Summary
Qui descriviamo un protocollo per la generazione di nanoliposomi cationici, che si basa sul metodo a secco-pellicola e possono essere utilizzato per la cassaforte e consegna efficiente in vitro di trascritti di RNA messaggero.
Abstract
Lo sviluppo di RNA messaggero (mRNA)-base terapeutica per il trattamento di varie malattie diventa sempre più importante a causa del positivo proprietà in vitro di trascritti di mRNA (IVT). Con l'aiuto di IVT mRNA, la sintesi de novo di una proteina desiderata può essere indotta senza modificare lo stato fisiologico della cellula bersaglio. Inoltre, biosintesi della proteina può essere controllato proprio a causa dell'effetto transitorio di IVT mRNA.
Per l'efficiente transfezione delle celle, nanoliposomi (NLps) possono rappresentare un veicolo di consegna sicura ed efficiente per mRNA terapeutico. Questo studio descrive un protocollo per generare sicura ed efficiente cationici NLps costituito da DC-colesterolo e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) come un vettore di consegna di IVT mRNA. NLps avendo una definita dimensione, una distribuzione omogenea e una capacità di complessazione alta e può essere prodotto utilizzando il metodo di film secco. Inoltre, presentiamo sistemi di prova differenti per analizzare loro complessazione ed efficacies di transfezione utilizzando sintetico enhanced proteina fluorescente verde (eGFP) mRNA, come pure il loro effetto sulla vitalità cellulare. Nel complesso, il protocollo presentato fornisce un approccio efficace e sicuro per complessazione di mRNA, che può progredire e migliorare l'amministrazione di mRNA terapeutico.
Introduction
L'uso di mRNA modificate per applicazioni terapeutiche ha dimostrato grandi potenzialità nell'ultimo paio di anni. Nelle malattie cardiovascolari, infiammatorie e monogenetica, così come lo sviluppo di vaccini, mRNA è un agente terapeutico promettente1.
Terapia sostitutiva della proteina con mRNA offre diversi vantaggi rispetto alla terapia genica classica, che si basa sulla transfezione del DNA nelle cellule bersaglio2. La funzione di mRNA avvia direttamente nel citosol. Anche se il plasmide DNA (pDNA), un costrutto di double-stranded, circolare DNA che contiene una regione di promotore e una sequenza del gene che codifica la proteina terapeutica3, anche atti nel citosol, può solo essere incorporata nelle cellule che stanno attraversando la mitosi al momento della trasfezione. Questo riduce il numero delle cellule transfettate in tessuto1,4. In particolare, la transfezione di tessuti con attività debole mitosi, come cellule cardiache, è difficile5. A differenza di pDNA, la transfezione e la traduzione di mRNA si verificano nelle cellule mitotiche e non-mitotica in tessuto1,6. L'integrazione virale del DNA nel genoma ospite può venire con effetti mutageni o reazioni immunitarie7,8, ma dopo la trasfezione di cellule con una codifica della proteina mRNA, la sintesi de novo della proteina voluta inizia in modo autonomo9,10. Inoltre, la sintesi delle proteine può essere regolata precisamente alla necessità del paziente attraverso dosi individuali, senza interferire con il genoma e rischiare gli effetti mutageni11. Il potenziale d'attivazione immunitaria del mRNA sinteticamente generato potrebbe essere drasticamente abbassato utilizzando pseudo-uridina e 5'-methylcytidine invece di uridina e citidina12. Pseudo-uridina modificate mRNA inoltre è stato indicato per avere una maggiore stabilità biologica e una significativamente più alta capacità traslazionale13.
Per poter beneficiare delle proprietà promettenti di terapia a base di mRNA in applicazioni cliniche, è essenziale per creare un veicolo adatto per il trasporto del mRNA nella cellula. Questo veicolo dovrebbe sopportare non tossico proprietà in vitro e in vivo, proteggere il mRNA contro nucleasi-degradazione e fornire sufficiente assorbimento cellulare per una disponibilità prolungata e la traduzione del mRNA14.
Tra tutti i tipi di vettore possibile per in vivo somministrazione di farmaci, quali nanotubi di carbonio, punti quantici e liposomi, quest'ultimo è stati studiati più di15,16. I liposomi sono vescicole costituito da un doppio strato di lipidi10. Sono anfifiliche con un idrofobo e una sezione idrofila, e attraverso l'auto-organizzazione di queste molecole, un doppio strato sferico è formata17. All'interno di liposomi, agenti terapeutici o farmaci possono essere incapsulati e, così, protetti dalla degradazione enzimatica18. Liposomi contenenti N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloruro (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimethylammonio) propano] (DOTAP)20e dioctadecylamidoglycylspermine (cani)21, o DC-colesterolo22, sono ben caratterizzati e frequentemente utilizzati per la transfezione cellulare con DNA o RNA.
