического инсульта1,2. Однако из-за соображений безопасности и узкого терапевтического окна (< 4,5 ч), только ~ 15% всех пациентов, перенесших инсульт, имеют право получать ДТС, и ставки реканализация может быть < 50%3,4.
Воспроизводимость и клинически значимых Животные модели инсульта являются важными для информирования о разработке новых и потенциальных инсульта терапевтического лечения. Однако из-за опасений относительно последовательности и изменчивости в решениях с животных моделей, по-прежнему важно уточнить существующие в естественных условиях модели улучшить перевод от доклинические исследования в клинику. Постоянной озабоченности для инсульта исследований5является отсутствие перевода от доклинические экспериментальные эффективности потенциальных методов лечения для клинического использования. Причины неудачи перевода могут быть несколько и может быть связано с, например, суда дизайн, лечения задержки, неоднородность клинических инсульта, и ограничения животных моделей используется6. Ключевой задачей для исследований инсульт остается развитие безопасного и эффективного лечения.
Окклюзии средней мозговой артерии (СМАо) путем вставки внутрипросветная накаливания является наиболее часто используемых в vivo грызунов модель экспериментальной инсульта. Эта модель позволяет восстановление кровотока после ишемии индукции, подражая события, которые происходят в человека инсульта7. Однако в частности в мышей, гетерогенных поражения томов с разнообразных стандартных отклонений происходят даже несмотря на то, что определено хирургические протоколы являются прикладной8,9,10. Это типичный чтобы увидеть Бимодальная распределение малых полосатой и большой striato корковых поражения тома11. Чтобы побудить ишемии, накаливания обычно вставляется через разрез ОАС или ЭКА, которая затем оставаться постоянно перевязаны12. Постоянный лигирование ОСО предотвращает восстановление кровотока в внутренней сонной артерии (МКА) и, впоследствии, на территории MCA. Это вызывает реперфузии быть зависит от обеспечения поставок в круг Уиллис (Корова). Корова имеет анатомическая вариабельность между отдельных животных, особенно в C57BL/6 мышей а сорт обычно используется в в естественных условиях ход исследований13. Альтернативный метод, накаливания вставки через ЭКА, разрешить продолжение перфузии через ОСО, но этот метод компромиссов артериальной поставки на территории ЭКА, который был проявлен в крыс, чтобы иметь пагубное воздействие на животных благополучие14.
Опора на корову для обеспечения снабжения и реперфузии в установленной модели СМАо может частично, приходится изменчивости объема поражения, после окклюзии. Мы описываем альтернативным мышиных хирургическая процедура, где избегается ЭКА перевязки и отремонтированы разрез ОАС, таким образом позволяя реперфузии через ОСО, независимо от коровы. Ремонт ОСО разрез ранее показано в крыс приведет к успешной реперфузии через ОСО15. Мы применили этот подход успешно в мышей11 и сообщить здесь протокол, который приводит к сокращению изменчивости объема поражения, главным результатом измерения, используемых в экспериментальной ход исследований.
В этом протоколе мы продемонстрируем провести СМАо через ОСО судна накаливания вставки следуют ОСО судно ремонт, который включает в себя ткани pad и герметик приложение разрешить реперфузии.
Protocol
Этот протокол и представленные данные были проведены в соответствии с Законом Великобритании животных (научные процедуры), 1986 год (лицензия 60/4315 проекта) и после институциональных этические утверждения. Все эксперименты сообщаются в соответствии с исследования животных: отчетности In Vivo экспериментов (прибытие) рекомендации16.
1. Подготовка
- Ознакомление взрослых самцов мышей C57BL/6 для послеоперационного ухода (например, окружающая среда, постельные принадлежности, восстановления продуктов) по крайней мере за 48 ч до операции.
Примечание: Пост-СМАо животных зачастую испытывают трудности с еды и питья после операции.- Чтобы предотвратить чрезмерная потеря веса после операции, акклиматизации животных для любой пост СМАо диеты, например, размещение регидратации гель, гелем еда и пропитанной/мокрый нормальной диете гранул непосредственно на пол клетки.
- Измените постельные принадлежности клетки к послеоперационным постельных принадлежностей, например белой чип.
- Простерилизуйте все хирургические инструменты до начала хирургического set-up или процедур.
- Сделать это путем автоклавирования инструменты (с не менее 121 ° C, 15 psi, для 15 мин) или посредством использования окиси этилена (после правильного производителя, за 8-10 ч).
- Лечить все поверхности до создания процедуры. Охватывают всех поверхностей с стерильные хирургические шторы или автоклавного фольги для элементов, которые требуют обработки во время операции. Используйте асептической техники для продолжительности процедуры.
