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Bioengineering

के कुशल वितरण के लिए Cationic Nanoliposomes की जनरेशन इन विट्रो प्रतिलिखित दूत आरएनए

Published: February 1, 2019 doi: 10.3791/58444
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 2,3, 1, 2,3, 1
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory, University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology, Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine, Monash University

Summary

यहाँ हम cationic nanoliposomes की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, जो शुष्क फिल्म पद्धति पर आधारित है और इन विट्रो में के सुरक्षित और कुशल वितरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

विभिन्न रोगों के उपचार के लिए दूत आरएनए (mRNA) आधारित चिकित्सीय चिकित्सा के विकास में अधिक से अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है क्योंकि इन विट्रो प्रतिलिखित (IVT) mRNA के सकारात्मक गुणों की. IVT mRNA की मदद के साथ, एक वांछित प्रोटीन के de नोवो संश्लेषण लक्ष्य कोशिका की शारीरिक स्थिति को बदलने के बिना प्रेरित किया जा सकता है । इसके अलावा, IVT mRNA के परिवर्तनीय प्रभाव के कारण प्रोटीन का संश्लेषण ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है ।

कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक के लिए, nanoliposomes (NLps) चिकित्सीय mRNA के लिए एक सुरक्षित और कुशल प्रसव वाहन का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । इस अध्ययन के एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए सुरक्षित और कुशल cationic उत्पंन NLps डीसी से मिलकर कोलेस्ट्रॉल और 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (डोप) IVT mRNA के लिए एक प्रसव के लिए सदिश के रूप में । NLps एक निर्धारित आकार, एक सजातीय वितरण, और एक उच्च रंग क्षमता है, और शुष्क फिल्म विधि का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकता है । इसके अलावा, हम विभिंन परीक्षण प्रणालियों वर्तमान के लिए उनके रंग और अभिकर्मक सिंथेटिक बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP) mRNA, साथ ही साथ सेल व्यवहार्यता पर अपने प्रभाव का उपयोग efficacies का विश्लेषण । कुल मिलाकर, प्रस्तुत प्रोटोकॉल mRNA परिसर के लिए एक प्रभावी और सुरक्षित दृष्टिकोण है, जो अग्रिम और चिकित्सीय mRNA के प्रशासन में सुधार कर सकते है प्रदान करता है ।

Introduction

चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए संशोधित mRNA के उपयोग के पिछले कुछ वर्षों में महान क्षमता दिखाया गया है । हृदय, भड़काऊ, और monogenetic रोगों, साथ ही टीके के विकास में, mRNA एक होनहार चिकित्सकीय एजेंट1है ।

mRNA के साथ प्रोटीन रिप्लेसमेंट थेरेपी शास्त्रीय जीन थेरेपी, जो लक्ष्य कोशिकाओं2में डीएनए अभिकर्मक पर आधारित है पर कई लाभ प्रदान करता है । mRNA फ़ंक्शन सीधे cytosol में प्रारंभ करता है । हालांकि प्लाज्मिड डीएनए (pDNA), एक प्रमोटर क्षेत्र और चिकित्सीय प्रोटीन3एंकोडिंग एक जीन अनुक्रम युक्त दोहरे-असहाय, परिपत्र डीएनए का निर्माण, यह भी cytosol में कार्य करता है, यह केवल कोशिकाओं में शामिल किया जा सकता है जो बँटवारा के माध्यम से जा रहे हैं के समय अभिकर्मक । यह ऊतक1,4में transfected कोशिकाओं की संख्या कम कर देता है । विशेष रूप से, हृदय कोशिकाओं के रूप में कमजोर बँटवारा गतिविधि के साथ ऊतकों की अभिकर्मक, मुश्किल है5. pDNA के विपरीत, ऊतक1,6में mitotic और गैर mitotic कोशिकाओं में mRNA के अभिकर्मक और अनुवाद होते हैं । डीएनए के वायरल एकीकरण मेजबान जीनोम में mutagenic प्रभाव या प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ आ सकता है7,8, लेकिन एक प्रोटीन के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक के बाद mRNA एन्कोडिंग, वांछित प्रोटीन के de नोवो संश्लेषण 9,10autonomously शुरू होता है । इसके अलावा, प्रोटीन संश्लेषण ठीक व्यक्तिगत खुराक के माध्यम से रोगी की जरूरत के लिए समायोजित किया जा सकता, जीनोम के साथ हस्तक्षेप के बिना और mutagenic प्रभाव11खतरे में डाल. सिंथेटिक जनित mRNA की प्रतिरक्षा सक्रिय क्षमता नाटकीय रूप से छद्म uridine और 5 '-methylcytidine के बजाय uridine और cytidine12का उपयोग करके कम किया जा सकता है । छद्म uridine संशोधित mRNA भी एक वृद्धि हुई जैविक स्थिरता और एक काफी उच्च अनुवाद क्षमता13दिखाया गया है ।

नैदानिक अनुप्रयोगों में mRNA आधारित चिकित्सा के होनहार गुणों से लाभ के लिए सक्षम होने के लिए, यह सेल में mRNA के परिवहन के लिए एक उपयुक्त वाहन बनाने के लिए आवश्यक है । इस वाहन को इन विट्रो में और vivoमें गैर विषैले गुण सहन करना चाहिए, nuclease-क्षरण के खिलाफ mRNA की रक्षा, और एक लंबे समय तक उपलब्धता और mRNA14के अनुवाद के लिए पर्याप्त सेलुलर प्रदान करते हैं ।