Liposomi cationici comprendono un caricato positiva del lipido e un fosfolipide uncharged23. Transfezione tramite liposomi cationici è uno dei metodi più comuni per il trasporto di acidi nucleici in cellule24,25. Le particelle di lipide cationico formano complessi con i gruppi fosfato negativamente caricato nella spina dorsale di molecole di acido nucleico26. Questi cosiddetti lipoplessi attaccare alla superficie della membrana cellulare ed entrano nella cellula tramite endocitosi o meccanismi di endocitosi-come27.
Nel 1989, Malone et al. descritto con successo mediata dei lipidi cationici mRNA transfezione28. Tuttavia, utilizzando una miscela di DOTMA e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), il gruppo ha trovato che DOTMA manifestato effetti citotossici28. Inoltre, Zohra et al hanno dimostrato che DOTAP (cloruro di 1,2-dioleoyloxy-3-trimetilammonio-propano) può essere utilizzato come un reagente di transfezione mRNA29. Tuttavia, per l'efficiente transfezione delle celle, DOTAP dovrebbe essere usato in combinazione con altri reagenti, come fibronectina29 o DOPE30. Finora, DOTMA era il primo lipide cationico sul mercato utilizzato per la consegna di gene31. Altri lipidi sono usate come supporto terapeutico o vengono testati in diverse fasi della sperimentazione clinica, (ad es., EndoTAG-I, contenente DOTAP come un elemento portante del lipido), è attualmente oggetto di indagine in un trial clinico di fase-II32.
Questo lavoro descrive un protocollo per la generazione di NLps contenente DC-colesterolo e DOPE. Questo metodo è facile da eseguire e permette la generazione di NLps di diverse dimensioni. L'obiettivo generale di generazione di NLp utilizzando il metodo a secco-pellicola è quello di creare liposomi per complessazione di mRNA, consentendo così efficiente e biocompatibile cellula trasfezione in vitro14,33.
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Protocol
1. generazione di nanoliposomi cationici (Figura 1)
- Sciogliere i lipidi DC-colesterolo (3beta - cloridrato di colesterolo [N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoil]) e DOPE (dioleoyl phosphatidylethanolamine), consegnato sotto forma di polvere, in cloroformio per ottenere una concentrazione finale di 25 mg/mL.
Nota: Conservare i lipidi disciolti a-20 ° C. - Lavorare con 25 mg/mL di soluzione madre di entrambi i lipidi. Mix 40 µ l del disciolto DC-colesterolo e 80 µ l di the DOPE disciolto in un fiasco di vetro.
Nota: La quantità totale di lipidi è di 3 mg. Per evitare la rapida evaporazione del cloroformio, mettere i lipidi sul ghiaccio durante il pipettaggio. - Vaporizzare il cloroformio per 15 min sotto un flusso di gas argon. Successivamente, riempire un essiccatore con gel di silice, posizionare la boccetta di vetro aperto all'interno e applicare un vuoto durante la notte per assicurarsi che il cloroformio restante è evaporato, e un film lipidico è formato all'interno la boccetta di vetro.
Nota: Lavorare velocemente ed evitare inutili O2 contatti. - Reidratare il film lipidico formata con 1 mL di acqua priva di nucleasi e vortice la sospensione per 15 min (Figura 2A). In seguito, inserire la sospensione in un bagno di sonicazione per 1 h (Figura 2B).
Nota: La sospensione sarà leggermente torbida. - Assemblare il mini estrusore secondo le istruzioni del produttore, riempire una siringa con la sospensione del lipido e posizionare la siringa riempita e una siringa vuota su entrambi i lati dell'estrusore. Premere la sospensione dei lipidi attraverso la membrana da una siringa a altra, 20 x – x 25, per estrudere la sospensione (Figura 2).
Nota: La dimensione del NLps è determinata dalle dimensioni dei pori della membrana utilizzata. - Memorizzare il NLps in un fiasco di vetro a 4 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
Nota: Dopo il tempo di conservazione prolungata, la NLps devono essere messi nel bagno di sonicazione ancora per 15 min da 35 kHz a eludere la formazione del complesso.