Примечание: Газобетона фольги может использоваться для покрытия инструменты или оборудование, которые должны быть проведены во время операции. С помощью стерильных перчаток и методов, фольга может применяться и, затем, элемент может быть помещен в поле стерильным. После этого необходимо будет изменить стерильные перчатки.
2. средней мозговой артерии окклюзии хирургия
- Используйте взрослых самцов мышей C57BL/6, весом 24 – 31 g во время операции. Вызвать обезболивание с помощью изофлюрановая 5% в 2 Л/мин O2, в камере красный пластиковый анестезии.
- После индукции, уменьшить изофлюрановая для поддержания адекватной анестезии глубины для хирургии (например, 1,5-2% в 70% N2O2/30% O2), поставляемые маски в сочетании с приспособления системы к снижению хирурга воздействие изофлюрановая.
Примечание: закиси азота (N2O2) может использоваться в сочетании с кислородом (2O) сократить необходимое количество изофлюрановая на глубину адекватной анестезии. - Управление системными анальгезии предоперационная [carprofen, 10 мг/кг подкожно (sc.)] и местной анестезии в разрез сайта (бупивакаин, sc. 2 мг/кг, разбавленных 1:10 в 0,9% физиологического раствора) Пери оперативно.
- Предоперационная администрирование жидкости иньекциями внутрибрюшинного (ИС.) 200 мкл стерильных подогретую 0,9% раствора NaCl.
- Брить шерсть права височной области и региона вентральной шеи с использованием малых стрижки подвергать кожу. Дезинфекция хирургические кожи области, с помощью раствора хлоргексидина 5% на 3 мин применить глазные смазки на оба глаза, чтобы предотвратить их от пересыхания во время операции.
Примечание: Если требуется для чтения оксиметрии импульса монитор насыщения крови кислородом, сердечного ритма и частоты дыхания, используйте крем удаления волос для очистки задняя нога волос. Применение крема с помощью чистого хлопка почки и, после удаления волос, мыть области с раствор разбавляют хлоргексидина. Выполните этот шаг в дооперационном области для сведения к минимуму риска свободные меха, загрязняя стерильные хирургические области. Исследователи предпочитают использовать другие препараты хирургической сайта в соответствии с местной практикой. - Передача мыши в области хирургической и поместите его в лежачем положении на циновку гомойотермных тепла, охватываемых стерильные пелерина. Поддержание анестезии через носовой конус. Вставить ректальный датчик контроля температуры тела мыши и поддерживать его на 37,0 ± 0,6 ° C.
- До любых хирургических разрезов проверьте вывод рефлекс задние лапы и мигать рефлекс для подтверждения глубины анестезии.
- Прикрепите Лазерная доплеровская флоуметрия (LDF) зонд для записи поток крови к территории MCA.
- С помощью рассечение стереоскоп, надрезают < 1 см на середину между правый глаз и уха на височной кожи с помощью скальпеля № 15. Тупо вскрыть основной ткани, охватывающих черепа, нежно соскабливания это от костей и сушки поверхности с стерильные ватные тампоны.
Примечание: Необходимо позаботиться не повредить височной мышцы. - Завладеть 0,7 мм, гибкие одного волоконно оптических зонд LDF монитор, сократить ее конца, используя острый скальпель получить плоский край, это протолкнуть собственник форме пончика зонд и место небольшое количество оптических соответствия геля в конце волокна.
- Поместите небольшое количество водостойкий клей супер-клей вокруг нижнего края держателя зонда; разрешить это частично сухой и стать липким.
- Сухие выше височной кости черепа и место небольшое количество клея актуальные ткани в круг, чтобы кости, просто достаточно для держателя зонд.
- Установите держатель зонда, с волоконно оптический зонд уже на месте, в этой области (боковым 6 мм и 2 мм дистальной от bregma).
- Дать время для клей для просушки; После того, как сухой и придает, начните запись данных LDF.
- С помощью рассечение стереоскоп, надрезают < 1 см на середину между правый глаз и уха на височной кожи с помощью скальпеля № 15. Тупо вскрыть основной ткани, охватывающих черепа, нежно соскабливания это от костей и сушки поверхности с стерильные ватные тампоны.
- Аккуратно Переверните животное в лежачем положении, заботясь, чтобы поддержать лазера Doppler зонд и не допустить его отряда. Осторожно лента два передних лапах вниз с микропористой медицинская лента, раздвижные пару хлопка почки (или нечто подобное, как закрытые щипцы) под шею поднять области и создать напряженность. Покрытие мыши с стерильных Пелерина для поддержания асептических покрытия.
- Начните диссекции и воздействия ОСО.
- Сделайте надрез срединной линии 1,5 см на подвергается вентральной шеи с использованием лезвие скальпеля № 15.
- Использование методов нежный тупым рассечение, аккуратно убрать слюнных желез в стороны, подвергая трахеи.
