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Bioengineering

Génération de Nanoliposomes cationiques pour la prestation efficace de In Vitro transcrit l’ARN messager

Published: February 1, 2019 doi: 10.3791/58444
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 2,3, 1, 2,3, 1
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory, University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology, Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine, Monash University

Summary

Ici nous décrivons un protocole pour la génération de nanoliposomes cationiques, qui repose sur la méthode sèche-film et peut être utilisé pour la sécurité et la prestation efficace de in vitro transcrit l’ARN messager.

Abstract

Le développement de l’ARN messager (ARNm)-fonction thérapeutique pour le traitement de diverses maladies devient plus important à cause de la positive propriétés de in vitro transcrit mRNA (IVT). Avec l’aide de l’ARNm de l’IVT, la synthèse de novo d’une protéine désirée peut être induite sans changer l’état physiologique de la cellule cible. En outre, biosynthèse des protéines peut être contrôlée avec précision en raison de l’effet transitoire du mRNA IVT.

Pour la transfection efficace des cellules, nanoliposomes (PNV) peut représenter un véhicule de livraison sûre et efficace pour l’ARNm thérapeutique. Cette étude décrit un protocole pour générer sûre et efficace cationique PNV composée de DC-cholestérol et 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) comme un vecteur de livraison d’ARNm IVT. PNV ayant une taille, une répartition homogène et une capacité élevée de complexation et peut être produites à l’aide de la méthode sèche-film. Par ailleurs, nous présentons des systèmes de test différent afin d’analyser leur complexation et efficacité de transfection utilisant synthétique renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) mRNA, ainsi que leur effet sur la viabilité des cellules. Globalement, le protocole présenté fournit une approche efficace et sans danger pour la complexation d’ARNm, qui peut faire avancer et améliorer l’administration de l’ARNm thérapeutique.

Introduction

L’utilisation du mRNA modifiés pour des applications thérapeutiques a montré beaucoup de potentiel dans les deux dernières années. Maladies cardiovasculaires, inflammatoires et monogénique, ainsi que dans le développement de vaccins, l’ARNm est agent thérapeutique prometteur1.

Thérapie de remplacement de protéines avec l’ARNm offre plusieurs avantages sur la thérapie génique classique, qui repose sur la transfection d’ADN dans les cellules de cible2. La fonction ARNm lance directement dans le cytosol. Bien que le plasmide ADN (pDNA), une construction de double-brin, circulaire ADN contenant une région promotrice et une séquence de gène codant pour la protéine thérapeutique3, également des actes dans le cytosol, il peut seulement être incorporé dans les cellules qui traversent la mitose au moment de la transfection. Cela réduit le nombre de cellules transfectées dans le tissu1,4. Plus précisément, la transfection des tissus ayant une activité faible mitose, telles que les cellules cardiaques, est difficile5. Contrairement à pDNA, la transfection et la traduction des ARNm produisent dans les cellules mitotiques et non-mitotique dans le tissu1,6. L’intégration virale d’ADN dans le génome hôte peut venir avec des effets mutagènes ou réactions immunitaires7,8, mais après la transfection de cellules avec un ARNm codant des protéines, la synthèse de novo de la protéine désirée commence de manière autonome9,10. En outre, la synthèse des protéines peut être ajustée précisément au besoin du patient par le biais de doses individuelles, sans interférer avec le génome et risquer des effets mutagènes11. Le potentiel d’activation immunitaire des ARNm synthétiquement généré pourrait être considérablement réduit en utilisant des pseudo-uridine et 5'-méthylcytidine au lieu de l’uridine et cytidine12. Pseudo-uridine, mis à jour le mRNA a également été montré pour avoir une meilleure stabilité biologique et une significativement plus élevée capacité translationnelle13.

Pour pouvoir bénéficier des propriétés prometteuses de la thérapie axée sur les ARNm en applications cliniques, il est essentiel de créer un véhicule adapté pour le transport de l’ARNm dans les cellules. Ce véhicule devrait porter non toxique propriétés in vitro et in vivo, de protéger l’ARNm contre la nucléase-dégradation et fournir absorption cellulaire suffisante pour une disponibilité prolongée et la traduction de l’ARNm de14.

Parmi tous les types de support possible pour in vivo l’administration de médicaments, tels que les nanotubes de carbone, points quantiques et liposomes, ces derniers ont été étudiées les plus de15,16. Liposomes sont des vésicules constituée d’une bicouche de lipides10. Ils sont amphiphiles comporte un hydrophobe et une partie hydrophile, et grâce à l’entente autonome de ces molécules, une double couche sphérique est formé de17. Dans les liposomes, agents thérapeutiques ou drogues peuvent encapsulés et, ainsi, protégés de dégradation enzymatique18. Liposomes contenant N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chlorure (DOTMA)19, [1, 2-bis (oleoyloxy) -3-(triméthylammonio) propane] (DOTAP)20et21de dioctadecylamidoglycylspermine (chiens), ou DC-cholestérol22, sont bien caractérisées et fréquemment utilisé pour la transfection cellulaire avec l’ADN ou d’ARN.

