هنا يمكننا وصف بروتوكول لتوليد نانوليبوسوميس الأيوني، الذي يستند إلى الأسلوب الجاف-الفيلم ويمكن استخدامها الآمنة وتقديم كفاءة في المختبر نسخها رسول الجيش الملكي النيبالي.
وضع الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً)-على أساس المداواة لعلاج الأمراض المختلفة أصبح أكثر وأكثر أهمية بسبب الإيجابية خصائص في المختبر نسخها مرناً (IVT). مع المساعدة من IVT مرناً، يمكن أن يتسبب حيثياته تخليق البروتين المطلوب دون تغيير الحالة الفسيولوجية للخلية الهدف. وعلاوة على ذلك، يمكن التحكم تخليق البروتين الحيوي بدقة نظراً لتأثير عابر من IVT مرناً.
تعداء كفاءة للخلايا، نانوليبوسوميس (نلبس) قد تمثل وسيلة إيصال آمنة وفعالة مرناً العلاجية. تصف هذه الدراسة وضع بروتوكول لتوليد آمنة وفعالة الموجبة نلبس تتألف من DC-الكوليسترول و 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (منشطات) كوسيلة إيصال مرناً IVT. نلبس بعد من معرفة حجم، توزيعاً متجانساً، وقدرة كومبليكسيشن عالية، ويمكن أن تنتج باستخدام الأسلوب الجاف-فيلم. وعلاوة على ذلك، نقدم نظم اختبار مختلفة لتحليل ما كومبليكسيشن وزيادة بلغت تعداء الاصطناعية باستخدام البروتينات الفلورية الخضراء (اجفب) مرناً، فضلا عن تأثيرها على بقاء الخلية. إجمالاً، ينص البروتوكول على عرض نهج فعالة وآمنة complexation مرناً، التي قد تقدم وتحسين الإدارة مرناً العلاجية.
استخدام مرناً معدلة للتطبيقات العلاجية أظهرت إمكانات كبيرة في العامين الماضيين. في أمراض القلب والأوعية الدموية، والالتهابات، ومونوجينيتيك، وكذلك في تطوير اللقاحات، مرناً هو وكيل علاجية واعدة1.
العلاج استبدال البروتين مع مرناً يوفر العديد من المزايا على مدى العلاج الجيني الكلاسيكية، التي تستند إلى تعداء الحمض النووي في الخلايا الهدف2. يبدأ الدالة مرناً في مباشرة سيتوسول. على الرغم من أن بلازميد الحمض النووي (بدنا)، بنية مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل، والتعميم الحمض النووي الذي يحتوي على منطقة مروج وتسلسل جينات ترميز البروتين العلاجي3، أيضا من أعمال في سيتوسول، يمكن فقط إدراجها في الخلايا التي تسير من خلال الانقسام في وقت تعداء. وهذا يقلل عدد transfected الخلايا في الأنسجة1،4. على وجه التحديد، هو تعداء للأنسجة مع النشاط الانقسام ضعيفة، مثل خلايا القلب، صعوبة5. على النقيض من بدنا، تحدث تعداء وترجمة مرناً في الخلايا الانقسامية وغير الانقسامية في1،الأنسجة6. قد يأتي اندماج الحمض النووي الفيروسي في جينوم المضيف مع تأثيرات مطفرة أو ردود فعل المناعة7،8، ولكن بعد تعداء الخلايا التي تحتوي على ترميز البروتين مرناً، نوفو دي تخليق البروتين المطلوب يبدأ مستقلة9،10. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل تخليق البروتين تحديداً إلى الحاجة للمريض عن طريق الجرعات الفردية، دون التدخل في الجينوم والمخاطرة بتأثيرات مطفرة11. يمكن خفض إمكانات تنشيط المناعة مرناً ولدت صناعيا هائلا باستخدام أردين الزائفة و 5 ‘-ميثيلسيتيديني بدلاً من أردين وسيتيديني12. أردين الزائفة كما تبين مرناً معدلة زيادة استقرار البيولوجي وأعلى بكثير قدرات متعدية الجنسيات13.