- Использование тупой рассечение, вскрыть ОСО от окружающих тканей и блуждающего нерва.
Примечание: Не прикасайтесь блуждающего нерва непосредственно, как любой ущерб блуждающего нерва может ухудшить мобильности, кормления и дыхание.
- Проходят две небольшие (2 см) секции не растворимые шва 6-0 ниже ОАС, спинной судна и вентральных блуждающего нерва. Нарисуйте один шелковый галстук ближе к хирургу и связать его плотно вокруг ОСО (проксимальной галстук). Слабо свяжите второй шелковый галстук (дистальной галстук) к бифуркации МКА/ЭКА.
- Для начала нужно изолировать часть ОАС, применять микрососудистой клип чуть выше дистальной галстук, но не препятствует бифуркации. Использование микро беззаботными ножницы, сделайте небольшое отверстие в ОАС.
Примечание: ЭКА должна оставаться патентов на все времена. Разрез ОАС должен быть не более 40% от ширины судна и в легко доступном месте брюшной; в стадии ремонта судна пост СМАо это будет играть важную роль. - Вставьте 7-0 леска силиконовым покрытием в ОСО, продвижение к микрососудистой клип.
Примечание: Размер нити накала должны быть установлены на основании мыши вес до операции; обратитесь к рекомендации производителя.- Затяните дистальной галстук, достаточно закрепить нить накала на место без его повреждения. Удаление микрососудистой клип, используя клип Держатели.
Примечание: Не кровопотери должно рассматриваться на данный момент. Если есть обратного потока крови, галстук, удерживая нити накала не является достаточно жесткой.
- Затяните дистальной галстук, достаточно закрепить нить накала на место без его повреждения. Удаление микрососудистой клип, используя клип Держатели.
- Заранее накаливания в ЗКИ.
- Обеспечить накаливания остается в пределах ЗКИ и не пройти в крылонебный артерии (PPA). Для этого слегка подъёма и перемещения ОАС, используя один из шелковые галстуки, на внешней стороне тела животного, и направить накаливания согнуть мимо внутри перед открытием PPA.
Примечание: После расширенный MCA ветви происхождения, снижение относительной кровотока в предоставленный территорию будет виден на МСО ценностей; Это подтверждает накаливания размещения.
- Обеспечить накаливания остается в пределах ЗКИ и не пройти в крылонебный артерии (PPA). Для этого слегка подъёма и перемещения ОАС, используя один из шелковые галстуки, на внешней стороне тела животного, и направить накаливания согнуть мимо внутри перед открытием PPA.
- Безопасный нить накала в место с дистальной шелковый галстук, связывая это крепче. Оставьте его на месте в течение окклюзии период времени.
Примечание: Зависимые на отдельных протоколов, животное могут быть перемещены в клетке восстановления, ниже раны, наложение швов, чтобы восстановить, или остаются под наркозом в течение всего периода окклюзии. В последнем случае убедитесь, что раны предотвращается от высыхания с помощью стерильных подогретую физиологического раствора NaCl 0,9%.
3. после окклюзии
- В конце периода СМАо немедленно отозвать накаливания до тех пор, пока белые нити головы хорошо видна.
- Затем ослабьте дистальной ОСО связать просто достаточно, чтобы удалить нити голову большую часть пути вне судна.
Примечание: Нити могут быть полностью удалены на данный момент если хирург уверенно с скоростью завязать дистальной галстук для предотвращения потери крови. - Поместите один микрососудистой клип в горизонтальном положении к бифуркации ОСО рядом с дистальной галстук. Ослабьте дистальной галстук и полностью удалить нити накала. Добавьте еще один микрососудистой клип ниже проксимальной ОСО галстук к хирургу.
Примечание: Убедитесь, что судно находится достаточно далеко в вилки зажим, чтобы предотвратить любое проскальзывание. Размещение клипов важно обеспечить клип смывки легкий доступ на более поздних этапах. Клипы могут использоваться для помочь поднять судно позволяют лучше распродажа и размещение ткани патч, поместив клипы горизонтально через окружающие мышцы. - Осторожно удалите оба шелковые галстуки с помощью Дюмон #5 щипцами или микро беззаботными ножницы и сухой области, используя стерильные ватные палочки.
Примечание: Необходимо позаботиться не нарезать через/судна. - В стерильные Петри блюдо добавьте фибриногена и тромбина герметик решений 1 и 2 (см. Таблицу материалы), обеспечение этих двух веществ оставаться отдельной, готовы для смешивания позже.