Les liposomes cationiques forment un lipide chargé positivement et un phospholipide sans inculpation23. La transfection par l’intermédiaire des liposomes cationiques est l’une des méthodes plus courantes pour le transport d’acides nucléiques dans des cellules24,25. Les particules de lipide cationique forment des complexes avec les groupes phosphates chargés négativement dans le squelette de l’acide nucléique molécules26. Ces soi-disant lipoplexes fixent à la surface de la membrane cellulaire et entrer dans la cellule par endocytose ou endocytose-mécanismes27.

En 1989, Malone et al. avec succès décrits médiée par les lipides cationiques ARNm transfection28. Toutefois, à l’aide d’un mélange de DOTMA et 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), le groupe a estimé que DOTMA manifeste des effets cytotoxiques28. En outre, Zohra et coll. ont montré que DOTAP (chlorure de 1, 2-dioleoyloxy-3-triméthylammonium-propane) peut être utilisé comme un ARNm transfection réactif29. Toutefois, pour la transfection efficace des cellules, DOTAP doit être utilisé en combinaison avec d’autres réactifs, tels que la fibronectine29 ou30de la DOPE. Jusqu'à présent, DOTMA a été le premier lipide cationique sur le marché utilisé pour la livraison de gène31. Autres lipides sont utilisées comme supports thérapeutiques ou sont actuellement testés à différents stades d’essais cliniques (p. ex., EndoTAG-I, contenant DOTAP comme un transporteur de lipides), est actuellement à l’étude dans un essai clinique de phase II32.

Cet ouvrage décrit un protocole pour la génération du PNV contenant DC-cholestérol et DOPE. Cette méthode est facile à réaliser et permet la génération du PNV de différentes tailles. L’objectif général de génération de PNL à l’aide de la méthode sèche-film est de créer des liposomes pour la complexation de l’ARNm, ce qui permet de transfection de cellules efficace et biocompatible en vitro14,33.

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Protocol

1. génération de Nanoliposomes cationique (Figure 1)

  1. Dissoudre les lipides DC-cholestérol (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholestérol chlorhydrate) et DOPE (dioléoyl phosphatidyléthanolamine), livrés sous forme de poudre, dans le chloroforme à une concentration finale de 25 mg/mL.
    Note : Stocker les lipides dissous à-20 ° C.
  2. Travailler avec 25 mg/mL de solution de ces deux lipides. Mix 40 µL de la DC-cholestérol dissous et 80 µL de la DOPE dissoute dans un flacon en verre.
    Remarque : La quantité de lipides totaux est de 3 mg. Pour éviter une évaporation rapide du chloroforme, placez les lipides sur glace pendant le pipetage.
  3. Vaporiser le chloroforme pendant 15 min sous un débit de gaz d’argon. Par la suite, remplissez un dessiccateur avec gel de silice, placer la fiole de verre ouvert à l’intérieur et d’appliquer un vide durant la nuit pour s’assurer que le chloroforme restant s’évapore, et un film lipidique est formé à l’intérieur de la fiole de verre.
    Remarque : Travailler vite et d’éviter les contacts inutiles de2 O.
  4. Réhydrater le film lipidique formé avec 1 mL d’eau exempte de nucléase et vortexer la suspension pendant 15 min (Figure 2 a). Par la suite, placez la suspension dans un bain de sonication pendant 1 h (Figure 2 b).
    Remarque : La suspension sera légèrement nuageuse.
  5. Assembler l’extrudeuse mini selon les instructions du fabricant, remplissez une seringue avec la suspension de lipides et placez la seringue remplie et une seringue vide des deux côtés de l’extrudeuse. Appuyez sur la suspension des lipides à travers la membrane d’une seringue à l’autre, 20 x – x 25, à extruder la suspension (Figure 2).
    Remarque : La taille de la PNV est déterminée par la taille des pores de la membrane utilisée.
  6. Conserver le PNV dans une fiole de verre à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
    Remarque : Après un temps de stockage prolongé, le PNV doit être placé dans le bain de sonication à nouveau pendant 15 min en 35 kHz à contourner la formation d’un complexe.