2. in Vitro trascrizione del mRNA sintetico
- Preparare la codifica di eGFP mRNA seguendo il protocollo pubblicato precedenti34.
- Amplificare la sequenza di eGFP dal plasmide con 0,7 µM di andata (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') e inversa (5'-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') primer e la polimerasi kit con PCR.
- Mescolare 20 µ l di una soluzione tampone commerciale che cambia il comportamento in fusione del DNA (Tabella materiali), così come 20 µ l della miscela 5x dal kit della polimerasi. 7 µ l di ciascun primer (avanti e indietro).
- Aggiungere 25 ng di plasmide eGFP per la miscela e 2 µ l di polimerasi dal kit della polimerasi.
Nota: Tenere la polimerasi sul ghiaccio prima di pipettaggio esso alla soluzione. - Aggiungere privo di nucleasi H2O alla miscela, fino ad un volume di 100 µ l.
- Eseguire i cicli PCR in thermocycler seguendo il protocollo nella tabella 1.
- Purificare la sequenza di DNA codifica eGFP con il kit di purificazione di PCR.
- Pertanto, miscelare la soluzione PCR con 500 µ l di tampone di associazione dal kit e si usa per riempire le colonne di purificazione.
- Centrifugare le colonne alla massima velocità per 1 minuto e scartare il filtrato.
- Aggiungere 750 µ l di tampone di lavaggio ho alla colonna, centrifuga nuovamente alla massima velocità per 1 min e scartare il filtrato.
- Ripetere il passaggio 1 x per rimuovere il buffer dal filtro colonna di centrifuga.
- Trasferire la colonna in una nuova provetta da 1,5 mL.
- Aggiungere 20 µ l di nucleasi-free H2O alla colonna, incubare per 1 min e centrifugare per 1 min alla massima velocità. Ripetere questo passaggio.
- Misurare la concentrazione del DNA con un fotometro e conservare a-20 ° C.
- Eseguire le analisi di qualità del DNA usando elettroforesi del gel. Aggiungere 0,5 g di agarosio in tampone Tris-Borato-EDTA (TBE) e scaldarla nel forno a microonde a fuoco alto fino a quando l'agarosio è completamente sciolto.
- Aggiungere 5 µ l di soluzione di macchiatura del gel di agarosio liquido, riempire la soluzione nella camera di gel e attendere fino a quando il gel viene polimerizzato.
- Mix 200 ng di DNA con 2 µ l di 6x loading dye e riempirlo fino ad un volume finale di 12 µ l. Dispensare una scaletta del DNA, così come il campione di DNA, nei pozzetti gel ed eseguire l'elettroforesi per 1 h a 100 V.
- Analizzare il gel utilizzando una stazione di analisi dei gel ai raggi UV.
- Eseguire la trascrizione in vitro per generare mRNA dalla sequenza del DNA con un kit in vitro trascrizione contenente polimerasi T7 e sostituire i nucleotidi modificati di UTP e CTP con Ψ-UTP e metil-CTP.
- Per la trascrizione in vitro , mescolare gli ingredienti seguendo la tabella 2.
Nota: Sostituire 1,5 µ l di metil-CTP con 01:10 Cy3-CTP diluito in privo di nucleasi H2O durante la trascrizione in vitro di eGFP mRNA per raggiungere Cy3-etichettatura del mRNA. - Incubare il mix di reazione IVT per 4 h a 37 ° C.
- Aggiungere 1 µ l di dnasi I dalla polimerasi T7 kit e incubare per 15 min da 37 ° C per digerire il modello di DNA.
- Per la trascrizione in vitro , mescolare gli ingredienti seguendo la tabella 2.
- Per purificare il mRNA, utilizzare il kit di pulizia del RNA.
- Riempire il mix IVT al volume di 100 µ l con nucleasi-free H2O.
- Aggiungere 350 µ l di tampone di lisi e mescolare pipettando su e giù.
- Aggiungere 250 µ l di etanolo al 100% e mescolare ancora. Dispensare il mix in colonne di purificazione.
- Centrifuga per 15 s a 8.000 x g e scartare il filtrato.
- Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio in una colonna, centrifugare nuovamente per 15 s a 8.000 x ge Rimuovi il filtrato.
- Lavare la colonna 1 x con 500 µ l di tampone di lavaggio e centrifuga per 2 min a 8.000 x g.
- Spostare la colonna in una provetta di reazione fresco di 1,5 mL. Eluire il mRNA di 2 x di un'incubazione di 1-min di 20 µ l di nucleasi-free H2O sulla membrana colonna, seguita da una centrifugazione di 1 min a velocità massima.