Примечание: Только очень небольшие объемы агентов, требуется (< 0,25 мл каждая). Сохранение решения отдельных предотвращает преждевременное реакции между двумя компонентами. Убедитесь, что крышка заменяется таким же образом, как она была удалена для предотвращения перекрестного загрязнения двух шприцы, которые причинили бы агент реагировать и набора в шприц. До использования хранения решений при-20 ° C. При необходимости для первой операции, оттепель герметик до комнатной температуры. Не заморозить герметик; Она должна оставаться при комнатной температуре и может храниться таким образом. Шприц может использоваться через несколько операций, что делает его экономически целесообразно; Однако мы рекомендуем не использовать же флакон для больше чем 1 неделю для предотвращения загрязнения. - Используйте тупой рассечение вдоль мышц с Dumont 5 не щипцов и микро беззаботными ножницы для получения тонкий ломтик брюшной мышцы ключично для ткани pad, обеспечение кусочек толщиной не более 1 мм и проходит вдоль верхней волокна мышцы.
Примечание: Не пересекают через/мышцы, как это будет значительно ухудшить его функции. Ткань должна быть достаточно большой, чтобы комфортно охватывать разрез ОСО. - С помощью щипцов Дюмон #5, Возьмите панель ткани и смешайте ткани равномерно через два фибриногена и тромбина герметик решений, образуя канал между двумя реагентов. Свертывание произойдет быстро; как только начинается коагуляция, удалите панель ткани для ОСО разрез. Место ткани pad плоский вниз с средней фирмы давления и открытые щипцами.
- Быстро удалите дистальной микрососудистой клип пока еще мягко Холдинг pad ткани в месте.
Примечание: Это позволяет некоторые обратного потока крови к дальнейшей активизации фибриногена и тромбина герметик реагентов. Достаточно просто давление требуется провести pad на месте, но не для того, чтобы полностью блокировать судна. - Медленно облегчить давление с подушки ткани, что позволяет крови течь в области разреза. Теперь медленно и осторожно отпустите давление от проксимальных микрососудистой клип и полностью удалить.
- Примечание: Для того, чтобы убедиться, что судно становится полностью патент, размещение панели ткани и удаления микрососудистой клипы должно произойти быстро чтобы предотвратить уплотнение ткани площадку внутри ОАС. Однако если есть небольшое количество крови утечки, повторно место некоторые светового давления на ткани площадку далее выделять время для сгустков и герметизации происходят. Если утечки крови является существенным или панель ткани, по-видимому, не быть уплотнения, поддерживайте давление для предотвращения потери крови и заменить оба ОСО микрососудистой клипы, чтобы изолировать разрез и предотвратить дальнейшие потери крови.
- Быстро удалите дистальной микрососудистой клип пока еще мягко Холдинг pad ткани в месте.
- В случае, если панель ткань не печать на судно, вторая попытка можно сделать, следующие шаги 3.3 – 3.7.3.
- После того, как судно запечатан, шов раны с помощью швов растворимые 6-0. Если LDF запись была продолжена на протяжении операции, удалите LDF из черепа и швов раны с помощью растворимые шва 6-0.
4. послеоперационный уход
- Поместите животное в клетке подогретую восстановления (расположенный на подогревом полка/мат, на 35 ° C, или в камеру с подогревом).
Примечание: Исследователи предпочитают использовать другие температуры и длительности в соответствии с местной практикой. - Обеспечить всех животных с 200 мкл подогретую 0,9% NaCl физиологическим sc. сразу после операции, на 4 ч после операции и 2 x ежедневно за 72 ч.
Примечание: Администрация подогретую 0,9% NaCl – животное водить. Если требуется больше, больше жидкости могут администрироваться обеспечить хорошее восстановление. - В клетке восстановления дают неограниченный доступ животных к гранулы сырой диеты, диетические сухие гранулы, регидратации гель и гелем еда, наряду с ad libitum доступ к воде.
- Повторять инъекции carprofen наук на 24 ч после операции (см. шаг 2.3).
Примечание: Все животные получили ту же дозу carprofen; любой эффект нейропротекторной скорее всего будут незначительными. - На регулярной основе в течение 48 часов выполняют послеоперационное мыши гримасу, забив17 для оценки уровней боли помощи решение осуществлять дальнейшее обезболивание.
- Вес животных непосредственно перед хирургии и затем ежедневно после процедуры. Выполняйте ежедневные наблюдения и полного благополучия листы для наблюдения за их питание и потребление воды и клинические признаки.
- Проведение функциональных наблюдений на 24 h и 48 ч после операции. Оцените мышей в масштабе фокуса дефицита. Оцените их симметрии тела, обязательного кружили, походки, 45° сетки восхождение, круживший поведение, асимметрия передних конечностей и нитевидные касание ответ18,19,20.
5. магнитно-резонансная томография и обработка изображений
- Измерьте объем поражения (LV), с использованием структурных магнитно-резонансная томография (МРТ).