इस तरह के कार्बन नैनोट्यूब, क्वांटम डॉट्स, और liposomes के रूप में vivo दवा वितरण में के लिए सभी संभव वाहक प्रकार, के अलावा सबसे अधिक15,16का अध्ययन किया गया है । Liposomes एक लिपिड bilayer10से मिलकर बुलबुले हैं । वे एक hydrophobic और एक हाइड्रोफिलिक धारा के साथ amphiphilic हैं, और इन अणुओं की आत्म व्यवस्था के माध्यम से, एक गोलाकार डबल परत17बनाई गई है । liposomes के अंदर, चिकित्सीय एजेंटों या दवाओं और समझाया जा सकता है, इस प्रकार, एंजाइमी गिरावट18से संरक्षित । Liposomes युक्त n-[1-(2, 3-dioleyloxy) propyl]-n, n, n-trimethylammonium क्लोराइड (DOTMA)19, [1, 2-भा (oleoyloxy)-3-(trimethylammonio) प्रोपेन] (DOTAP)20, और dioctadecylamidoglycylspermine (कुत्ते)21, या डीसी-कोलेस्ट्रॉल22, अच्छी तरह से विशेषता और अक्सर डीएनए या आरएनए के साथ सेलुलर अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं ।

Cationic liposomes एक सकारात्मक आरोप लगाया लिपिड और एक unchargeed फॉस्फोलिपिड23शामिल हैं । अभिकर्मक via cationic liposomes24,25कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड के परिवहन के लिए सबसे आम तरीकों में से एक है । cationic लिपिड कणों न्यूक्लिक एसिड अणुओं की रीढ़26में नकारात्मक आरोप फॉस्फेट समूहों के साथ परिसरों के रूप में । ये तथाकथित lipoplexes कोशिका झिल्ली की सतह के लिए संलग्न है और endocytosis या endocytosis के माध्यम से सेल दर्ज करें-जैसे तंत्र27।

१९८९ में, मेलोन एट अल. सफलतापूर्वक वर्णित cationic लिपिड मध्यस्थता mRNA अभिकर्मक28. हालांकि, DOTMA और 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (डोप) के मिश्रण का उपयोग करते हुए, समूह ने पाया कि DOTMA अमानत साइटोटोक्सिक प्रभाव28. साथ ही, ज़ोहरा एट अल. दिखाया गया है कि DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-प्रोपेन क्लोराइड) एक mRNA अभिकर्मक29एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक के लिए, DOTAP अन्य रिएजेंट के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जैसे fibronectin29 या डोप30. अब तक DOTMA का जीन डिलिवरी31के लिए इस्तेमाल होने वाला बाजार पर पहला cationic लिपिड था । अन्य लिपिड चिकित्सीय वाहक के रूप में उपयोग किया जाता है या नैदानिक परीक्षणों के विभिन्न चरणों में परीक्षण किया जा रहा है, (जैसे, EndoTAG-I, एक लिपिड वाहक के रूप में DOTAP युक्त), वर्तमान में एक चरण द्वितीय नैदानिक परीक्षण३२में जांच की जा रही है.

यह काम डीसी युक्त NLps की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-कोलेस्ट्रॉल और डोप । इस विधि से प्रदर्शन करने के लिए आसान है और विभिंन आकारों की NLps की पीढ़ी की अनुमति देता है । एनएलपी पीढ़ी के सामांय लक्ष्य शुष्क फिल्म विधि का उपयोग करने के लिए mRNA रंग के लिए liposomes बना है, इस प्रकार की अनुमति कुशल और अभिकर्मक इन विट्रो मेंसंगत सेल14,३३।

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Protocol

1. Cationic Nanoliposomes की जनरेशन (चित्रा 1)

  1. लिपिड डीसी भंग-कोलेस्ट्रॉल (3β-[n-(n ′, N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] कोलेस्ट्रॉल हाइडरोक्लॉराइड) और डोप (dioleoyl phosphatidylethanolamine), एक पाउडर के रूप में दिया, क्लोरोफॉर्म में एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए 25 मिलीग्राम/एमएल ।
    नोट:-20 डिग्री सेल्सियस पर भंग लिपिड स्टोर.
  2. दोनों लिपिड के 25 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान के साथ काम करते हैं । एक गिलास कुप्पी में भंग डोप के ४० µ l को मिलाकर भंग डीसी-कोलेस्ट्रॉल और ८० µ एल का मिश्रण.
    नोट: कुल लिपिड राशि 3 मिलीग्राम है । क्लोरोफॉर्म के तेजी से वाष्पीकरण से बचने के लिए, pipetting के दौरान लिपिड को बर्फ पर लगाएं ।
  3. भाप बनकर को आर्गन गैस फ्लोर के नीचे 15 मिनट के लिए क्लोरोफॉर्म । बाद में, सिलिका जेल के साथ एक desiccator भरें, अंदर खुले शीशे कुप्पी जगह है, और एक वैक्यूम लागू करने के लिए सुनिश्चित करें कि शेष क्लोरोफॉर्म सुखाया है, और एक लिपिड फिल्म कांच कुप्पी के अंदर बना है ।
    नोट: तेजी से काम करते हैं और अनावश्यक ओ2 संपर्क से बचें.
  4. nuclease के 1 मिलीलीटर-नि: शुल्क पानी और भंवर 15 मिनट (चित्रा 2a) के लिए निलंबन के साथ गठित लिपिड फिल्म rehydrat । इसके बाद, 1 घंटे (चित्रा 2 बी) के लिए एक sonication स्नान में निलंबन जगह है ।
    नोट: निलंबन थोड़ा बादल होगा ।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार मिनी बाहर निकालना मशीन को इकट्ठा, लिपिड निलंबन के साथ एक सिरिंज को भरने, और भरा सिरिंज और बाहर निकालना के दोनों किनारों पर एक खाली सिरिंज जगह. एक सिरिंज से झिल्ली के माध्यम से लिपिड निलंबन प्रेस करने के लिए अन्य, 20x – 25x, निलंबन बाहर निकालना करने के लिए (चित्रा 2c).
    नोट: NLps के आकार का इस्तेमाल किया झिल्ली के ताकना आकार द्वारा निर्धारित होता है ।
  6. आगे उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक गिलास कुप्पी में NLps की दुकान ।
    नोट: लंबे समय तक भंडारण समय के बाद, NLps sonication स्नान में फिर से 15 मिनट के लिए ३५ kHz जटिल गठन को दरकिनार करने के लिए रखा जाना चाहिए ।