لتكون قادرة على الاستفادة من خصائص الواعدة للعلاج على أساس مرناً في التطبيقات السريرية، من الضروري إنشاء أداة مناسبة لنقل مرناً في الخلية. يجب أن تحمل خصائص غير سامة في المختبر و في فيفوهذه المركبات وحماية مرناً ضد تدهور نوكلاس وتوفر امتصاص الخلوية كافية لتوافر المطول والترجمة مرناً14.
من بين جميع أنواع الناقل المحتملة في فيفو تسليم المخدرات، مثل الأنابيب النانوية الكربونية، ونقاط الكم، والدهنية، هذا الأخير قد تم درس أكثر من15،16. الدهنية حويصلات تتألف من بلير الدهن10. وهم أمفيفيليك مع مسعور ومقطع ماء، ومن خلال هذا الترتيب الذاتي لهذه الجزيئات، طبقة مزدوجة كروية شكلت17. داخل الدهنية، العوامل العلاجية أو المخدرات يمكن تغليف و، وبالتالي، محمية من تدهور الانزيمية18. الدهنية التي تحتوي على N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium كلوريد (دوتما)19، [1، 2-مكررا (أوليويلوكسي)-3-البروبان (تريميثيلامونيو)] (دوتاب)20، و21من ديوكتاديسيلاميدوجليسيلسبيرميني (الكلاب)، أو الكولسترول DC-22، تتميز جيدا وكثيراً ما تستخدم تعداء الخلوية مع الحمض النووي الريبي أو.
وتتألف الدهنية الموجبة دهن مشحونة بشكل إيجابي ودون توجيه تهمة إليه فسفوليبيد23. تعداء عبر الدهنية الموجبة واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً لنقل الأحماض النووية في الخلايا24،25. تشكل جزيئات الدهن الموجبة المجمعات مع مجموعات الفوسفات مشحونة سلبا في العمود الفقري ل جزيئات الحمض النووي26. هذه ليبوبليكسيس ما يسمى نعلق على سطح غشاء الخلية وإدخال الخلية عن طريق الالتقام أو الالتقام-مثل-آليات27.
في عام 1989، مالون وآخرون. ووصف بنجاح الموجبة الدهون بوساطة مرناً تعداء28. ومع ذلك، باستخدام خليط من دوتما و 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (المخدر)، وجد الفريق أن دوتما تتجلى الآثار السامة للخلايا28. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت زهرة et al. أن دوتاب (1، 2-ديوليويلوكسي-3-تريميثيلامونيوم-البروبان كلوريد) يمكن أن تستخدم ككاشف تعداء مرناً29. ومع ذلك، تعداء كفاءة للخلايا، ينبغي استخدام دوتاب في تركيبة مع الكواشف الأخرى، مثل فيبرونيكتين29 أو30من المخدر. وحتى الآن، كان دوتما الدهون الموجبة الأولى في السوق المستخدمة ل توصيل الجينات31. الدهون الأخرى تستخدم كناقلات العلاجية أو يجري اختبارها في مراحل مختلفة من التجارب السريرية، (مثلاً، اندوتاج-الأول، الذي يحتوي على دوتاب كناقل دهن)، ويجري التحقيق حاليا في مرحلة الثانية لمحاكمة سريرية32.
يصف هذا العمل وضع بروتوكول لتوليد نلبس المحتوية على DC-الكوليسترول ومخدر. من السهل القيام بهذا الأسلوب ويسمح لتوليد نلبس ذات أحجام مختلفة. الهدف العام لتوليد البرمجة اللغوية العصبية باستخدام الأسلوب الجاف-فيلم إنشاء الدهنية ل complexation مرناً، مما يتيح تعداء خلية فعالة ومتوافق حيويا في المختبر14،33.
ويصف البروتوكول قدم توليد نلبس مع تغليف عالية الفعالية مرناً معدلة صناعيا، وكذلك تعداء موثوقة من الخلايا في المختبر. وعلاوة على ذلك، نلبس كفالة الإفراج عن مرناً، الذي بدوره يترجم إلى بروتين وظيفية داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، ترانسفيكشنز استخدام نلبس يمكن أن يؤديها في الخلية الع?…
The authors have nothing to disclose.
لا شيء
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
(3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |