Summary
Здесь мы описываем протокол для поколения катионного nanoliposomes, который основан на методе сухой фильм и может использоваться для безопасного и эффективного предоставления в vitro транскрипции РНК.
Abstract
Разработка матричная РНК (мРНК)-на основе терапии для лечения различных заболеваний становится все более важным из-за положительные свойства в vitro трансляции мРНК (IVT). С помощью IVT мРНК de novo синтез желаемого белка может быть вызван без изменения физиологического состояния целевой ячейки. Кроме того Биосинтез белка может точно управляться из-за переходного эффекта ИВТ мРНК.
Для эффективного transfection клетки nanoliposomes (NLps) может представлять средство безопасной и эффективной доставки для терапевтических мРНК. Это исследование описывает протокол для создания безопасной и эффективной катионного NLps состоящий из DC-холестерина и 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ДОПИНГ) как вектор доставки для ИВТ мРНК. NLps, имеющие определенный размер, однородное распределение и высокая комплексообразованию потенциала и могут быть изготовлены с использованием метода сухой фильм. Кроме того, мы представляем различные тест-систем для анализа их комплексообразования и трансфекции узкоспециализированного с использованием синтетических расширение Зеленый флуоресцентный белок (eGFP) мРНК, а также их влияние на жизнеспособность клеток. В целом представленные протокол обеспечивает эффективный и безопасный подход мРНК комплексообразование, который может заранее и улучшить администрации терапевтических мРНК.
Introduction
Использование модифицированных мРНК для терапевтического применения показывает большой потенциал в последние пару лет. В моногенетическими, сердечно-сосудистой и воспалительных заболеваний, а также в разработке вакцин мРНК является перспективным терапевтический агент1.
Белка заместительной терапии с мРНК предлагает несколько преимуществ по сравнению с классической генная терапия, которая основана на ДНК трансфекции в целевой ячейки2. МРНК функция инициирует непосредственно в цитозоль. Хотя плазмидной ДНК (pDNA), конструкция двунитевая, циркуляр ДНК, содержащие промоутер региона и последовательности гена кодирования терапевтических белков-3, также акты в цитозоле, оно может только быть включены в клетки, которые проходят митоз в то время transfection. Это уменьшает количество transfected клеток в тканях1,4. В частности transfection тканей с слабой митоз активности, таких как сердечные клетки, является трудно5. В отличие от pDNA transfection и перевод мРНК происходят в митотическая и не митотическая клеток в ткани1,6. Вирусная интеграции ДНК в хост геномов может прийти с мутагенных эффектов или иммунных реакций7,8, но после transfection клетки с мРНК белка кодирования, de novo синтез белка желаемого начинает самостоятельно9,10. Кроме того синтез белков может быть скорректирована именно к потребности пациента путем индивидуальных доз, без вмешательства с геном и рискуя мутагенных эффектов11. Иммунной активации потенциал искусственно созданного мРНК может быть значительно снижен с помощью псевдо-уридина и 5'-methylcytidine вместо уридина и Цитидин12. Псевдо-уридина модифицированных мРНК также было показано повышение биологической стабильности и значительно выше трансляционная потенциала13.
Чтобы иметь возможность воспользоваться перспективных свойств на основе мРНК терапии в клинических приложений, важно создать подходящее транспортное средство для перевозки мРНК в клетку. Этот автомобиль должен нести нетоксичные свойства в пробирке и в естественных условиях, защитить против нуклеиназы деградации мРНК и обеспечивают достаточно клеточного поглощения для длительного доступности и перевод мРНК14.
Среди всех типов возможных перевозчика в естественных условиях доставки наркотиков, например, углеродных нанотрубок, квантовые точки и липосомы, последние были изучены наиболее15,16. Липосомы являются везикулы, состоящий из липидного бислоя10. Они амфифильных с гидрофобных и гидрофильных секции, и через самостоятельной расположение этих молекул, сферические двойной слой является форматом17. Внутри липосомы терапевтических агентов или наркотиков можно инкапсулировать и, таким образом, защищен от18энзимной деградации. Липосомы, содержащие N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium хлорид (DOTMA)19, [1,2-бис (oleoyloxy) -3-пропан (trimethylammonio)] (DOTAP)20и21dioctadecylamidoglycylspermine (собаки), или DC-холестерин22, хорошо характеризуется и часто используется для сотовых трансфекции с ДНК или РНК.