2. इन विट्रो प्रतिलिपि सिंथेटिक mRNA की

  1. ३४पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के बाद eGFP-एंकोडिंग mRNA तैयार करें ।
  2. ०.७ के साथ प्लाज्मिड से eGFP अनुक्रम बढ़ाना (5 '-TTG GAC CCT CGT ऐका गाा GCT AAT ACG-3 ') और रिवर्स (5 '-टी१२० CTT CTT एक्ट सीएजी GCT TTA टीटीसी एएए GAC सीए-3 ') प्राइमरी और पीसीआर के साथ पोलीमरेज़ किट ।
    1. एक वाणिज्यिक बफर समाधान के 20 µ एल मिश्रण है जो डीएनए के पिघलने व्यवहार (सामग्री की मेज), साथ ही पोलीमरेज़ किट से 5x मिश्रण के 20 µ एल बदल जाता है । प्रत्येक के 7 µ एल जोड़ें (आगे और रिवर्स) प्राइमर ।
    2. मिश्रण करने के लिए eGFP प्लाज्मिड के 25 एनजी जोड़ें और पोलीमरेज़ किट से पोलीमरेज़ के 2 µ एल ।
      नोट: इसे हल करने के लिए pipetting से पहले बर्फ पर पोलीमरेज़ रखें ।
    3. जोड़ें nuclease-नि: शुल्क एच2ओ मिश्रण करने के लिए, अप करने के लिए एक मात्रा १०० µ l
    4. 1 तालिकामें प्रोटोकॉल के बाद thermocycler में पीसीआर साइकिल चलाते हैं ।
  3. पीसीआर शुद्धिकरण किट के साथ eGFP-एंकोडिंग डीएनए सीक्वेंस को शुद्ध कर ।
    1. इसलिए, किट से बाध्यकारी बफर के ५०० µ एल के साथ पीसीआर समाधान मिश्रण और शुद्धि कॉलम भरने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं ।
    2. 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर कॉलम केंद्रापसारक और छानने का त्याग ।
    3. जोड़ें ७५० µ धोने के एल मैं कॉलम के लिए बफर, 1 मिनट के लिए अधिकतम गति से फिर से केंद्रापसारक, और छानने का त्याग ।
    4. स्तंभ फ़िल्टर से बफ़र को निकालने के लिए केंद्रापसारक चरण 1x दोहराएँ ।
    5. स्तंभ को एक ताजा १.५-एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें ।
    6. जोड़ें 20 µ एल के nuclease-नि: शुल्क एच2ओ कॉलम, 1 मिनट के लिए मशीन, और अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक । इस चरण को दोहराएं ।
    7. एक फोटोमीटर के साथ डीएनए की एकाग्रता को मापने और-20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।
    8. जेल ट्रो का उपयोग डीएनए गुणवत्ता विश्लेषण करते हैं । Tris में agarose के ०.५ ग्राम जोड़ें-बोराटे-EDTA (TBE) बफर और यह गर्मी में उच्च गर्मी पर माइक्रोवेव में जब तक agarose पूरी तरह से भंग है ।
    9. जेल के 5 µ एल जोड़ें-तरल agarose के लिए समाधान धुंधला, जेल चैंबर में समाधान भरें, और जेल बहुलक है जब तक प्रतीक्षा करें ।
    10. मिश्रण २०० डीएनए के 2 µ एल के साथ एनजी 6x लोड हो रहा है और इसे भरने के लिए 12 µ l. पिपेट एक डीएनए सीढ़ी के अंत मात्रा, साथ ही साथ डीएनए नमूना, जेल कुओं में और 1 ज के लिए ट्रो चलाने में १०० वी ।
    11. यूवी प्रकाश के तहत जेल का विश्लेषण स्टेशन का उपयोग कर जेल का विश्लेषण ।
  4. भागो में इन विट्रो प्रतिलेखन में एक के साथ डीएनए अनुक्रम से mRNA उत्पंन करने के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन किट युक्त T7-पोलीमरेज़ और UTP और ctp के साथ Ψ-UTP और मिथाइल-ctp के संशोधित न्यूक्लियोटाइड स्थानापंन ।
    1. इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए, 2 तालिकाके बाद सामग्री मिश्रण ।
      नोट: १.५ µ l की जगह 1:10 Cy3-ctp के साथ मिथाइल-ctp nuclease में पतला-मुक्त एच2ओ के दौरान इन विट्रो प्रतिलिपि eGFP mRNA के Cy3-लेबलिंग mRNA प्राप्त करने के लिए ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए IVT प्रतिक्रिया मिश्रण मशीन ।
    3. जोड़ें 1 µ एल के DNase मैं T7 पोलीमरेज़ किट से और यह 15 मिनट के लिए ३७ ° c द्वारा मशीन डीएनए टेम्पलेट को पचाने के लिए.
  5. mRNA को शुद्ध करने के लिए आरएनए क्लीन-अप किट का उपयोग करें ।
    1. nuclease-फ्री एच2ओ के साथ १०० µ l की मात्रा को IVT मिश्रण को भरें ।
    2. lysis बफर के ३५० µ एल जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण ।
    3. जोड़ें १००% इथेनॉल के २५० µ एल और फिर से मिश्रण । पिपेट क्लीनअप स्तंभों में मिश्रण है ।
    4. ८,००० x g पर 15 एस के लिए केंद्रापसारक और छानने का त्याग ।
    5. एक कॉलम में धुलाई बफर के ५०० µ एल जोड़ें, ८,००० एक्स जीमें 15 एस के लिए फिर से केंद्रापसारक, और छानने का समय निकालें ।
    6. धो बफर के ५०० µ एल के साथ कॉलम 1x धोने और ८,००० एक्स जीमें 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक
    7. स्तंभ को ताजा १.५-mL रिएक्शन ट्यूब में ले जाएं । Elute एक 1-nuclease के 20 µ एल के मिन मशीन द्वारा mRNA 2x-नि: शुल्क एच2कॉलम झिल्ली पर ओ, अधिकतम गति पर एक 1-ंयूनतम केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया ।
  6. एक dephosphorylation किट का उपयोग कर mRNA से फॉस्फेट समूहों निकालें । 10x फॉस्फेट बफर और फॉस्फेट के 1 µ एल के ४.५ µ एल जोड़ें mRNA और 1 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  7. mRNA को फिर से शुद्ध करें, निम्न चरणों 2.5.1-2.5.7.
  8. एक फोटोमीटर के साथ mRNA कंसर्ट को मापने ।
  9. उपयोग जेल ट्रो शुद्धता और mRNA के आकार का विश्लेषण करने के लिए । इसलिए, चरण 2.3.9-2.3.10 में वर्णित के रूप में एक agarose जेल तैयार करें ।
    1. formamide के ३.३ µ एल मिक्स, 1 µ एल के ३७% formaldehyde, 1 µ एल के 10x पुरुषों, और µ के एनजी के साथ 6x लोडिंग डाई के १.७ mRNA एल और इसे भरने के लिए µ के साथ 10 nuclease एल के लिए प्रत्येक नमूना और आरएनए मार्कर के लिए नि: शुल्क एच2ओ.
    2. mRNA विकार के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मिश्रण की मशीन । mRNA और आरएनए मार्कर के साथ जेल के कुओं लोड और १०० वी में 1 ज के लिए जेल चलाते हैं ।
    3. यूवी प्रकाश के साथ एक जेल डॉक्टर स्टेशन का उपयोग कर जेल का विश्लेषण ।