2. in Vitro la Transcription de l’ARNm synthétique

  1. Préparer l’eGFP-encodage ARNm suivant le protocole publié plus tôt34.
  2. Amplifier la séquence eGFP du plasmide avec 0,7 µM de vers l’avant (5'-TTG GAC TDC CGT ACA GAA GCT AAT NOC-3') et inverse (5'-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTA TTC AAA CA GAC-3') des amorces et la polymérase kit avec PCR.
    1. Mélanger 20 µL d’une solution de tampon commercial qui modifie le comportement de fusion de l’ADN (Table des matières), ainsi que 20 µL du mélange 5 x de la trousse de la polymérase. Ajouter 7 µL de chaque amorce (avant et arrière).
    2. Ajouter 25 ng de plasmide eGFP pour le mélange et 2 µL de polymérase de la trousse de la polymérase.
      Remarque : Conservez la polymérase sur la glace avant de pipetage il à la solution.
    3. Ajouter exempte de nucléase H2O et le mélange jusqu'à un volume de 100 µL.
    4. Exécuter les cycles de la PCR dans le thermocycleur suivant le protocole dans le tableau 1.
  3. Purifier la séquence d’ADN codant eGFP avec le kit de purification de PCR.
    1. Par conséquent, mélanger la solution PCR avec 500 µL de tampon de liaison de la trousse et utilisez-la pour remplir les colonnes de purification.
    2. Centrifuger les colonnes à vitesse maximum pendant 1 min et éliminer le filtrat.
    3. Ajouter 750 µL de tampon de lavage j’ai à la colonne, centrifuger à nouveau au maximum vitesse pendant 1 min, puis annuler le filtrat.
    4. Répétez l’étape centrifugeuse 1 x pour supprimer le tampon du filtre des colonnes.
    5. Transférer la colonne pour un nouveau tube de 1,5 mL.
    6. Ajouter 20 µL d’exempte de nucléase H2O à la colonne, incuber pendant 1 min et centrifuger pendant 1 min à vitesse maximale. Répétez cette étape.
    7. Mesurer la concentration de l’ADN avec un photomètre et conserver à-20 ° C.
    8. Effectuer les analyses de qualité d’ADN par électrophorèse sur gel. Ajouter 0,5 g d’agarose dans un tampon Tris-Borate-EDTA (TBE) et le faire chauffer au micro-ondes à haute température jusqu'à dissolution complète de l’agarose.
    9. Ajouter 5 µL de solution de gel de coloration à l’agarose liquide, remplissez la solution dans le compartiment de gel et attendez que le gel est polymérisé.
    10. Mix 200 ng d’ADN avec 2 µL de 6 x chargement colorant et remplir jusqu'à un volume de fin de 12 µL. pipetter une échelle d’ADN, ainsi que l’échantillon d’ADN, dans les puits du gel et exécutez l’électrophorèse pendant 1 h à 100 V.
    11. Analyser le gel à l’aide d’une station d’analyse de gel sous la lumière UV.
  4. Exécutez la transcription in vitro pour générer des ARNm de la séquence d’ADN avec un kit transcription in vitro contenant polymérase T7 et substituer les nucléotides modifiés de l’UTP et CTP avec Ψ-UTP et méthyl-CTP.
    1. Pour la transcription in vitro , mélanger les ingrédients suivant le tableau 2.
      Remarque : Remplacer 1,5 µL de méthyl-CTP à 01:10 Cy3-CTP dilué en exempte de nucléase H2O pendant la transcription in vitro d’eGFP ARNm pour atteindre Cy3-marquage de l’ARNm.
    2. Incuber le mélange de réaction IVT pendant 4 h à 37 ° C.
    3. Ajouter 1 µL de DNase I par la polymérase T7 kit et il incuber pendant 15 min par 37 ° C à digérer la matrice d’ADN.
  5. Pour purifier les ARNm, utiliser le kit de nettoyage d’ARN.
    1. Remplir le mélange IVT au volume de 100 µL avec exempte de nucléase H2O.
    2. Ajouter 350 µL de tampon de lyse et mélanger par pipetage de haut en bas.
    3. Ajouter 250 µL d’éthanol à 100 % et mélanger à nouveau. Déposer le mélange dans les colonnes de nettoyage.
    4. Centrifuger pendant 15 s à 8 000 x g et jeter le filtrat.
    5. Ajouter 500 µL de la mémoire tampon de lavage dans une colonne, centrifuger à nouveau pendant 15 s à 8 000 x get enlever le filtrat.
    6. Laver la colonne 1 x avec 500 µL de tampon de lavage et centrifuger pendant 2 min à 8 000 x g.
    7. Déplacer la colonne dans un tube à essais frais de 1,5 mL. Éluer les ARNm 2 x par une incubation de 1 min 20 µL d’exempte de nucléase H2O sur la membrane de la colonne, suivie d’une centrifugation de 1 min à vitesse maximale.
  6. Supprimer les groupes phosphates de l’ARNm en utilisant un kit de déphosphorylation. Ajouter 4,5 µL de tampon de phosphatase x 10 et 1 µL de phosphatase de l’ARNm et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
  7. Purifier l’ARNm encore une fois, en suivant les étapes 2.5.1 - 2.5.7.
  8. Mesurer la concertation d’ARNm avec un photomètre.
  9. Électrophorèse sur gel permet d’analyser la pureté et la taille de l’ARNm. Par conséquent, préparer un gel d’agarose comme décrit aux étapes 2.3.9 - 2.3.10.
    1. 3.3 mix µL de formamide, 1 µL de 37 % de formaldéhyde, 1 µL de 10 x hommes et 1,7 µL de 6 x chargement colorant avec 200 ng d’ADN messagère et remplissez-le jusqu'à 10 µL exempte de nucléase H2O pour chaque échantillon et marqueur de RNA.
    2. Incuber le mélange pendant 10 min à 65 ° C, pour dénaturation de l’ARNm. Chargez les puits du gel avec l’ARNm et marqueur de RNA et exécutez le gel pendant 1 h à 100 V.
    3. Analyser le gel à l’aide d’une station de doc de gel avec lumière UV.