Катионный липосомы составляют положительно заряженных липидов и незаряженных фосфолипидного23. Трансфекция через Катионный липосомы является одним из наиболее распространенных методов для перевозки нуклеиновых кислот в клетки24,25. Катионоактивный липид частицы образуют комплексы с отрицательно заряженных фосфатными группами в основу нуклеиновых кислот молекул26. Эти так называемые lipoplexes придают поверхности клеточной мембраны и войти в камеру через эндоцитоз или эндоцитоза как механизмы27.
В 1989 году Мэлоун и др. успешно описал катионоактивный липид опосредованной мРНК трансфекции28. Однако используя смесь DOTMA и 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ДОПИНГ), Группа обнаружила, что DOTMA проявляется цитотоксических эффектов28. Кроме того Зохра et al. показал, что DOTAP (1,2-dioleoyloxy-3-триметиламмония пропан хлорид) может использоваться как реагент мРНК в трансфекции29. Однако для эффективного transfection клетки, DOTAP должен использоваться в сочетании с другими реагенты, такие как фибронектин29 или30ДОПИНГ. Пока DOTMA был первым Катионный липидов на рынке, используемых для доставки генов31. Другие липиды используются как терапевтические перевозчиков или тестируются на разных стадиях клинических испытаний, (например, EndoTAG-I, содержащее DOTAP как перевозчик липидов), в настоящее время изучается в фазы II клинических судебного32.
Эта работа описывает протокол для поколения NLps, содержащих DC-холестерин и ДОПИНГ. Этот метод легко выполнить и позволяет генерировать NLps разных размеров. Общая цель НЛП поколения, с помощью метода сухой фильм является создание липосом для комплексообразованию мРНК, таким образом позволяя transfection клеток эффективным и биосовместимых в vitro14,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. поколение катионного Nanoliposomes (рис. 1)
- Растворите липиды DC-холестерина (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] холестерина гидрохлорид) и ДОПИНГ (dioleoyl фосфатидилэтаноламина), поставляется в виде порошка, в хлороформе для достижения конечной концентрации 25 мг/мл.
Примечание: Храните растворенного липидов при-20 ° C. - Работа с 25 мг/мл Стоковый раствор обоих липидов. Смесь 40 мкл растворенного DC-холестерина и 80 мкл растворенного ДОПИНГ в стеклянную колбу.
Примечание: Сумма всего липидов — 3 мг. Чтобы избежать быстрого испарения хлороформа, место липидов на льду во время закупорить. - Испаряться метилхлороформа за 15 мин под поток газа аргона. Впоследствии заполнить Эксикатор с силикагель, место открытые стеклянную колбу внутри и применить вакуум ночь чтобы убедиться, что оставшиеся хлороформ испаряется, и внутри стеклянной колбе образуется пленка липидов.
Примечание: Работать быстро и избежать ненужных O2 контакта. - Увлажняет сформированных липидов фильм с 1 мл нуклеиназы свободной воды и вихревой подвеска для 15 мин (рис. 2A). После этого место подвеска в sonication ванну для 1 h (рис. 2B).
Примечание: Подвеска будет немного облачно. - Собрать мини-экструдер согласно инструкции производителя, заполните шприц с подвеской липидов и место заполненных шприц и пустой шприц на обеих сторонах экструдера. Нажмите липидов подвеска через мембрану из одного шприца в другой, 20 x – 25 x, чтобы выдавить подвеска (рис. 2 c).
Примечание: Размер NLps определяется размером поры мембраны используется. - Магазин NLps в стеклянную колбу на 4 ° C до дальнейшего использования.