3. सिंथेटिक mRNA का रंग

  1. पिघल बर्फ पर सिंथेटिक mRNA, यह भंवर, और शीघ्र ही ट्यूब खोलने से पहले केंद्रापसारक ।
  2. मिश्रण 10 सिंथेटिक mRNA के µ एल (mRNA एकाग्रता है १०० एनजी/µ एल) 1 µ एल, २.५ µ एल, 5 µ एल, 10 µ एल, या एनएलपी निलंबन के 20 µ एल के साथ (एनएलपी एकाग्रता है 3 मिलीग्राम/एमएल) । nanolipoplex गठन के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में 20 मिनट के लिए संक्षेप में और मशीन ।
    नोट: pipetting द्वारा मिश्रण नहीं है । इससे वॉल्यूम की हानि हो सकती है । भंवर शीघ्र ही एक पूरी तरह से मिश्रण के लिए ।
  3. nanolipoplexes के लिए नियमित रूप से सेल मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें और उंहें ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण ।

4. Nanoliposomes के encapsulation दक्षता का विश्लेषण

  1. encapsulation प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए, आरएनए ठहराव किट का उपयोग करें.
  2. एक उच्च सीमा के लिए फ्लोरोसेंट डाई 1:200 कमजोर द्वारा काम समाधान तैयार करें और 1:2000 एक कम रेंज परख के लिए ।
    नोट: बर्फ पर फ्लोरोसेंट डाई गल. सीधे उपयोग करने से पहले कार्य समाधान तैयार करें ।
  3. एक 2 µ जी/एमएल के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर उच्च रेंज और कम दूरी के मानक curves तैयार eGFP mRNA के nuclease-free H2ओ में के स्टॉक समाधान ।
    नोट: मानक curves के लिए, encapsulation प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा कि mRNA का उपयोग करें.
  4. उच्च-श्रेणी मानक (20 एनजी/एमएल-1 µ g/एमएल) की तैयारी के लिए तालिका 3 का उपयोग करें ।
  5. कम दूरी के मानक के लिए, 2 µ g/ml eGFP mRNA स्टॉक समाधान 1:20 के लिए १०० एनजी/एमएल के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पतला । तालिका 4में वर्णित के रूप में एक कम दूरी मानक (1 एनजी/एमएल-५० एनजी/एमएल) तैयार करें ।
  6. eGFP mRNA के 1 µ जी (10 µ एल) और µ के ७.५ NLps जी (२.५ µ एल) और आरटी पर 20 मिनट के लिए मशीन का मिश्रण ।
    नोट: क्षरण से बचने के लिए बर्फ पर mRNA रखें ।
  7. nanolipoplexes बनाने के लिए nuclease-फ्री एच2ओ के 1 मिलीलीटर जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण ।
  8. 1:200 या 1 के 1 मिलीलीटर: 2000 आरएनए फ्लोरोसेंट डाई समझाया नमूनों और मानकों और आरटी में अंधेरे में 5 मिनट के लिए मशीन के लिए काम कर हल जोड़ें ।
  9. पिपेट एक काले ९६-अच्छी तरह से प्लेट में डुप्लिकेट में मानकों और नमूनों को एक microplate रीडर (चित्रा 3) पर ५३० एनएम पर प्रतिदीप्ति को मापने ।

5. अभिकर्मक के लिए कक्षों की तैयारी

  1. प्लेट १.५ x 105 A549 कोशिकाओं/अभिकर्मक करने के लिए पहले एक 12-खैर प्लेट 1 डी की ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5%2 में नियमित रूप से सेल मध्यम (DMEM/उच्च ग्लूकोज के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS], 2 मिमी एल-glutamine, अभिकर्मक से पहले 24 ज के लिए 1% पेनिसिलिन/streptomycin) में कोशिकाओं की मशीन ।