3. la complexation de l’ARNm synthétique

  1. Décongeler l’ARNm synthétique sur la glace, vortex et centrifugeuse peu avant l’ouverture du tube.
  2. Mix 10 µL d’ARNm synthétique (concentration de l’ARNm est 100 ng/µL) avec 1 µL, 2,5 µL, 5 µL, 10 µL ou 20 µL de suspension de la PNL (PNL concentration est de 3 mg/mL). Centrifuger brièvement et incuber pendant 20 min à température ambiante (RT) pour la formation de nanolipoplex.
    Remarque : Ne pas mélanger de pipetage. Cela peut conduire à la perte de volume. Vortex prochainement pour un mélange intime.
  3. Ajouter 1 mL de milieu cellulaire ordinaire à la nanolipoplexes et mélangez-les en pipettant également de haut en bas.

4. analyse de l’efficacité de l’Encapsulation du Nanoliposomes

  1. Pour effectuer les expériences d’encapsulation, utilisez le kit de quantification ARN.
  2. Préparer la solution de travail en diluant le colorant fluorescent 1 : 200 pour un haut de gamme et 1:2,000 pour un dosage bas de gamme.
    Remarque : Décongeler le colorant fluorescent sur la glace. Préparer la solution de travail directement avant utilisation.
  3. Préparer les courbes standards haut de gamme et bas de gamme, à l’aide de 1 mL d’une solution mère de 2 µg/mL d’eGFP ARNm en exempte de nucléase H2O.
    Remarque : Pour les courbes standards, utilisez l’ARNm qui est utilisés dans les expériences de l’encapsulation.
  4. Utilisez le tableau 3 pour la préparation de la norme haut de gamme (20 ng/mL - 1 µg/mL).
  5. Pour le standard de la gamme basse, diluer l’eGFP 2 µg/mL ARNm solution mère 01:20 pour obtenir une concentration finale de 100 ng/mL. Élaborer une norme de bas de gamme (1 ng/mL - 50 ng/mL) comme décrit dans le tableau 4.
  6. Mélanger 1 µg d’eGFP ARNm (10 µL) et 7,5 µg du PNV (2,5 µL) et incuber pendant 20 min à température ambiante.
    Remarque : Conservez l’ARNm sur la glace pour éviter une dégradation.
  7. Ajouter 1 mL d’exempte de nucléase H2O de forme nanolipoplexes et mix par pipetage de haut en bas.
  8. Ajouter 1 mL de solution 1 : 200 ou 1:2,000 de travail du colorant fluorescent RNA aux normes et échantillons encapsulés et incuber pendant 5 min à la RT dans l’obscurité.
  9. Pipetter, les normes et les échantillons en double dans une plaque à 96 puits noire et mesurer la fluorescence à 530 nm sur un lecteur de microplaques (Figure 3).

5. préparation des cellules pour la Transfection

  1. Plaque de 1,5 x 105 A549 cellules/puits d’une plaque de 12 puits 1D avant la transfection.
  2. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un milieu cellulaire ordinaire (glucose DMEM/haut avec 10 % sérum de veau fœtal [BF], 2 mM de L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine) pendant 24 h avant la transfection.