- Rimuovere i gruppi fosfato da mRNA utilizzando un kit di defosforilazione. Aggiungere 4,5 µ l di tampone di fosfatasi x 10 e 1 µ l di fosfatasi mRNA e incubare per 1h a 37 ° C.
- Purificare il mRNA nuovamente, seguendo passi 2.5.1 - 2.5.7.
- Misurare la concertazione di mRNA con un fotometro.
- Utilizzare l'elettroforesi del gel per analizzare la purezza e la dimensione del mRNA. Pertanto, preparare un gel di agarosio come descritto nei passaggi 2.3.9 - 2.3.10.
- Mix 3.3 µ l di formamide, 1 µ l di formaldeide al 37%, 1 µ l di 10 x-MEN e 1,7 µ l di 6x loading dye con 200 ng di mRNA e riempirlo fino a 10 µ l con nucleasi-free H2O per ogni campione e indicatore di RNA.
- Incubare il mix per 10 min a 65 ° C per denaturazione di mRNA. Caricare i pozzetti del gel con il mRNA e RNA marker ed eseguire il gel per 1 h a 100 V.
- Analizzare il gel utilizzando una stazione di doc gel con luce UV.
3. effetti di complessazione di mRNA sintetico
- Scongelare il mRNA sintetico sul ghiaccio, vortice e centrifuga poco prima dell'apertura del tubo.
- Mix 10 µ l di mRNA sintetico (concentrazione di mRNA è 100 ng / µ l) con 1 µ l, 2,5 µ l, 5 µ l, 10 µ l o 20 µ l di sospensione di PNL (NLp concentrazione è di 3 mg/mL). Centrifugare brevemente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (TA) per la formazione di nanolipoplex.
Nota: Non mescolare pipettando. Questo può portare alla perdita di volume. Vortice poco per un'accurata miscelazione. - Aggiungere 1 mL di medium cellulare regolare per la nanolipoplexes e mescolare pipettando su e giù.
4. analisi dell'efficienza di incapsulamento di nanoliposomi
- Per eseguire gli esperimenti di incapsulamento, utilizzare il kit di quantificazione di RNA.
- Preparare la soluzione di lavoro diluendo la tintura fluorescente 1: 200 per una gamma alta e 1:2,000 per un'analisi di gamma bassa.
Nota: Scongelare il colorante fluorescente sul ghiaccio. Preparare la soluzione di lavoro direttamente prima dell'uso. - Preparare le curve standard alta gamma e gamma bassa con 1 mL di una soluzione madre di 2 µ g/mL di eGFP mRNA in nucleasi-free H2O.
Nota: Per le curve standard, utilizzare il mRNA che verrà utilizzato negli esperimenti incapsulamento. - Utilizzare la tabella 3 per la preparazione di standard di alta gamma (20 ng/mL - 1 µ g/mL).
- Per gli standard di gamma bassa, diluire il 2 µ g/mL eGFP mRNA soluzione stock 01:20 per ottenere una concentrazione finale di 100 ng/mL. Preparare uno standard di gamma bassa (1 ng/mL - 50 ng/mL) come descritto nella tabella 4.
- Unire 1 µ g di eGFP mRNA (10 µ l) e 7,5 µ g di NLps (2,5 µ l) e incubare per 20 minuti a TA.
Nota: Tenere il mRNA sul ghiaccio per evitare un peggioramento. - Aggiungere 1 mL di nucleasi-free H2O a forma nanolipoplexes e mescolare pipettando su e giù.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro di tintura fluorescente RNA da 1: 200 o 1:2,000 agli standard ed i campioni incapsulati e incubare per 5 min a RT nel buio.
- Pipettare gli standard e i campioni in duplicato in una piastra a 96 pozzetti nera e misurare la fluorescenza a 530 nm su un lettore di micropiastre (Figura 3).
5. preparazione delle cellule per la transfezione
- Piastra a 1,5 x 105 A549 cellule/pozzetto di una piastra 12-pozzetti 1 d prima della transfezione.
- Incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO2 nel medium di cellule normali (DMEM/alto glucosio con 10% siero bovino fetale [FB], 2 mM L-Glutammina, 1% di penicillina/streptomicina) per 24 h prima di transfezione.
6. transfezione delle cellule
- Lavare il preparato cellule 1x con 1 mL/pozzetto PBS (senza Ca2 +Mg2 +).