6. कोशिकाओं का अभिकर्मक

  1. 1 मिलीलीटर/खैर पंजाबियों के साथ तैयार की कोशिकाओं को धो लें (बिना सीए2 +/मिलीग्राम2 +) ।
  2. तैयार nanolipoplex मिश्रण की 1 मिलीलीटर जोड़ें, eGFP mRNA के 1 µ g युक्त 1-µ एल, २.५-µ एल, 5-µ एल, 10-µ एल, या 20-µ एल NLps, A549 कोशिकाओं के साथ तैयार थाली के एक अच्छी तरह से ।
  3. कोशिकाओं के लिए nanolipoplex निलंबन जोड़ें और अभिकर्मक प्रभावकारिता का विश्लेषण करने के लिए 24 ज के लिए नियमित रूप से शर्तों पर गर्मी, या अभिकर्मक के बाद सेल व्यवहार्यता का विश्लेषण करने के लिए 24 एच और ७२ एच के लिए ।
    नोट: NLps के साथ अभिकर्मक एक मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है ।

7. सेल अभिकर्मक प्रभावकारिता का विश्लेषण प्रवाह Cytometry और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

  1. बचे हुए NLps को निकालने के लिए supernatant को निकालें और 1 मिलीलीटर/अच्छी तरह से पंजाबियों (बिना सीए2 +/Mg2 +) के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
  2. प्रवाह cytometry के लिए कक्षों को तैयार करें ।
    1. Trypsinize के साथ कोशिकाओं को ५०० µ l/well trypsin/EDTA (०.०५%) 3 मिनट के लिए ३७ ° c. प्रक्रिया को रोकें और trypsin को नियमित µ-युक्त माध्यम से समान मात्रा (५०० FBS l/
    2. ४०० x जी में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक और ध्यान से सेल गोली छूने के बिना supernatant को दूर ।
    3. पंजाब के 1 मिलीलीटर (बिना सीए2 +/मिलीग्राम2 +) के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
    4. 1x निर्धारण समाधान के ३०० µ एल में कोशिकाओं resuspend और प्रवाह cytometry ट्यूबों में कोशिकाओं को हस्तांतरण ।
    5. एक प्रवाह cytometer में ४८८ एनएम पर कोशिकाओं का विश्लेषण (आंकड़ा 4a) ।
      ध्यान दें: भंवर कोशिकाओं को मापने से पहले सीधे 1x ।
  3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए कोशिकाओं को तैयार करें ।
    1. 1 मिलीलीटर/well १००% मेथनॉल, जो पहले-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था के साथ कोशिकाओं को ठीक ।
    2. जोड़ें ५०० µ l/well ३०० एनएम DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) पंजाब में भंग (बिना सीए2 +/Mg2 +) और अंधेरे में 5 मिनट के लिए मशीन ।
    3. DAPI समाधान निकालें और कोशिकाओं को फिर से धो १००% मेथनॉल के साथ-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
    4. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (चित्रा 4B) का उपयोग कर कोशिकाओं का विश्लेषण.
      नोट: निम्नलिखित उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें: eGFP 488/509 एनएम, DAPI 358/461 एनएम, और Cy3 550/570 एनएम ।

8. सेल व्यवहार्यता परख

  1. भंग 5 मिलीग्राम की MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड) में 1 मिलीलीटर RPMI (बिना phenol लाल).
    नोट: भंग MTT आगे पतला होना चाहिए 1:10 (अंतिम एकाग्रता: ०.५ मिलीग्राम/एमएल) RPMI में उपयोग करने से पहले ।
  2. 1 मिलीलीटर/अच्छी तरह से पंजाबियों के साथ 3x transfected कोशिकाओं धो (बिना सीए2 +/Mg2) ।
    नोट: नियमित सेल मीडियम के अवशेष को पूरी तरह से हटा देना चाहिए ।
  3. जोड़ें ५०० µ l/1:10 के पतला MTT समाधान कोशिकाओं को और 4 के लिए मशीन ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
  4. गर्मी के बाद कोशिकाओं से MTT समाधान निकालें और जोड़ें ५०० µ l/well DMSO (dimethyl sulfoxide) । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए फिर से मशीन ।
  5. पिपेट में तीन प्रबंधन में DMSO समाधान एक स्पष्ट-नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली और ५४० एनएम पर सोखना उपाय एक microplate पाठक का उपयोग कर ।
  6. १००% पर अनुपचारित सेल की व्यवहार्यता सेट और अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में अन्य समूहों की कोशिका व्यवहार्यता की गणना (चित्रा 5).

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Representative Results

वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल का प्रयोग, लिपिड डीसी से मिलकर कोलेस्ट्रॉल और डोप शुष्क फिल्म विधि (चित्रा 1) का उपयोग कर तैयार किया गया NLps । तैयारी के दौरान, nanoliposome समाधान turbidity (चित्रा 2) में विभिन्न चरणों का पता चलता है.