Примечание: После длительного хранения времени, NLps должны быть помещены в sonication ванну снова за 15 мин, 35 кГц для обхода сложных формирования.
2. в Vitro транскрипция синтетических мРНК
- Подготовьте eGFP кодирование мРНК после протокол опубликован ранее34.
- Усилить eGFP последовательности от плазмида с 0,7 мкм вперед (5'-TTG GAC CCT CGT ACA ГАА GCT AAT АКГ-3') и обратного (5'-T120 CTT CTT акт CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') грунты и полимеразы комплект с ПЦР.
- Смешайте 20 мкл коммерческих буферного раствора, который изменяет поведение плавления ДНК (Таблица материалов), а также 20 мкл 5 x смеси из комплекта полимеразы. 7 мкл каждого праймера (вперед и назад).
- Добавить 25 нг eGFP плазмида смесь и 2 мкл полимеразы из комплекта полимеразы.
Примечание: Держите полимеразы на льду перед закупорить его в решение. - Добавить бесплатно нуклеиназы H2O в смесь, до объема 100 мкл.
- Запустите циклов PCR в Термоциклер после протокола в таблице 1.
- Очищайте eGFP кодирования последовательности ДНК в комплект очистки ПЦР.
- Таким образом смешать раствор ПЦР с 500 мкл буфера привязки из комплекта и использовать его для заполнения столбцов очистки.
- Центрифуга для столбцов с максимальной скоростью за 1 мин и отбросить фильтрата.
- 750 мкл буфера мытья я к столбцу, центрифуги снова на максимальной скорости за 1 мин и отбросить фильтрата.
- Повторите шаг 1 x, чтобы удалить буфер из столбца фильтра центрифуги.
- Столбце передать свежие 1,5 мл.
- 20 мкл нуклеиназы свободный H2O в столбце инкубировать 1 мин и центрифуги за 1 мин на максимальной скорости. Повторите этот шаг.
- Измерение концентрации ДНК с фотометром и хранить его при-20 ° C.
- Анализ ДНК качества с помощью электрофореза геля. Добавить 0,5 г агарозы в буфер Tris-Борат-ЭДТА (КЭ) и тепло его в микроволновую печь на сильном огне до тех пор, пока полностью не растворится агарозы.
- 5 мкл гель окрашивание раствора жидкого агарозы, заполните решение в камеру гель и ждать, пока Гель полимеризуется.
- Микс 200 ng ДНК с 2 мкл 6 x загрузки красителя и залейте его до конца объем 12 мкл. Пипетка лестница ДНК, а также образец ДНК, в гель скважины и запустить электрофорез 1 h 100 V.
- Анализ с помощью анализа геля станции под УФ светом геля.
- Запустите в vitro транскрипция для создания мРНК из последовательности ДНК в vitro транскрипция комплект содержащие T7-полимеразы и заменить измененный нуклеотидов UTP и CTP с Ψ-UTP и метил CTP.
- Для в vitro транскрипция Смешайте ингредиенты, после таблицы 2.
Примечание: Заменить 1,5 мкл метил CTP с 1:10 Cy3-CTP разводят в свободной от нуклеиназы H2O ходе в vitro транскрипция eGFP мРНК для достижения обозначать Cy3 мРНК. - Инкубировать IVT реакция смеси для 4 ч при 37 ° C.
- 1 мкл DNase I от полимеразы T7 Кит и Инкубируйте 15 минут при 37 ° C переваривать шаблон ДНК.
- Для в vitro транскрипция Смешайте ингредиенты, после таблицы 2.
- Для того чтобы очистить мРНК, используйте комплект очистки РНК.
- Заполните вверх IVT смесь тома µL 100 с свободный нуклеиназы H2O.
- Мкл 350 литического буфера и микс, закупорить вверх и вниз.
- 250 мкл, 100% этанола и снова перемешать. Пипетка смеси в столбцы очистки.
- Центрифуги для 15 s на 8000 x g и удаления фильтрата.
- 500 мкл Отмывающий буфер в столбец, центрифуги снова для 15 s на 8000 x gи удаление фильтрата.