Примечание: Альтернативные методы, такие как гистологические окрашивание с triphenyltetrazolium хлорид (TTC), ранее были использованы и корреляции для структурных данных МРТ. Однако этот метод может использоваться только в конечной точке исследования и не продольно. С помощью продольных МРТ сканирование уменьшит количество животных, необходимых для исследования.- После 48 ч, после индукции СМАо анестезировать мыши с изофлюрановая (5% изофлюрановая в 1 Л/мин2 O для индукции), 1,5-2% изофлюрановая для обслуживания.
- Передать МРТ колыбель мыши, поместите его на дыхание датчик для контроля за его частота дыхания и имплантата ректальной температуры зонда для контроля температуры во время сканирования. Место 2-канальный мыши мозг РФ получить катушки над мозг для сигнала и место колыбель в 9,4 Т горизонтальное отверстие сканера.
Примечание: Здесь, объем катушки с 72 мм внутренний диаметр использовался для передачи РФ. - Приобрести T2-взвешенный сканирование с помощью быстрого спин эхо последовательности. Установите время повторения (TR) 3000 ms и эхо времени (TE) до 40 г-жа использования 18 мм x 18 мм как поле зрения (FOV) и получить матрицу приобретение 256 x 256 с кусочками 18 x 0,8 мм и три средних сигнала в течение приблизительно 10 минут.
- Приобрести диффузии тензор изображения (DTI) с помощью быстрой спин эхо последовательности. Установите TR до 1730 МС, TE для 35 ms, ПЗ до 20 мм х 20 мм и получить 128 x 128 приобретение матрица с ломтиками 16 мм x 1 мм, два сигнала средние, 14 диффузии кодирования направлений и максимальная b-значение 1024 s/мм2.
- Измерьте LV на Т2 взвешенных изображениях с помощью дисплея изображений и Измерение пакета программного обеспечения. Измерьте области пораженного, сопоставление значения вместе, чтобы вычислить объем всего поражения при учете МРТ толшины (устанавливается во время МРТ).
- Принимать во внимание любую опухоль и процент площади поражения томов при измерении полный контралатеральной и ипсилатеральные полушарий. Для любого мозга опухоль из-за отека, с использованием косвенного метода для измерения объема поражения как описано ранее,21,22. Включают только те фрагменты, которые содержат ткани коры и не лобной доли или тканей мозжечка согласно стандартной мыши мозга Атлас избежать гиперкоррекция.
- Измерение параметров диффузии поражения и получить ядро и полутень регионы интереса.
- Дробные анизотропии (ФА) карты от изображения тензора диффузии, с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа МРТ и генерировать коэффициент диффузии очевидной (ADC).
- Совместите DTI изображения с Т2 взвешенных изображений, используя соответствующий образ программного обеспечения для анализа способны выполнять линейные регистрации изображений. После регистрации вычтите диффузии взвешенный поражения маски (ишемический ядро) от T2-взвешенный поражения маски (ишемический ядро и полутень) оценить регионе полутень. Применить полученный маски (ядро и полутень) к ADC и Обладатель карты для количественной оценки параметров диффузии в рамках основных и полутень.
- Перевести ипсилатеральные ядро и полутень маски о срединной мозга для того чтобы получить контралатеральной ADC и FA значений для сравнения.
Representative Results
В общей сложности 24 взрослых самцов мышей C57BL/6, веся между 24-31 g во время операции, были использованы в исследовании. Одно животное умер после окклюзии средней мозговой артерии (СМАо) и один был исключен по причине хирургических осложнений. Данные, представленные здесь, взяты из ранее опубликованных работ авторами. Они использовались для иллюстрации эффект ремонта судна на СМАо результаты11. Все данные выражаются как Чет среднее ± стандартное отклонение. Данные статистически были оценены для нормальной жизни, с помощью теста Омнибус нормальности Агостино-Пирсон. Параметрические данные были сопоставлены с помощью студента t-тест (для двух средств) и односторонний дисперсионный анализ с Sidak тест (несколько средств). Non параметрический данные были сопоставлены с помощью теста U Манна-Уитни. Изменчивость параметрических данных была оценена с помощью F-тест, и изменчивость непараметрических данных была оценена с помощью теста Левин в.
Как правило, в процедурах СМАо, наложения накаливания вставляется в ОСО и ЭКА перевязано для предотвращения этой нити от передачи в ЭКА, а не в ЗКИ. Избежание ЭКА перевязки и дополнением анальгезию показал тенденцию к снижению веса потеря на 48 ч пост СМАо, по сравнению с данными предыдущих исследований, проведенных же хирург за то же время СМАо с помощью ЭКА перевязки с без обезболивания, тогда как LV появилась не влияет, смотрите Рисунок 1.
Мышей прошли 60 мин СМАо индуцированной ишемии после реперфузии с ремонтом судна ОСО или с типичной лигирование ОАС подхода. Схематическое изображение лигатур и unligated ремонт ОСО показан на рисунке 2.