- Aggiungere 1 mL di miscela di preparati nanolipoplex, contenente 1 µ g di eGFP che mRNA incapsulato in 1-µ l, 2.5-µ l, 5-µ l, 10-µ l o NLps 20-µ l, in un pozzetto della piastra preparato con cellule A549.
- Aggiungere la sospensione di nanolipoplex per le cellule e incubare a normali condizioni per 24 h analizzare l'efficacia di transfezione, o per 24 h e 72 h per analizzare l'attuabilità delle cellule dopo la trasfezione.
Nota: Transfezione con NLps non richiede un cambiamento medio.
7. analisi dell'efficacia di transfezione delle cellule tramite citofluorimetria e microscopia a fluorescenza
- Eliminare il surnatante e lavare le cellule con 1 mL/bene PBS (senza Ca2 +/Mg2 +) per rimuovere il NLps restante.
- Preparare le celle per citometria a flusso.
- Tripsinizzano le cellule con 500 µ l/pozzetto tripsina/EDTA (0,05%) a 37 ° C per 3 min Stop il processo e inattivare la tripsina aggiungendo la stessa quantità (500 µ l/pozzetto) di regolare mezzo FBS-contenente.
- Centrifugare le cellule per 5 min a 400 x g e rimuovere con cautela il supernatante senza toccare il pellet cellulare.
- Lavare le cellule con 1 mL di PBS (senza Ca2 +Mg2 +).
- Risospendere le cellule in 300 µ l di soluzione 1x fissazione e trasferire le cellule in tubi di citometria a flusso.
- Analizzare le cellule a 488 nm in un citometro a flusso (Figura 4A).
Nota: Vortex le cellule 1 x direttamente prima della misurazione.
- Preparare le celle per microscopia di fluorescenza.
- Fissare le cellule con 1 mL/pozzetto 100% metanolo, che è stato precedentemente conservato a-20 ° C.
- Aggiungere 500 µ l/pozzetto 300 nM DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole) disciolto in PBS (senza Ca2 +/Mg2 +) e incubare per 5 minuti al buio.
- Rimuovere la soluzione DAPI e lavare le cellule ancora con 100% di metanolo conservati a-20 ° C.
- Analizzare le celle utilizzando un microscopio a fluorescenza (Figura 4B).
Nota: Utilizzare le seguenti lunghezze d'onda di eccitazione/emissione: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461 nm e Cy3 550/570 nm.
8. cellule
- Sciogliere 5 mg di MTT (bromuro di 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) in 1 mL di RPMI (senza rosso fenolo).
Nota: Il MTT disciolto deve essere ulteriormente diluito 01:10 (concentrazione finale: 0,5 mg/mL) in RPMI prima dell'uso. - Lavare le cellule trasfettate 3 x con 1 mL/pozzetto PBS (senza Ca2 +/Mg2).
Nota: I resti del mezzo cellula normale devono essere completamente rimosso. - Aggiungere 500 µ l/pozzetto di 01:10 diluito soluzione MTT alle cellule e incubare per 4 h a 37 ° C.
- Rimuovere la soluzione MTT dalle cellule dopo incubazione e aggiungere 500 µ l/pozzetto DMSO (dimetilsolfossido). Incubare nuovamente per 10 min a 37 ° C.
- Dispensare la soluzione di DMSO in terzine in una piastra a 96 pozzetti fondo chiaro e misurare l'assorbimento a 540 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
- Impostare la vitalità della cellula non trattata al 100% e calcolare l'attuabilità delle cellule degli altri gruppi rispetto alle cellule non trattate di controllo (Figura 5).
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Representative Results
Utilizzando il protocollo come descritto, NLps consistente dei lipidi DC-colesterolo e DOPE sono state preparate utilizzando il metodo di film secco (Figura 1). Durante la preparazione, la soluzione di nanoliposome Mostra diverse fasi di torbidità (Figura 2).
L'efficacia di incapsulamento del NLps può quindi essere analizzato dopo l'incapsulamento di 1 µ g di mRNA codifica eGFP analizzando la quantità libera di mRNA, che non è stato incapsulato, utilizzando il kit di quantificazione di RNA (Figura 3).
Dopo l'incapsulamento di eGFP che mRNA in diverse quantità di NLps, il nanolipoplexes formato possa essere incubati con le cellule possono essere analizzati in vitro e la percentuale di cellule che esprimono eGFP usando posttransfection di flusso cytometry 24h (Figura 4A) . Anche 1 µ l della soluzione nanoliposome è sufficiente per raggiungere un'alta transfezione delle cellule in vitro. Quando le cellule transfected con NLps contenente eGFP Cy3-etichettati mRNA, la presenza di eGFP mRNA nel citoplasma (fluorescenza rossa), come pure la proteina eGFP già prodotta (fluorescenza verde) possa essere visualizzati (Figura 4B).