NLps की encapsulation प्रभावकारिता तो mRNA की मुक्त राशि का विश्लेषण करके eGFP एंकोडिंग mRNA के 1 µ जी के encapsulation के बाद विश्लेषण किया जा सकता है, जो encapsulated नहीं था, आरएनए ठहराव किट (चित्रा 3) का उपयोग कर ।

NLps के विभिन्न मात्रा में eGFP mRNA के encapsulation के बाद, गठित nanolipoplexes इन विट्रो में कोशिकाओं और eGFP-व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिशत के साथ किया जा सकता है प्रवाह cytometry का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता 24 ज posttransfection (चित्रा 4a) . nanoliposome सॉल्यूशन के सम 1 µ l को इन विट्रो मेंकोशिकाओं के उच् अभिकर्मक को प्राप् त करने के लिए पर्याप् त है । जब कोशिकाएं NLps युक्त Cy3-बला eGFP mRNA के साथ transfected हैं तो eGFP (red mRNA) में कोशिका द्रव्य प्रतिदीप्ति की उपस्थिति, साथ ही पहले से उत्पादित eGFP प्रोटीन (green प्रतिदीप्ति) की कल्पना (figure 4B) की जासकती है ।

nanolipoplexes का उपयोग कर कोशिकाओं के अभिकर्मक कोशिकाओं पर प्रतिकूल प्रभाव हो सकता है के बाद से, कोशिकाओं की व्यवहार्यता 24 ज (चित्रा 5 ए) और ७२ एच (चित्रा 5B) posttransfection परीक्षण किया गया था । कोशिका व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव का पता लगाया जा सकता है जब कोशिकाओं २.५ या 5 NLps या nanolipoplexes के µ एल, क्रमशः के साथ इलाज किया गया ।

Figure 1
चित्रा 1: cationic nanoliposomes के निर्माण की प्रक्रिया का योजनाबद्ध सिंहावलोकन । सबसे पहले, भंग लिपिड डीसी-कोलेस्ट्रॉल और डोप एक गिलास कुप्पी में एक साथ मिलाया जाना चाहिए । दूसरा, दिखाई क्लोरोफॉर्म तरल आर्गन या नाइट्रोजन गैस के प्रवाह के तहत सुखाया जाना चाहिए और क्लोरोफॉर्म बचे वैक्यूम में रातोंरात लुप्त होने की अनुमति दी जानी चाहिए । तीसरा, काँच की कुप्पी के तल पर गठित लिपिड फिल्म को nuclease-फ्री एच२ओ के साथ फिर से हाइड्रेटेड किया जाना चाहिए, जिसके बाद multilamellar liposomes रूप को भंवरित कर दिया. sonication और liposome समाधान के बाहर निकालना के माध्यम से, के लिए तैयार करने के लिए उपयोग unilamellar NLps का उत्पादन कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: निर्माण के दौरान विभिन्न चरणों में nanoliposome समाधान. (क) यह आंकड़ा सीधे लिपिड फिल्म के निर्जलीकरण के बाद liposome समाधान से पता चलता है और 15 मिनट के लिए भंवर, के रूप में अच्छी तरह के रूप में (ख) एक sonication स्नान में 1 घंटे के बाद (ग) बाहर निकालना के 25 चक्र के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: nanoliposomes की encapsulation प्रभावकारिता । यह पैनल NLps में encapsulation के बाद मुक् eGFP mRNA की ठहराव को दिखाता है । परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे है ± SEM (n = 3) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: nanolipoplexes की अभिकर्मक प्रभावकारिता । (क) इस पैनल के निर्धारण से पता चलता है अभिकर्मक के लिए सर्वश्रेष्ठ mRNA/nanoliposome अनुपात का उपयोग करने के लिए NLps की विभिन्न मात्राओं का प्रयोग 1 µ g को eGFP mRNA 24 ज posttransfection. (ख) इस पैनल Cy3-लेबल सिंथेटिक mRNA encapsulated में २.५ µ एल NLps और कोशिकाओं में eGFP अभिव्यक्ति 24 ज posttransfection (स्केल बार = ५० µm) का पता लगाने से पता चलता है । परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे है ± SEM (n = 3) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: nanoliposomes और encapsulated mRNA के साथ अभिकर्मक के बाद सेल व्यवहार्यता । इस पैनल के एक MTT परख (A) 24 एच और (ख) ७२ एच posttransfection का उपयोग कर सेल व्यवहार्यता के माप से पता चलता है । परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे है ± SEM (n = 3) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चरण ° c में तापमान अवधि
1 ९५ 5 min
2 ९४ 15 एस
3 ५५ 1 min
4 ७२ 1 min
5 २ ३० x पर जाएं
6 ७२ 10 min
7 4 पकड़

तालिका 1: डीएनए प्रवर्धन के लिए पीसीआर चक्र प्रोटोकॉल ।

एकाग्रता राशि
एटीपी 7, 5 एमएम 4 µ l
Gtp १,८७५ एमएम 1 µ l
5 '-Methylcytidin 7, 5 एमएम 3 µ l
Ψ 7, 5 एमएम 3 µ l
Arca 2, 5 मिमी 10 µ l
डीएनए टेम्पलेट १.५ µ छ
बफर मिक्स 1x 4 µ l
T7 एंजाइम मिक्स 4 µ l
RNase-अवरोध करनेवाला 1 µ l
Nuclease-मुफ्त पानी ४० तक भरें µ l

तालिका 2: मिश्रण के लिए के इन विट्रो में mRNA के लिए डीएनए की प्रतिलिपि ।

nuclease की मात्रा-मुक्त एच2ओ (µ एल) eGFP mRNA उच्च रेंज स्टॉक समाधान की मात्रा (µ एल) 1:200 फ्लोरोसेंट डाई की मात्रा (µ एल) अंतिम एकाग्रता (एनजी/
0 १०० १०० १०००
५० ५० १०० ५००
९० 10 १०० १००
९८ 2 १०० 20
१०० 0 १०० रिक्त

तालिका 3: एक उच्च श्रेणी मानक वक्र के लिए प्रोटोकॉल ।

nuclease की मात्रा-मुक्त एच2ओ (µ एल) eGFP mRNA कम दूरी स्टॉक समाधान की मात्रा (µ एल) 1:2000 फ्लोरोसेंट डाई की मात्रा (µ एल) अंतिम एकाग्रता (एनजी/
0 १०० १०० ५०
५० ५० १०० 25
९० 10 १०० 5
९८ 2 १०० 1
१०० 0 १०० रिक्त