Лазерная доплеровская флоуметрия был использован для подтверждения крови поток перфузии на территории МКА в СМАо, до и после ремонта судна ОСО. Рисунок 3 показывает, что 5 мин после удаления накаливания, региональные мозгового кровотока (rCBF) значительно возросла в регионе мозга MCA. Перфузии сохранялся до ремонта судна, с увеличением перфузии на территорию MCA показано после ремонта судна ОАС, предполагая, что ОСО ремонт допускается повышение артериального кровоснабжения ишемического территорию, по сравнению с опоры на Круг Уиллис одиночку.
T2-взвешенный МРТ была использована для определения всего LV, а DTI сканов использовались для определения основных LV, 48 ч после СМАо. На рисунке 4A показано нет существенных различий в общей или core LV ремонт и перевязаны процедуры групп. Однако, изменчивость данных как для всего и основных LV, как оценить с помощью Lavene в тест для непараметрических или F-тест для параметрических данных, значительно сократилось в группе ремонт ОСО. Общая LV была разбита на корковых и подкорковых LV, как показано на рисунке 4В. Кортикальной части был значительно меньше переменной в группе ремонт ОСО, тогда как югу кортикальной части поражения был неизменным между двумя группами процедурные.
Анализ питания указал, что меньше животных в группе лечения потребуется продемонстрировать 30% сокращение LV, после СМАо с использованием ОСО ремонта по сравнению с типичной ОСО лигируют процедуры, см. таблицу 1. Предположение о мощности 1-β = 0,8 и уровень значимости α = 0,05 и предсказание 30% снижения в LV между гипотетической контроля и испытаний группы были использованы для анализа мощности. Кроме того предполагалось равное расхождение между группами. Таблица 1 показывает количество животных, необходимых для теста и контрольных групп, когда либо типичный ОСО лигируют используется метод или метод ремонта Обновлено ОАС, как описано здесь, используется. Обратите внимание, что в тестовую группу относится к гипотетической обрабатываемой группы животных и в контрольной группе относится к группе гипотетической управления; СМАо претерпит обе группы.
Рисунок 1: комбинированный анальгезии лечения и бездействие лигирование ЭКА на исходы после СМАо. (A) вес тела, как процент от pre СМАо веса, снизилась в первые 2 d после СМАо для обеих групп. На второй день после СМАо ЭКА unligated группы (обезболивание подходить без перевязки ЭКА в СМАо) показал тенденция к снижению веса потеря. (B) Эта группа показывает объем поражения (3мм), измеряется стандартных triphenyltetrazolium хлорид (TTC) пятная 48 ч после СМАо. Данные являются среднее ± стандартное отклонение. ЭКА лигируют: n = 17, ЭКА unligated: n = 10. Эта цифра была изменена от Тротман-Лукас и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: схема показаны стандартный метод ОСО и альтернативных ОСО ремонт метод после СМАо. (A) Эта схема изображает постоянно перевязаны ОАС с использованием не растворимый швов применяется к любой стороне ОСО разрез, привело постоянного лигирование правой ОСО. (B) Эта схема изображает альтернативный метод repair ОСО. Площадку небольших ткани, покрытой фибриногена и тромбина герметик используется для покрытия ОСО разрез, герметизации разрешить полное перфузии права ОСО. Эта цифра была изменена от Тротман-Лукас и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: параметры потока (rCBF) региональный церебрального кровотока, после СМАо. RCBF изменилась 5 мин после СМАо удаление накаливания для обеих ОСО лигируют и ОСО ремонт групп (пост СМАо), по отношению к rCBF измеряется во время СМАо. Эта панель показывает rCBF данных непосредственно перед судно с ОСО (предварительный ремонт) и 5 мин после ремонта ОСО (после ремонта). Значительное увеличение rCBF показаны 5 мин после удаления накаливания (пост СМАо) в обеих группах. Дополнительное увеличение rCBF показано после ремонта ОСО (после ремонта) в группе ремонт ОСО. Никакой разницы в rCBF показана между 5 мин пост СМАо и до ремонта. Данные, отображаемые конденсируются из анализируемого время курс представления данных ключевого времени точек, здесь как среднее ± стандартное отклонение. ОСО лигируют: n = 10, ОСО отремонтированы: n = 10; P < 0.01, ***P < 0,001, ns: незначимая. Эта цифра была изменена от Тротман-Лукас и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: анализ объема поражения, полученные методами МРТ. (A) группа показывает объем поражения (LV;3мм) на 48 ч после СМАо, Общая LV, взяты из T2-взвешенный МРТ изображения (всего LV) и основной LV, взяты из DTI сканирование и анализ (Core LV). Представитель изображения показывают объем всего поражения от T2 сканирования фрагмента изображения с DTI ядро поражением объем маска. Изменчивость в группах был значительно сокращен для обоих всего LV (P = 0,015, ОСО ремонт: n = 10, ОСО лигируют: n = 10, F-тест) и core LV (P = 0,043, ОСО ремонт: n = 9, ОСО лигируют: n = 6, Lavene тест), оценить с помощью F-тест для параметрических данных или Левин в тест для непараметрических данных. (B) Эта группа показывает LV на 48 ч после СМАо, взяты из T2-взвешенный МРТ изображения и разделен на поражение корковых и подкорковых областей. ОСО ремонт значительно сократила изменчивость данных (P = 0,03, F-тест) в кортикальной части очага поражения, но не влияет на данные показано изменчивости в подкорковых части очага поражения. ОСО ремонт: n = 10, ОСО лигируют: n = 10. Данные являются среднее ± стандартное отклонение. # P < 0,05 (F-тест), xP < 0,05 (Lavene тест). Эта цифра была изменена от Тротман-Лукас и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Подход | Объем поражения (LV; мм3; среднее ± с.д.) |