Poiché la transfezione delle celle utilizzando nanolipoplexes può avere effetti negativi sulle cellule, la vitalità delle cellule è stata testata 24 h (Figura 5A) e posttransfection di 72 h (figura 5B). Nessun effetto sulla vitalità cellulare potrebbe essere rilevato quando le cellule sono state trattate con 2,5 o 5 µ l di NLps o nanolipoplexes, rispettivamente.
Figura 1: Panoramica schematica del processo di fabbricazione del cationici nanoliposomi. In primo luogo, i lipidi disciolti DC-colesterolo e DOPE dovrebbero essere mescolati insieme in un fiasco di vetro. In secondo luogo, il liquido di cloroformio visibile dovrebbe essere evaporato sotto argon o flusso di gas di azoto e gli avanzi di cloroformio dovrebbero poter evaporare durante la notte nel vuoto. In terzo luogo, il film lipidico formata sul fondo del matraccio di vetro deve essere reidratato con nucleasi-free H2O, seguita nel Vortex per formare liposomi multilamellari. Attraverso la sonicazione e l'estrusione della soluzione liposoma, il ready-to-use unilamellari NLps sono prodotte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: la soluzione di nanoliposome in varie fasi durante la produzione. (A), questa figura mostra la soluzione liposoma direttamente dopo la reidratazione del film lipidico e Vortex per 15 min, nonché (B) dopo 1 h in un sonicazione bagno (C) seguita da 25 cicli di estrusione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: l'efficacia di incapsulamento dei nanoliposomi. Questo pannello mostra la quantificazione di eGFP gratis mRNA dopo incapsulamento in NLps. I risultati sono presentati come mezzi ± SEM (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: l'efficacia di transfezione della nanolipoplexes. (A), questo pannello mostra la determinazione del miglior rapporto mRNA/nanoliposome per la transfezione con diverse quantità di NLps per incapsulare 1 µ g di posttransfection di eGFP mRNA 24h. (B) questo pannello mostra il rilevamento del mRNA sintetico Cy3-labeled incapsulato in 2,5 µ l NLps e l'espressione di eGFP nel posttransfection di 24 h di celle (la barra della scala = 50 µm). I risultati sono presentati come mezzi ± SEM (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: vitalità cellulare dopo la trasfezione con nanoliposomi e incapsulato mRNA. Questo pannello mostra la misurazione di attuabilità delle cellule usando un'analisi di MTT (A) 24 h e (B) 72 h posttransfection. I risultati sono presentati come mezzi ± SEM (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Passo | Temperatura in ° C | Durata |
| 1 | 95 | 5 min |
| 2 | 94 | 15 s |
| 3 | 55 | 1 min |
| 4 | 72 | 1 min |
| 5 | Vai alla 2 30 x | |
| 6 | 72 | 10 min |
| 7 | 4 | tenere premuto |
Tabella 1: Protocollo per l'amplificazione del DNA di ciclo di PCR.
| Concentrazione | Importo | |
| ATP | 7,5 mM | 4 Μ l |
| GTP | 1.875 mM | 1 Μ l |
| 5'-Methylcytidin | 7,5 mM | 3 Μ l |
| Ψ | 7,5 mM | 3 Μ l |
| ARCA | 2,5 mM | 10 Μ l |
| Modello di DNA | 1,5 µ g | |
| Mix di buffer | 1 x | 4 Μ l |
| Mix di enzima T7 | 4ΜL | |
| RNasi-inibitore | 1 Μ l | |
| Acqua priva di nucleasi | riempire fino a 40 µ l | |
Tabella 2: Mix per la in vitro trascrizione del DNA in mRNA.
| Volume di nucleasi-free H2O (µ l) | Volume di soluzione di mRNA di riserva della alto-gamma di eGFP (µ l) | Volume di tintura fluorescente (µ l) di 1: 200 | Concentrazione finale (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 1000 |
| 50 | 50 | 100 | 500 |
| 90 | 10 | 100 | 100 |
| 98 | 2 | 100 | 20 |
| 100 | 0 | 100 | in bianco |
Tabella 3: Protocollo per una curva standard di alta gamma.
| Volume di nucleasi-free H2O (µ l) | Volume di soluzione di mRNA di riserva della gamma bassa di eGFP (µ l) | Volume di 1: 2000 colorante fluorescente (µ l) | Concentrazione finale (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 50 |
| 50 | 50 | 100 | 25 |
| 90 | 10 | 100 | 5 |
| 98 | 2 | 100 | 1 |
| 100 | 0 | 100 | in bianco |
Tabella 4: Protocollo per una curva standard di gamma bassa.