- Промойте колонку 1 x с 500 мкл буфера мытья и центрифуги для 2 мин на 8000 x g.
- Перемещение столбца в свежий реакции 1,5 мл пробирку. Элюировать мРНК 2 x по инкубации 1-мин 20 мкл нуклеиназы свободный H2O на мембране столбца, а затем центрифугированием 1-мин на максимальной скорости.
- Удалите из мРНК, используя набор дефосфорилирование фосфатными группами. Добавьте 4.5 мкл 10 x буфер фосфатазы и 1 мкл фосфатазы мРНК и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
- Очищайте мРНК снова, следующие шаги 2.5.1 - 2.5.7.
- Измерьте консертасьон мРНК фотометра.
- Для анализа чистоту и размер мРНК используйте гель-электрофорез. Таким образом подготовьте геля агарозы, как описано в шагах 2.3.9 - 2.3.10.
- Mix 3.3 мкл формамид, 1 мкл 37% формальдегида, 1 мкл 10 x мужчин и 1.7 мкл 6 x загрузки краска с 200 нг мРНК и заполнить его до 10 мкл с свободный нуклеиназы H2O для каждого образца и РНК маркер.
- Инкубируйте смесь для 10 мин при 65 ° C для денатурации мРНК. Загрузить скважин гель с мРНК и РНК маркер и Побегите гель для 1 h 100 V.
- Анализ с помощью геля док станция с ультрафиолетовым светом геля.
3. комплексообразованию синтетических мРНК
- Оттепель синтетических мРНК на льду, вихрь и центрифуги незадолго до открытия трубку.
- Смесь 10 мкл синтетических мРНК (концентрация mRNA-100 нг/мкл) с 1 мкл, 2.5 мкл, 5 мкл, 10 мкл и 20 мкл суспензии НЛП (НЛП концентрация составляет 3 мг/мл). Центрифуга для кратко и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре (RT) для формирования nanolipoplex.
Примечание: Не смешивайте, закупорить. Это может привести к потере объема. Вихрь вскоре для тщательного перемешивания. - Добавить 1 мл среды регулярных клеток nanolipoplexes и смешивать их, закупорить вверх и вниз.
4. анализ эффективности инкапсуляции Nanoliposomes
- Чтобы выполнить инкапсуляцию эксперименты, используйте комплект количественного определения РНК.
- Приготовьте рабочий раствор путем разбавления 1: 200 Люминесцентную краску для высокого диапазона и стоматологов для низкий диапазон assay.
Примечание: Оттепель Люминесцентную краску на льду. Для приготовления рабочего раствора непосредственно перед использованием. - Подготовьте высокий диапазон и диапазон низких стандартных кривых с помощью 1 мл штока 2 мкг/мл раствора eGFP мРНК в свободной от нуклеиназы H2O.
Примечание: Для стандартных кривых, используйте мРНК, который будет использоваться в экспериментах инкапсуляции. - Использование таблицы 3 для подготовки стандарта высокого диапазона (20 нг/мл - 1 мкг/мл).
- Для стандарта низкой дальности развести 2 мкг/мл eGFP мРНК Стоковый раствор 1:20 для достижения конечной концентрации 100 нг/мл. Подготовьте Стандартный диапазон низких (1 нг/мл - 50 нг/мл), как описано в таблице 4.
- Объединить 1 мкг eGFP мРНК (10 мкл) и 7.5 мкг NLps (2,5 мкл) и проинкубируйте втечение 20 мин на RT.
Примечание: Держите чтобы избежать деградации мРНК на льду. - Добавьте 1 mL нуклеиназы свободный H2O формы nanolipoplexes и микс от закупорить вверх и вниз.
- Добавьте 1 мл раствора 1: 200 или стоматологов РНК Люминесцентную краску рабочей инкапсулированные образцов и стандартов и проинкубируйте 5 мин на RT в темноте.
- Пипетка стандарты и образцы в дубликаты в черный 96-луночных плиту и измерения флуоресценции в 530 Нм на Считыватель микропланшетов (рис. 3).