6. la transfection des cellules

  1. Laver les préparés cellules 1 x avec 1 mL par puits de PBS (sans Ca2 + /Mg2 +).
  2. Ajouter 1 mL de mélange nanolipoplex préparés, contenant 1 µg d’eGFP Qu'arnm encapsulée dans 1 µL, 2,5 µL, 5 µL, 10 µL ou PNV 20 µL, à un puits de la plaque préparée avec des cellules A549.
  3. Ajouter la suspension nanolipoplex aux cellules et incuber pendant 24 h analyser l’efficacité de transfection, ou aux conditions régulières pour 24h et 72 h pour analyser la viabilité cellulaire après la transfection.
    Remarque : Transfection avec le PNV ne nécessite pas un changement médiatique.

7. analyse de l’efficacité de Transfection cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux et la microscopie de Fluorescence

  1. Retirez le surnageant et laver les cellules avec 1 mL/bien PBS (sans Ca2 +/Mg2 +) pour enlever le PNV restants.
  2. Préparer les cellules pour la cytométrie en flux.
    1. Trypsinize les cellules avec 500 µL/puits trypsine/EDTA (0,05 %) à 37 ° C pendant 3 min. arrêt du processus et inactiver la trypsine en ajoutant la même quantité (500 µL/puits) d’ordinaire milieu contenant du FBS.
    2. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g et retirer délicatement le surnageant sans toucher le culot cellulaire.
    3. Laver les cellules avec 1 mL de PBS (sans Ca2 + /Mg2 +).
    4. Remettre en suspension les cellules dans 300 µL de solution de fixation 1 x et les cellules de transfert dans des tubes de cytométrie de flux.
    5. Analyser les cellules à 488 nm dans un cytomètre de flux (Figure 4 a).
      Remarque : Vortex les cellules 1 x directement avant la mesure.
  3. Préparer les cellules pour la microscopie de fluorescence.
    1. Fixer les cellules avec 1 mL/puits 100 % de méthanol, qui a été précédemment stocké à-20 ° C.
    2. Ajouter 500 µL/puits 300 nM DAPI (4′, 6-diamidino-2-phénylindole) dissous dans du PBS (sans Ca2 +/Mg2 +) et incuber pendant 5 min dans le noir.
    3. Enlever la solution DAPI et laver les cellules encore une fois avec 100 % de méthanol stocké à-20 ° C.
    4. Analyser les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence (Figure 4 b).
      Remarque : Utilisez les longueurs d’onde d’excitation/émission suivante : eGFP 488/509 nm, nm DAPI 358/461 et Cy3 550/570 nm.

8. analyse de viabilité de cellules

  1. Dissoudre 5 mg de MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) dans 1 mL de milieu RPMI (sans rouge de phénol).
    Remarque : Le MTT dissous doit être plus dilué 01:10 (concentration finale : 0,5 mg/mL) en milieu RPMI avant utilisation.
  2. Laver les cellules transfectées 3 x avec 1 mL par puits de PBS (sans Ca2 +/Mg2).
    Remarque : Les restes du milieu cellulaire ordinaire devraient être complètement enlevés.
  3. Ajouter 500 µL/puits de 01:10 solution MTT aux cellules dilué et incuber pendant 4 h à 37 ° C.
  4. Enlever la solution MTT des cellules après incubation et ajouter 500 µL/puits DMSO (diméthyl sulfoxyde). Incuber à nouveau pendant 10 min à 37 ° C.
  5. Dans une plaque de 96 puits clear-fond, déposer la solution DMSO en triolets et mesurer l’adsorption à 540 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
  6. La valeur de la viabilité de la cellule non traitée sur 100 % et calculer la viabilité cellulaire des autres groupes en comparaison avec les cellules témoins non traitées (Figure 5).

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Representative Results

En utilisant le protocole comme décrit, PNV consistant en des lipides DC-cholestérol et DOPE ont été préparés selon la méthode de sec-film (Figure 1). Pendant la préparation, la solution de nanoliposome montre différentes étapes de la turbidité (Figure 2).

L’efficacité de l’encapsulation de la PNV peut ensuite être analysée après l’encapsulation de 1 µg d’ARNm codant eGFP en analysant le montant libre de l’ARNm, qui n’est pas encapsulé, en utilisant le kit de quantification ARN (Figure 3).

Après l’encapsulation d’eGFP Qu'arnm en quantités différentes du PNV, le nanolipoplexes formé peut être incubées avec des cellules in vitro et le pourcentage de cellules exprimant eGFP peuvent être analysées à l’aide de posttransfection de 24h cytométrie en flux (Figure 4 a) . Même 1 µL de la solution nanoliposome est suffisante pour réaliser une transfection haute de la cellules in vitro. Quand les cellules sont transfectées avec PNV contenant marqué Cy3 eGFP ARNm, la présence de l’eGFP ARNm dans le cytoplasme (fluorescence rouge), ainsi que la protéine eGFP déjà produites (fluorescence verte) peut être visualisé (Figure 4 b).