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Discussion
Il protocollo presentato descrive la generazione di NLps con efficacia elevata incapsulamento per mRNA sinteticamente modificate, così come la transfezione affidabile di cellule in vitro. Il NLps, inoltre, garantiscono il rilascio di mRNA, che a sua volta, si traduce in una proteina funzionale all'interno delle cellule. Inoltre, le transfezioni utilizzando NLps possono essere eseguite a mezzo cellulare regolare, conseguente alta cella viabilità durante transfezione e durare fino a tre giorni dopo la trasfezione.
Per utilizzare mRNA come un terapeutico, auto-assemblanti sistema per la sua consegna è preferito. I più comuni reagenti di transfezione includono lipidi cationici, compresi i liposomi. Liposomi sono caricati positivamente, negativamente gli acidi nucleici può essere incapsulati in loro, consentendo in tal modo la repulsione elettrostatica delle membrane cellulari a essere superare35. I lipidi cationici DC-colesterolo è già stato descritto negli studi più iniziali come un veicolo stabile e biocompatibile36. L'aggiunta di lipidi neutri DOPE conduce ad un' efficacia di transfezione avanzata37. Considerando i vantaggi delineati di cui sopra, questi lipidi sono stati scelti per la preparazione di NLps. Inoltre, gli studi precedenti hanno dimostrato che l'uso di questi due lipidi è preferibile rispetto ad altri a causa di un tasso di aumento trasfezione cellulare con carica negativa acidi nucleici38.
Per la generazione di successo di NLps e nanolipoplexes, è fondamentale prestare particolare attenzione ad alcuni dei passaggi. La procedura di generazione nanoliposome dovrebbe essere eseguita sotto O2-senza condizioni. La presenza di O2 durante la generazione di NLp può portare alla degradazione dei fosfolipidi e ridotta riproducibilità39. Inoltre, nonostante le modifiche, mRNA è molto sensibile per quanto riguarda la degradazione attraverso nucleasi. Quindi, per la reidratazione del film lipidico, l'uso di RNAsi-libera H2O è fortemente raccomandato per evitare la degradazione di mRNA durante la complessazione. Inoltre, RNAsi-libere condizioni devono essere garantite per lo stoccaggio di nanolipoplexes.
Inoltre, NLps può formare aggregati nel tempo a causa del sistema termodinamico instabile. Temperatura di stoccaggio e carica superficiale dei liposomi40includono i parametri di influenza. Aggregazione di NLp può provocare la destabilizzazione della membrana del liposoma e il rischio di indesiderabili mRNA rilasciare41, conducendo alla degradazione di mRNA e l'efficacia di transfezione poveri nello spazio extracellulare. Tuttavia, come precedentemente indicato, nanolipoplexes può essere conservati a 4 ° C per fino a sei mesi senza aggregazione o perdita di efficacia di transfezione35.
Utilizzando liposomi come un sistema di trasporto di droga, due dei principali problemi di consegna della droga può essere risolto. Liposomi proteggono la droga incapsulata dalla degradazione e sono in grado di passivamente i tessuti bersaglio che hanno un endotelio discontinuo, ad esempio il fegato o midollo osseo16. Per la consegna di acidi nucleici terapeutici, parametri quali la dimensione delle particelle e incapsulamento capacità sono fondamentali per l'assorbimento cellulare e valutazione di veicoli liposomiale. In particolare, la dimensione dei liposomi in scala nanometrica permette un'interazione con la membrana cellulare42 ed è, quindi, importante per l'uso in vivo più tardi. In primo luogo, i liposomi dovrebbero essere abbastanza piccoli per evitare l'autorizzazione mediante il sistema renale ed epatica43. In secondo luogo, la dimensione del liposoma dovrebbe contribuire a superare la barriera dei vasi sanguigni per indirizzare le cellule dell'organo desiderato. È stato riferito che i liposomi nell'intervallo di dimensioni di 100-300 nm sono riusciti a efficientemente transfect epatociti44; Tuttavia, grandi liposomi (ad es., 400 nm) non erano in grado di superare la barriera endoteliale45.