तालिका 4: एक कम दूरी के मानक वक्र के लिए प्रोटोकॉल ।

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल सिंथेटिक संशोधित mRNA के लिए उच्च encapsulation प्रभावकारिता के साथ NLps की पीढ़ी का वर्णन, साथ ही साथ इन विट्रो मेंकोशिकाओं के विश्वसनीय अभिकर्मक. इसके अलावा, NLps mRNA, जो बारी में, कोशिकाओं के अंदर एक कार्यात्मक प्रोटीन में अनुवाद किया है की रिहाई की गारंटी । इसके अतिरिक्त, NLps का उपयोग कर transfections नियमित सेल मध्यम में किया जा सकता है, अभिकर्मक के दौरान उच्च कोशिका viabilities में जिसके परिणामस्वरूप, और पिछले तीन दिनों तक अभिकर्मक के बाद ।

अपने प्रसव के लिए एक चिकित्सकीय, स्वयं कोडांतरण प्रणाली के रूप में mRNA का उपयोग करने के लिए पसंद है । सबसे आम अभिकर्मक रिएजेंट में cationic लिपिड्स शामिल हैं, जिनमें liposomes है । के रूप में liposomes सकारात्मक आरोप लगाया, नकारात्मक न्यूक्लिक एसिड का आरोप लगाया जा सकता है उन में है, जिससे कोशिका झिल्ली के इलेक्ट्रोस्टैटिक repuls को३५से उबरने की अनुमति । cationic लिपिड डीसी कोलेस्ट्रॉल पहले से ही एक स्थिर और संगत वाहन३६के रूप में पहले के अध्ययनों में वर्णित किया गया है । तटस्थ लिपिड डोप के अलावा एक बढ़ाया अभिकर्मक प्रभावकारिता३७की ओर जाता है । उपर्युक्त लाभ को ध्यान में रखते हुए, इन लिपिड NLps की तैयारी के लिए चुना गया । इसके अलावा, पिछले अध्ययनों का प्रदर्शन किया है कि इन दो लिपिड के उपयोग नकारात्मक न्यूक्लिक एसिड३८के साथ एक वृद्धि की सेलुलर अभिकर्मक दर के कारण दूसरों पर बेहतर है ।

NLps और nanolipoplexes की सफल पीढ़ी के लिए, यह कुछ कदम पर अतिरिक्त ध्यान देने के लिए महत्वपूर्ण है । nanoliposome पीढ़ी की प्रक्रिया ओ2मुक्त शर्तों के तहत किया जाना चाहिए । एनएलपी पीढ़ी के दौरान2 ओ की उपस्थिति फॉस्फोलिपिड और कम reproducibility३९के क्षरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, संशोधनों के बावजूद, mRNA nucleases के माध्यम से क्षरण के संबंध में बहुत संवेदनशील है । इसलिए, लिपिड फिल्म के निर्जलीकरण के लिए, RNase के उपयोग-नि: शुल्क एच2ओ दृढ़ता से परिसर के दौरान mRNA गिरावट को रोकने की सिफारिश की है । साथ ही, nanolipoplexes के भण्डारण के लिए RNase-मुक्त स्थितियां सुनिश्चित की जानी चाहिए ।

इसके अलावा, NLps क्योंकि अस्थिर ऊष्मा प्रणाली के समय के साथ समुच्चय फार्म कर सकते हैं । प्रभाव मानकों भंडारण तापमान और liposomes४०की सतह प्रभारी शामिल हैं । एनएलपी एकत्रीकरण liposome झिल्ली के स्थिरीकरण में परिणाम और अवांछनीय mRNA रिलीज४१के जोखिम, गरीब अभिकर्मक प्रभावकारिता और extracellular अंतरिक्ष में mRNA गिरावट के लिए अग्रणी हो सकता है । हालांकि, पहले दिखाए गए के रूप में, nanolipoplexes 4 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र या अभिकर्मक प्रभावकारिता३५की हानि के बिना छह महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।

दवा वाहक प्रणाली के रूप में liposomes का उपयोग करके, दवा वितरण की प्रमुख समस्याओं में से दो हल किया जा सकता है । Liposomes क्षरण से समझाया दवा की रक्षा और निष्क्रिय ऊतकों है कि एक सतत endothelium है, जैसे जिगर या अस्थि मज्जा16के रूप में करने में सक्षम हैं । चिकित्सीय न्यूक्लिक एसिड के वितरण के लिए, जैसे कण आकार और encapsulation क्षमता के रूप में मानकों के मूल्यांकन और सेलुलर liposomal वाहनों के ऊपर उठाने के लिए महत्वपूर्ण हैं । विशेष रूप से, नैनोमीटर पैमाने में liposomes के आकार के सेल झिल्ली४२ के साथ एक बातचीत की अनुमति देता है और है, जिससे, vivo में बाद में उपयोग के लिए महत्वपूर्ण है । सबसे पहले, liposomes गुर्दे और यकृत प्रणाली४३के माध्यम से मंजूरी से बचने के लिए काफी छोटा होना चाहिए । दूसरा, liposome आकार के लिए रक्त वाहिकाओं ' बाधा पर काबू पाने के लिए वांछित अंग की कोशिकाओं को लक्षित करने में मदद करनी चाहिए । यह बताया गया कि १००-३०० एनएम के आकार रेंज में liposomes कुशलता से transfect हेपैटोसाइट्स४४कर रहे थे; हालांकि, बड़े आकार liposomes (जैसे, ४०० एनएम) के लिए endothelial बाधा४५पर काबू पाने में सक्षम नहीं थे ।