Puisque la transfection des cellules à l’aide de nanolipoplexes peut avoir des effets néfastes sur les cellules, la viabilité des cellules a été testée 24h (Figure 5 a) et posttransfection de 72 h (Figure 5 b). Aucun effet sur la viabilité cellulaire ne pourrait être détecté lorsque les cellules ont été traitées avec 2,5 ou 5 µL du PNV ou nanolipoplexes, respectivement.

Figure 1
Figure 1 : aperçu schématique du procédé de fabrication de cationiques nanoliposomes. Tout d’abord, les lipides dissous DC-cholestérol et DOPE doivent être mélangés ensemble dans un flacon en verre. Deuxièmement, le liquide de chloroforme visible doit être évaporé sous argon, ou le débit de gaz d’azote et les restes de chloroforme devraient pouvoir s’évaporer du jour au lendemain dans le vide. Troisièmement, le film lipidique formé sur le fond de la fiole de verre doit être réhydraté avec exempte de nucléase H2O, suivi de l’utilisation du vortex pour former des liposomes multilamellaires. Par le biais de la sonification et extrusion de la solution de liposome, le prêt-à-utiliser unilamellaires PNV sont produites. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : la solution de nanoliposome à différents stades au cours de la fabrication. (A), cette figure montre la solution de liposome directement après réhydratation du film lipidique et mélangé au vortex pour 15 min, ainsi que (B) après 1 h dans une sonication bain (C) suivie de 25 cycles d’extrusion. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : efficacité d’Encapsulation de la nanoliposomes. Ce panneau montre la quantification des eGFP gratuit ARNm après encapsulation au PNV. Les résultats sont présentés comme le moyen ± SEM (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : efficacité de Transfection de le nanolipoplexes. (A), ce panneau montre la détermination des meilleurs rapports pour la transfection utilisant différentes quantités de PNV pour encapsuler 1 µg de posttransfection de 24h eGFP ARNm ARNm/nanoliposome. (B) ce panneau montre la détection de l’ARNm synthétique marqué Cy3 encapsulé dans 2,5 µL PNV et l’expression eGFP dans la posttransfection de 24h de cellules (la barre d’échelle = 50 µm). Les résultats sont présentés comme le moyen ± SEM (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : viabilité cellulaire après la transfection avec l’ARNm encapsulé et nanoliposomes. Ce panneau indique la mesure de la viabilité des cellules à l’aide d’un test MTT (A) 24 h et (B) 72 h posttransfection. Les résultats sont présentés comme le moyen ± SEM (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Étape Température en ° C Durée
1 95 5 min
2 94 15 s
3 55 1 min
4 72 1 min
5 Aller à 2 30 x
6 72 10 min
7 4 Maintenez

Tableau 1 : PCR cycle de protocole pour l’amplification de l’ADN.

Concentration de Montant
ATP 7,5 mM 4 ΜL
GTP 1 875 mM 1 ΜL
5'-Methylcytidin 7,5 mM 3 ΜL
Ψ 7,5 mM 3 ΜL
ARCA 2,5 mM 10 ΜL
Matrice d’ADN 1,5 µg
Mélange tampon 1 x 4 ΜL
Mélange enzymatique T7 4ΜL
Inhibiteur de RNase 1 ΜL
Eau exempte de nucléase remplir jusqu'à 40 µL

Tableau 2 : Mix pour le à la vitro transcription de l’ADN de mRNA.

Volume d’exempte de nucléase H2O (µL) Volume de solution mère haut de gamme (µL) de l’ARNm eGFP Volume de 1 : 200 colorant fluorescent (µL) Concentration finale (ng/mL)
0 100 100 1000
50 50 100 500
90 10 100 100
98 2 100 20
100 0 100 vide

Tableau 3 : Protocole pour une courbe standard haut de gamme.

Volume d’exempte de nucléase H2O (µL) Volume de solution mère bas de gamme (µL) de l’ARNm eGFP Volume de 1 : 2000 colorant fluorescent (µL) Concentration finale (ng/mL)
0 100 100 50
50 50 100 25
90 10 100 5
98 2 100 1
100 0 100 vide

Tableau 4 : Protocole pour une courbe standard de la gamme basse.

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Discussion

Le protocole présenté décrit la génération du PNV avec efficacité d’encapsulation élevée d’ARNm synthétiquement mis à jour le, ainsi que la fiabilité transfection des cellules in vitro. En outre, le PNV garantie la libération des ARNm, qui à son tour, est traduit en une protéine fonctionnelle à l’intérieur des cellules. En outre, les transfections utilisant le PNV peut être effectuée dans un milieu ordinaire cellulaire, résultant en grande viabilité de cellules au cours de la transfection, et durer jusqu'à trois jours après la transfection.