Мощность | Уровень значимости | Anticiapted разница | Требуемый размер группы |
| ОСО лигируют (традиционный подход) | 94.08 ± 53.79 | 0,8 | 0.05 | 30% | n = 58 |
| ОСО отремонтированы (новый подход) | 51.73 ± 22.78 | 0,8 | 0.05 | 30% | n = 35 |
Таблица 1: традиционные ОСО перевязки с альтернативой сравнительный анализ представительной власти ОСО ремонт метод объяснил здесь. Эта таблица показывает мощность анализа, проведенного для вычисления размера предполагаемых группы, требуется обнаружить в LV значительная разница между контрольной группой, традиционной или альтернативной (новый) подход и группы тестов (предсказал). В таблице приведены группы размеров как требуется если мощность 0,8 Предполагается, применяется уровень значимости 0,05, и если группа предсказал тест показывает 30% разницы в LV по сравнению с контрольной группой. В таблице показаны результаты для обеих СМАо подходы (ОСО лигируют и ОСО отремонтированы) чтобы определить, если есть разница в количество животных, необходимых для получения 30% разницы в LV. Для обоих методов равные дисперсии подразумевается между тестом и контрольной группой. Эта цифра была изменена от Тротман-Лукас и др. 11.
Discussion
Накаливания индукции переходных СМАо грызунов является наиболее часто используемые модели экспериментальной инсульта, поскольку она позволяет реперфузии в пострадавшие районы, подражая возникновение событий после клинических ишемического инсульта7. Здесь это альтернативный хирургический подход к традиционным методом накаливания индуцированной переходных СМАо мышей. Альтернативный подход, использующий анальгезии лечения, избежания лигирование ЭКА и ОСО разрез ремонт, результаты в снижение изменчивости LV при оценке с использованием МРТ и гистологической пятная методы11.
Традиционные подходы к побудить СМАо во многом полагаются на перерезка, или по крайней мере перевязки, ЭКА, который был проявлен, крыс, чтобы повлиять на питьевой поведение и увеличение веса тела после СМАо14. Протокол, определенный здесь, в мышей, с уклонением ЭКА перевязки и дополнением анальгезию предложил сократить потери веса тела после СМАо с не влияет на объем поражения. Использование обезболивания избежать или по крайней мере не сообщается, в большинстве исследований экспериментальных инсульта, из-за возможных накладывающееся воздействие на итоги экспериментальных. Однако избегая анальгезии полностью не всегда оправдано, и есть необходимость сбалансировать потребности Благосостояние животных с достижения научных целей.
Различия в животных размер, сорт и цереброваскулярные анатомии, помимо размера и типа вариации накаливания, предлагается оказывать влияние на ход результаты23,24. Альтернативный подход, описанный здесь избежать зависимость корова при реперфузии, тем самым уменьшая, по крайней мере, частично, изменчивость, видели между животными объема поражения. Анатомии коровы очень переменной в мышей, в частности в C57BL /6 штамм, который часто используется в экспериментальной ход исследований. 90% мышей C57BL/6 имеют неполные коровы из-за разнообразных задняя общения артерии (PcomA) проходимости, которые могут иметь влияние на объем ишемического повреждения из-за недостаточной перфузии структур за пределами территории MCA13, 25. ремонт ОАС в мышей, как показано здесь, результаты в восстановлении крови течь через ОСО в области ишемической, как описано ранее в крыс15. Репрезентативных данных здесь показывают, что ремонт ОСО увеличивает реперфузии, хотя поток крови в ОАС не измерялось напрямую. Однако это возможно для хирурга для визуализации reperfuse ОСО с кровью после ремонта судна, как он возвращается в пульсируя и полное состояние вдоль ствола, проксимальных и дистальных к месту ремонта. Это визуальное подтверждение, наряду с Лазерная доплеровская флоуметрия чтений области ишемической, может использоваться для подтверждения успешного ремонта судна. Время между приложение pad ткани и удаления клипа судно из ОАС может иметь влияние на результате проходимость ОАС, как сокращение времени между приложение pad ткани и клип удаление будет препятствовать придерживаясь o панель ткани pposite сторона ОАС. Хотя технически сложной, альтернативная процедура СМАо объяснил здесь не требует никаких дополнительных навыков, чем те, которые требуются для выполнения хирургической индукции СМАо мышей.