5. Подготовка Transfection клетки
- Плита 1,5 x 105 A549 клеток/колодец 12-ну плиты 1 d до transfection.
- Инкубируйте 24 h перед transfection клетки при 37 ° C и 5% CO2 в среде обычных клеток (DMEM/высокая глюкозы с 10% плода бычьим сывороточным [FBS], 2 мм L-глютамином, пенициллин/стрептомицина 1%).
6. transfection клетки
- Мыть приготовленные ячейками 1 x 1 мл в колодец PBS (без Ca2 +/мг2 +).
- Добавьте 1 mL подготовленных nanolipoplex смеси, содержащие 1 мкг eGFP мРНК инкапсулируются в 1 мкл, 2,5 мкл, 5 мкл, 10-мкл и 20 мкл NLps, один из хорошо подготовленных пластины с A549 клетками.
- Добавить nanolipoplex подвеска в клетки и Инкубируйте на обычных условиях за 24 ч до анализировать эффективность трансфекции, или для 24 h и 72 h для анализа жизнеспособности клеток после transfection.
Примечание: Transfection с NLps не требуют среднего изменения.
7. анализ эффективности Transfection клетки, с помощью проточной цитометрии и микроскопии флуоресцирования
- Удалить супернатант и вымыть клетки с 1 мл/ну PBS (без Ca2 +/Mg2 +), чтобы удалить оставшиеся NLps.
- Подготовка клетки для проточной цитометрии.
- Trypsinize клетки с 500 мкл/хорошо трипсина/ЭДТА (0,05%) при 37 ° C на 3 мин остановка процесса и инактивировать трипсина, добавив такое же количество регулярных FBS-содержащих среднего (500 мкл/хорошо).
- Центрифуга клетки для 5 мин на 400 x g и тщательно удалить супернатант без касатьться Пелле ячейки.
- Вымыть клетки с 1 мл раствора PBS (без Ca2 +/мг2 +).
- Ресуспензируйте клетки в 300 мкл раствора 1 x фиксации и передачи клетки в цитометрии расходомерных трубок.
- Анализировать клетки на 488 нм в проточный цитометр (рис. 4A).
Примечание: Vortex клетки 1 x непосредственно перед измерением.
- Подготовка клетки для микроскопии флуоресцирования.
- Исправить клетки с 1 мл/хорошо 100% метанола, который ранее хранился при температуре-20 ° C.
- Добавьте 500 мкл/ну 300 Нм DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) растворяют в PBS (без Ca2 +/Mg2 +) и инкубировать в течение 5 мин в темноте.
- Удаление решения DAPI и снова вымыть клетки с 100% метанола, хранятся при температуре-20 ° C.
- Анализируйте клетки под микроскопом флуоресцирования (рис. 4B).
Примечание: Используйте следующие волны возбуждения/выбросов: eGFP 488/509 Нм, DAPI 358/461 Нм и Cy3 550/570 Нм.
8. ячейки жизнеспособности Assay
- 5 мг MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium бромид) растворяют в 1 мл RPMI (без фенола красного).
Примечание: Растворенного МТТ должны быть далее разбавленных 1:10 (конечная концентрация: 0.5 мг/мл) в RPMI перед использованием. - Мыть transfected клеток 3 x с 1 мл/хорошо PBS (без Ca2 +/Mg2).
Примечание: Остатки регулярные клетки средних следует быть полностью удалены. - Добавьте 500 мкл/также 1:10 разбавленный МТТ решение к клеткам и Инкубируйте 4 ч при 37 ° C.
- Удаление решения МТТ из клеток после инкубации и добавьте 500 мкл/хорошо ДМСО (диметилсульфоксид). Снова инкубировать в течение 10 минут при 37 ° C.
- Пипетка решение ДМСО в триплеты в 96-луночных снимите днище и измерить адсорбции на 540 Нм, используя Считыватель микропланшетов.