Anche se il metodo descritto è stato stabilito per la consegna di mRNA, può inoltre essere implementata per altre terapie di acido nucleico, come microRNA. In un recente studio, abbiamo dimostrato che microRNA 126 può essere mirata in modo selettivo e, pertanto, lo sviluppo di aneurismi dell'aorta addominale potrebbe essere efficacemente hanno impedito46. Come terapeutica di DNA/RNA può causare effetti indesiderati, quali l'attivazione piastrinica, quando entrano in contatto diretto con le cellule, imballaggio all'interno di liposomi possa evitare questo, rendendo ulteriormente vantaggioso47. Di conseguenza, il metodo presentato qui è estremamente versatile e può essere utilizzato per la progettazione di consegna della droga per molte malattie. Il protocollo stabilito non solo permette la generazione veloce e conveniente di un vettore di mRNA efficiente con una dimensione definita ma offre anche la possibilità di personalizzare la formulazione lipidica secondo le esigenze di una particolare applicazione: (1) la dimensione della liposomi possono essere facilmente modificati cambiando i filtri; (2) la superficie dei liposomi caricati positivamente potrebbe essere modificata utilizzando, ad esempio, polietilene glicole, per aumentare il gioco di sangue per stabilità e ritardo durante in vivo applicazione48. L'associazione di anticorpi specifici ai liposomi permette la somministrazione mirata del farmaco incapsulato49. Con ulteriore esame e una visione più dettagliata delle proprietà fisiche, il protocollo potrebbe essere ancora migliorato.
Per la generazione di liposomi, sono disponibili tre metodi comuni: il film secco, l'iniezione di etanolo e l'evaporazione di inverso-fase. Nella Yang et al. Studio, queste tre tecniche di produzione sono stati confrontati35. Si è constatato che i liposomi con una dimensione definita e un'equa distribuzione della soluzione possono essere generati utilizzando il metodo di film secco. Inoltre, la procedura di film secco condotto questo studio ha portato alla produzione di NLps con una dimensione definita di 200 nm, una distribuzione omogenea e una capacità di alta incapsulamento.
Da un lato, la carica positiva dei liposomi conduce ad una capacità aumentata di incapsulamento e migliore delle cellule superficiali fusione50,51,52, ma d'altra parte, può destabilizzare la membrana cellulare e attivare vie di attivazione del sistema immunitario diverso e cellule morte27,53. Tuttavia, le proprietà di apoptotic di lipidi cationici possono essere minimizzate usando il supporto del lipido DOPE54,55. Nello studio di Zhang et al., è stato trovato che un rapporto di 1:2 di DC-colesterolo e DOPE durante la generazione del liposoma conduce per la transfezione cellulare più efficiente utilizzando acidi nucleici38. Nel metodo implementato nello studio presente, il rapporto del lipido di 1:2 DC-colesterolo e DOPE è stato usato nella sospensione del lipido misto durante la preparazione del film lipidico e liposomi preparati hanno portato ad efficacia di transfezione alta e, contemporaneamente, alta cella vitalità. Risultati simili sono stati trovati anche da altri ricercatori, come Ciani56 e Farhood37.
Nel complesso, i liposomi sono stati utilizzati per anni negli studi clinici, mostrando grande biocompatibilità e bassa tossicità in vivo. In combinazione con mRNA, NLps potrebbe essere utilizzato per la consegna efficiente di mRNA per organi o cellule in vitro e in vivo, per indurre la sintesi de novo di una proteina desiderata. Per quanto riguarda le applicazioni terapeutiche, nanolipoplexes potrebbe essere utilizzato, ad esempio, nelle patch di guarigione della ferita per transdermico mRNA consegna57 a attivano la rigenerazione cellulare, o come spray per la nebulizzazione del mRNA58 per la cura del polmone malattie59,60 ad esempio fibrosi cistica.
Il protocollo presentato garantisce un modo facile e accessibile per la generazione di NLps utilizzando il metodo di film secco, che può quindi essere utilizzato per l'incapsulamento efficiente in vitro di trascritto in mRNA e la cassaforte transfezione delle cellule.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Nessuno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
| Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
| Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
| RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
| Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |
References
- Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
- Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
- Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
- Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
- Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8 (2014).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
- Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
- Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
- Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
- Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
- Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
- Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
- Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
- Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
- Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
- Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
- Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
- Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
- Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497 (2011).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
- Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943 (2014).
- Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
- Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
- Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
- Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
- Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
- Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
- Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
- Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H.
- Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
- Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
- Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
- Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
- Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
- Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
- Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
- Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
- Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
- Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
- Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
- Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
- Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
- Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504 (2015).
- Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