यद्यपि mRNA प्रसव के लिए वर्णित विधि की स्थापना की गई है, फिर भी इसे अन्य न्यूक्लिक अम्ल चिकित्सीय जैसे microRNA के लिए कार्यान्वित किया जा सकता है. हाल के एक अध्ययन में, हम प्रदर्शन किया है कि microRNA १२६ चुन कर निशाना बनाया जा सकता है, इसलिए, उदर महाधमनी aneurysms के विकास को प्रभावी ढंग से४६रोका जा सकता है । के रूप में डीएनए/आरएनए चिकित्सीय साइड इफेक्ट हो सकता है, जैसे प्लेटलेट सक्रियण, जब वे कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क में आते हैं, liposomes भीतर पैकेजिंग से बचने कर सकते हैं, इस प्रकार यह आगे४७लाभप्रद प्रतिपादन । इसलिए, यहाँ प्रस्तुत विधि अत्यधिक बहुमुखी है और कई रोगों के लिए दवा वितरण की डिजाइनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । स्थापित प्रोटोकॉल न केवल एक परिभाषित आकार के साथ एक कुशल mRNA वाहक की तेजी से और लागत प्रभावी पीढ़ी की अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक विशेष आवेदन की जरूरतों के अनुसार लिपिड निर्माण को अनुकूलित करने की संभावना प्रदान करता है: (1) के आकार liposomes आसानी से फिल्टर बदलने के द्वारा बदला जा सकता है; (2) सकारात्मक आरोप लगाया liposomes की सतह का उपयोग करके संशोधित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, पॉलीथीन ग्लाइकोल, में स्थिरता को बढ़ाने और रक्त निकासी में देरी के दौरान vivo आवेदन४८. liposomes को विशिष्ट एंटीबॉडी के बंधन encapsulated दवा४९के लक्षित वितरण की अनुमति देता है । आगे की परीक्षा और भौतिक संपत्तियों में एक अधिक विस्तृत अंतर्दृष्टि के साथ, प्रोटोकॉल अभी भी पर सुधार किया जा सकता है ।

liposomes की पीढ़ी के लिए, तीन आम तरीके उपलब्ध हैं: सूखी फिल्म, इथेनॉल इंजेक्शन, और रिवर्स चरण वाष्पीकरण । में यांग एट अल. अध्ययन, इन तीन विनिर्माण तकनीकों की तुलना में३५थे । यह पाया गया कि एक निर्धारित आकार और समाधान में एक समान वितरण के साथ liposomes शुष्क फिल्म विधि का उपयोग कर उत्पंन किया जा सकता है । इसके अलावा, इस अध्ययन में आयोजित शुष्क फिल्म प्रक्रिया २०० एनएम, एक सजातीय वितरण, और एक उच्च encapsulation क्षमता का एक परिभाषित आकार के साथ NLps के उत्पादन के परिणामस्वरूप ।

एक तरफ, liposomes के सकारात्मक प्रभारी एक वृद्धि encapsulation क्षमता और बेहतर सेल सतह संलयन५०,५१,५२की ओर जाता है, लेकिन दूसरी ओर, यह कोशिका झिल्ली अस्थिर और सक्रिय कर सकते है विभिंन प्रतिरक्षा सक्रियकरण रास्ते और सेल मौत27,५३। हालांकि, cationic लिपिड के अपोप्तोटिक गुण सहायक लिपिड डोप५४,५५का उपयोग करके कम से छोटा किया जा सकता है । झांग एट अलद्वारा अध्ययन में, यह पाया गया कि डीसी के 1:2 अनुपात-कोलेस्ट्रॉल और डोप liposome पीढ़ी के दौरान सबसे कुशल सेलुलर अभिकर्मक न्यूक्लिक एसिड३८का उपयोग करने के लिए सुराग । वर्तमान अध्ययन में कार्यान्वित विधि में, 1:2 डीसी के लिपिड अनुपात-कोलेस्ट्रॉल और डोप मिश्रित लिपिड निलंबन में लिपिड फिल्म तैयारी के दौरान इस्तेमाल किया गया था, और तैयार liposomes उच्च अभिकर्मक प्रभावकारिता के लिए नेतृत्व और, एक साथ, उच्च कोशिका व्यवहार्यता. इसी तरह के परिणाम अन्य शोधकर्ताओं द्वारा भी पाए गए, जैसे Ciani५६ और Farhood३७.

कुल मिलाकर, liposomes नैदानिक परीक्षणों में साल के लिए इस्तेमाल किया गया है, vivo मेंमहान है और अधिक अनुकूलता और कम विषाक्तता दिखा । mRNA के साथ संयोजन में, NLps कोशिकाओं को mRNA के कुशल प्रसव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या इन विट्रो में अंगों और vivo में, एक वांछित प्रोटीन के डी नोवो संश्लेषण प्रेरित करने के लिए. चिकित्सीय अनुप्रयोगों के संबंध में, nanolipoplexes इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, ट्रांसडर्मल mRNA प्रसव५७ के लिए घाव हीलिंग पैच में सेल पुनर्जनन को सक्रिय करने के लिए, या फेफड़ों के इलाज के लिए mRNA५८ के nebulization के लिए एक स्प्रे के रूप में ५९रोगों,इस तरह के सिस्टिक फाइब्रोसिस के रूप में६० ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल शुष्क फिल्म विधि का उपयोग कर NLps की पीढ़ी के लिए एक आसान और सुलभ तरीका है, जो तब इन विट्रो में के कुशल encapsulation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता mRNA और कोशिकाओं के सुरक्षित अभिकर्मक की गारंटी देता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कोई

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766

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इंजीनियरिंग १४४ अंक mRNA nanoliposomes डोप डीसी कोलेस्ट्रॉल encapsulation अभिकर्मक प्रसव चिकित्सकीय
के कुशल वितरण के लिए Cationic Nanoliposomes की जनरेशन <em>इन विट्रो</em> प्रतिलिखित दूत आरएनए
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Michel, T., Link, A., Abraham, M. K., Schlensak, C., Peter, K., Wendel, H. P., Wang, X., Krajewski, S. Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA. J. Vis. Exp. (144), e58444, doi:10.3791/58444 (2019).

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