Pour utiliser ARNm comme une thérapeutique, il est préférable d’auto-assemblage système pour sa livraison. Les réactifs de transfection plus courantes incluent des lipides cationiques, y compris les liposomes. Comme les liposomes sont chargés positivement, négativement chargés d’acides nucléiques peut être encapsulés dans eux, permettant ainsi à la répulsion électrostatique des membranes cellulaires pour surmonter35. Le lipide cationique DC-cholestérol a été déjà décrit dans des études antérieures comme un véhicule stable et biocompatible36. L’addition des lipides neutres DOPE conduit à une efficacité de transfection renforcée37. Considérant les avantages décrits mentionnés ci-dessus, ces lipides ont été choisis pour la préparation du PNV. En outre, des études antérieures ont démontré que l’utilisation de ces deux lipides est préférable sur les autres en raison d’un taux accru de transfection cellulaire avec des acides nucléiques chargés négativement,38.

Pour la génération réussie du PNV et nanolipoplexes, il est essentiel de prêter une attention particulière à certaines étapes. La procédure de génération de nanoliposome doit être effectuée dans l’O2-gratuit conditions. La présence d’O2 lors de la génération de la PNL peut conduire à la dégradation des phospholipides et reproductibilité réduite39. En outre, malgré les adaptations, l’ARNm est très sensible en ce qui concerne la dégradation par les nucléases. Par conséquent, pour la réhydratation du film lipidique, l’utilisation du libre de RNase H2O est fortement recommandée pour prévenir la dégradation de l’ARNm lors de la complexation. En outre, des conditions sans RNase devraient être assurées pour le stockage de nanolipoplexes.

En outre, PNV peut forment des agrégats au fil du temps en raison du système thermodynamique instable. L’influence de paramètres comprennent la température de stockage et de la charge de surface des liposomes40. Agrégation de la PNL peut entraîner la déstabilisation de la membrane du liposome et le risque d’indésirables ARNm sortie41, conduisant à la dégradation des ARNm et efficacité pauvre transfection dans l’espace extracellulaire. Toutefois, comme précédemment indiqué, nanolipoplexes peuvent être stockés à 4 ° C jusqu'à six mois sans agrégation ou de la perte d' efficacité de transfection35.

À l’aide de liposomes comme un système de support de drogue, deux des principaux problèmes de livraison de drogue peuvent être résolus. Liposomes protègent la drogue encapsulée d’une dégradation et sont capables de passivement les tissus cibles ayant un Endothélium discontinu, comme le foie ou la moelle osseuse16. Pour la livraison de la thérapeutique des acides nucléiques, des paramètres tels que la taille des particules et encapsulation capacité sont critiques pour la captation cellulaire et de l’évaluation des véhicules liposomales. En particulier, la taille des liposomes à l’échelle du nanomètre permet une interaction avec la membrane de la cellule42 et est, par conséquent, importante pour l’utilisation in vivo par la suite. Tout d’abord, les liposomes devraient être suffisamment petites pour éviter l’autorisation via le système rénal et hépatique43. Deuxièmement, la taille de liposome devrait contribuer à surmonter la barrière des vaisseaux sanguins pour cibler les cellules de l’organe souhaité. Il a été signalé que les liposomes dans la gamme de taille de 100-300 nm ont pu efficacement transfecter hépatocytes44; grand-de taille cependant, liposomes (p. ex., 400 nm) n’étaient pas en mesure de surmonter la barrière endothéliale45.

Bien que la méthode décrite a été établie pour la livraison de l’ARNm, il peut également être implémenté pour les autres produits thérapeutiques d’acide nucléique, tels que les micro-ARN. Dans une étude récente, nous avons démontré que les microARN 126 peut être ciblé de manière sélective et, par conséquent, le développement d’anévrismes de l’aorte abdominales pourrait être efficacement empêché46. Comme thérapeutique de l’ADN/ARN peut provoquer des effets secondaires, tels que l’activation des plaquettes, lorsqu’ils entrent en contact direct avec les cellules, emballage dans les liposomes peut éviter ce problème, rendant ainsi plus avantageux47. Par conséquent, la méthode présentée ici est très polyvalente et peut être utilisée pour la conception de médicaments pour de nombreuses maladies. Le protocole établi non seulement permet la génération rapide et rentable d’un transporteur d’ARNm efficace avec une taille définie, mais offre également la possibilité de personnaliser la formulation de lipides selon les besoins d’une application particulière : (1) la taille de la liposomes peuvent facilement être modifiés en changeant les filtres ; (2) la surface des liposomes chargés positivement peut être modifiée en utilisant, par exemple, polyéthylène glycol, pour augmenter la stabilité et retard clairance sanguine pendant en vivo demande48. La liaison des anticorps spécifiques aux liposomes permet l’administration ciblée des médicaments encapsulés49. Avec un examen plus approfondi et un aperçu plus détaillé sur les propriétés physiques, le protocole pourrait encore être amélioré sur.