Традиционно ассоциируются с высокой изменчивости результатов мер, экспериментальная ход исследования могут иметь тенденцию быть недостаточна. Этические и обеспечения требований в сочетании с экономической и практической проблемы может способствовать исследования, будучи пригодным. Путем уменьшения вариативности в итоговом документе и, таким образом, производство более последовательной поражения результаты экспериментальной группы, более эффективной мощности вычисления могут производиться с конечной целью исследований является надлежащим питанием.
В заключение это альтернативная процедура ремонта ОАС, мышей, приводит к менее изменчивости объема поражения, после экспериментальной инсульта и небольших экспериментальных групп позволяет необходимо для тестирования эффект лечения, когда соответствующие власти вычисления используются.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Национальный центр для замены, изысканности и сокращение животных в научных исследованиях (NC3Rs; NC/M000117/1 для CG). Авторы благодарят сотрудников отдела биомедицинских услуг, Университет Лестера, за их уход подопытных животных и Мария Viskaduraki за ее статистические консультации. Представитель результаты приспособлены с разрешения от11заболеваний модели и механизмы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
| 7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
| 9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
| Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
| Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
| C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
| Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
| Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
| Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
| Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
| dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
| Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
| dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
| Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL |
| Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
| Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
| Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
| LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
| micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
| Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
| microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
| MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
| no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
| Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
| Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
| Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
| Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
| Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
| Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
| Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
| sterile Petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required. |
| Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
| Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
| White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |
References
- O'Collins, V. E., et al. 1,026 Experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for Ischaemic Stroke: Translation from the Bench to the Bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
- Reeves, M. J., et al. Acute Stroke Care in the US: Results from 4 Pilot Prototypes of the Paul Coverdell National Acute Stroke Registry. Stroke. 36 (6), 1232-1240 (2005).
- Wardlaw, J. M., Murray, V., Berge, E., del Zoppo, G. J. Thrombolysis for acute ischaemic stroke. Cochrane Database of Systematic Reviews. (7), CD000213 (2014).
- Pangalos, M. N., Schechter, L. E., Hurko, O. Drug development for CNS disorders: strategies for balancing risk and reducing attrition. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (7), 521-532 (2007).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathologica. 47 (3), 213-227 (2009).
- Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-289 (1992).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: Size, mechanism, and purpose. NeuroRX. 2 (3), 396-409 (2005).
- Dirnagl, U. Bench to Bedside: The Quest for Quality in Experimental Stroke Research. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26 (12), 1465-1478 (2006).
- Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6, 21086 (2016).
- Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research - advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Research. 997 (1), 15-23 (2004).
- Trueman, R. C., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Translational Stroke Research. 2 (4), 651-661 (2011).
- Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Experimental Neurology. 195 (2), 372-378 (2005).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. Plos Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-479 (2010).
- Orsini, F., et al. Targeting Mannose-Binding Lectin Confers Long-Lasting Protection With a Surprisingly Wide Therapeutic Window in Cerebral Ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Simoni, M. G. D., et al. Neuroprotection by Complement (C1) Inhibitor in Mouse Transient Brain Ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 23 (2), 232-239 (2003).
- Clark, W., Gunion-Rinker, L., Lessov, N., Hazel, K. Citicoline Treatment for Experimental Intracerebral Hemorrhage in Mice. Stroke. 29 (10), 2136-2140 (1998).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of Brain Edema on Infarct Volume in a Focal Cerebral-Ischemia Model in Rats. Stroke. 24 (1), 117-121 (1993).
- Loihl, A. K., Asensio, V., Campbell, I. L., Murphy, S. Expression of nitric oxide synthase (NOS)-2 following permanent focal ischemia and the role of nitric oxide in infarct generation in male, female and NOS-2 gene-deficient mice. Brain Research. 830 (1), 155-164 (1999).
- Connolly, E. S., Winfree, C. J., Stern, D. M., Solomon, R. A., Pinsky, D. J. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse Strain Differences in Susceptibility to Cerebral Ischemia are Related to Cerebral Vascular Anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
- Kitagawa, K., et al. Cerebral Ischemia after Bilateral Carotid Artery Occlusion and Intraluminal Suture Occlusion in Mice: Evaluation of the Patency of the Posterior Communicating Artery. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).