Pour la génération de liposomes, il existe trois méthodes courantes : le film sec, l’injection d’éthanol et l’évaporation de phase inverse. Yang et al. étude, ces trois techniques de fabrication ont été comparés à35. Il a été constaté que les liposomes avec une taille et une répartition égale de la solution peuvent être générés à l’aide de la méthode sèche-film. En outre, la procédure de sec-film menée dans cette étude a abouti à la production du PNV avec une taille de 200 nm, une répartition homogène et une capacité d’encapsulation élevée.

D’une part, la charge positive des liposomes mène à une capacité accrue d’encapsulation et la meilleure cellule fusion surface50,51,52, mais en revanche, il peut déstabiliser la membrane cellulaire et activer voies d’activation immunitaire différent et cellule mort27,53. Toutefois, les propriétés apoptotiques de lipides cationiques peuvent être minimisées en utilisant le helper lipides DOPE54,55. Dans l’étude par Zhang et al., il a été constaté qu’un ratio de 1:2 de DC-cholestérol et DOPE pendant la génération du liposome entraîne la transfection cellulaire plus efficace à l’aide d’acides nucléiques38. Dans la méthode implémentée dans la présente étude, la proportion de lipides 1:2 DC-cholestérol et DOPE a été utilisée dans la suspension mixte lipides au cours de la préparation du film lipidique et les liposomes préparés a conduit à l’efficacité de transfection élevé et, simultanément, haute cellulaire viabilité. Des résultats similaires ont été trouvés également par d’autres chercheurs, tels que Ciani56 et Sophie37.

Dans l’ensemble, les liposomes ont été utilisés pendant des années dans les essais cliniques, montrant la grande biocompatibilité et faible toxicité in vivo. En combinaison avec l’ARNm, PNV pourrait servir pour l’exécution efficace du mRNA d’organes ou cellules in vitro et in vivo, pour induire la synthèse de novo d’une protéine désirée. En ce qui concerne les applications thérapeutiques, nanolipoplexes pourrait servir, par exemple, dans la plaie guérison patches transdermiques ARNm livraison57 activer la régénération cellulaire, ou sous forme de pulvérisation pour la nébulisation d’ARNm58 pour la guérison du poumon 59,60 , comme la fibrose kystique, maladies.

Le protocole présenté garantit un moyen facile et accessible pour la génération du PNV à l’aide de la méthode sèche-film, qui peut ensuite être utilisée pour l’encapsulation efficace de in vitro transcrit la sécurité transfection des cellules et l’ARNm.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Aucun

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) AppliChem, Darmstadt, Germany A2231
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) Avanti, Alabama, USA 700001
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany D1306
BD FACScan system BD Biosciences, Heidelberg, Germany
Cell Fix (10x) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 340181
Chloroform Merck, Darmstadt, Germany 102445
Dimethyl sulfoxid (DMSO) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 20385.02
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti, Alabama, USA 850725
Fluorescence microscope Zeiss Axio, Oberkochen, Germany
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11668019
Mini extruder Avanti, Alabama, USA
Nuclease-free water Qiagen, Hilden, Germany 129114
Opti-Mem Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11058021
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 70011044
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany Q33140
RPMI (w/o phenol red) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 11835030
Silica gel Carl Roth, Karlsruhe, Germany P077
Trypsin/EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 25300054
HotStar HiFidelity Polymerase Kit Qiagen, Hilden, Germany 202602
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden, Germany 28104

Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP)		 TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1019
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) TriLink Biotechnologies, San Diego, USA N-1014
Cyanine 3-CTP PerkinElmer, Baesweiler, Germany NEL580001EA
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 74104
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs, Ipswich, USA S1411L
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Ipswich, USA M0289S
Agarose Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 16500-500
GelRed Biotium, Fremont, USA 41003
peqGOLD DNA ladder mix VWR, Pennsylvania, USA 25-2040
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder Fisher Scientific, Göteborg,
Sweden		 11528766

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Bio-ingénierie numéro 144 ARNm nanoliposomes DOPE DC-cholestérol encapsulation transfection livraison thérapeutique
Génération de Nanoliposomes cationiques pour la prestation efficace de <em>In Vitro</em> transcrit l’ARN messager
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