- Жизнеспособность необработанных ячейки на 100% и рассчитать жизнеспособность клеток других групп по сравнению с необработанными управления клеток (рис. 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя протокол как описано, NLps, состоящий из липидов, DC-холестерин и ДОПИНГ были подготовлены с использованием метода сухой фильм (рис. 1). В ходе подготовки nanoliposome решение показывает различные этапы в мутность (рис. 2).
Инкапсуляция эффективность NLps затем могут быть проанализированы после инкапсуляции 1 мкг eGFP кодирования мРНК, анализируя бесплатно количество мРНК, который был не инкапсулированные, используя комплект для количественного определения РНК (рис. 3).
После инкапсуляции eGFP, которую мРНК в различных количествах NLps, сформированных nanolipoplexes можно инкубировали с клеток in vitro и процент eGFP выражая клеток могут быть проанализированы с помощью потока цитометрии 24 h posttransfection (рис. 4A) . Даже 1 мкл раствора nanoliposome достаточно для достижения высокой transfection клетки в пробирке. Когда клетки являются transfected с NLps, содержащих Cy3-помечены eGFP мРНК, присутствие eGFP, мРНК в цитоплазме (красной флуоресценцией), а также уже произведенных eGFP белка (зеленая Флуоресценция) могут быть визуализированы (Рисунок 4B).
Так как transfection клеток с использованием nanolipoplexes может иметь неблагоприятное воздействие на клетки, жизнеспособность клеток был протестирован 24 h (Рисунок 5A) и posttransfection 72 h (Рисунок 5B). Не влияет на жизнеспособность клеток могут быть обнаружены, когда клетки обрабатывали 2,5 или 5 мкл NLps или nanolipoplexes, соответственно.
Рисунок 1: Схематичный обзор процесса изготовления катионного nanoliposomes. Во-первых растворенного липиды DC-холестерин и ДОПИНГ должны быть смешаны вместе в стеклянную колбу. Во-вторых видимые хлороформ жидкость следует испаряется под аргоном или азота газового потока и хлороформе остатки должно быть позволено на ночь испарится в вакууме. В-третьих, следует Регидратированные сформированных липидов фильма в нижней части стеклянную колбу с свободный нуклеиназы H2O, следуют vortexing, сформировать multilamellar липосом. Через sonication и выдавливания раствора липосом производятся готовые к использованию однослойных NLps. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: раствор nanoliposome на различных этапах в процессе производства. (A) эта цифра показывает липосом решение непосредственно после регидратации липидной пленки и vortexing за 15 мин, а также (.B) после 1 ч в sonication баня (C) следуют 25 циклов экструзии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: эффективность инкапсуляции nanoliposomes. Эта панель показывает количественное определение свободного eGFP мРНК после инкапсуляции в NLps. Результаты представлены как средства ± SEM (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: эффективность Transfection nanolipoplexes. (A) Эта группа показывает определение наилучшего соотношения мРНК/nanoliposome для transfection, используя различное количество NLps для инкапсуляции 1 мкг eGFP мРНК 24 h posttransfection. (B) Эта группа показывает обнаружения Cy3-меченых синтетических мРНК, инкапсулированные в 2,5 мкл NLps и eGFP выражение в posttransfection 24 h клетки (шкалы бар = 50 мкм). Результаты представлены как средства ± SEM (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: сотовый жизнеспособности после transfection nanoliposomes и инкапсулированные мРНК. Эта панель показывает измерения жизнеспособности клеток с помощью MTT пробирного (A) 24 h и (B) 72 h posttransfection. Результаты представлены как средства ± SEM (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Шаг | Температура в ° C | Продолжительность |
| 1 | 95 | 5 мин |
| 2 | 94 | 15 s |
| 3 | 55 | 1 мин |
| 4 | 72 | 1 мин |
| 5 | Перейти к 2 30 x | |
| 6 | 72 | 10 мин |
| 7 | 4 | удерживайте |
Таблица 1: ПЦР цикла протокол для амплификации ДНК.
| Концентрация | Сумма | |
| ATP | 7,5 мм | 4 МКЛ |
| GTP | 1875 мм | 1 МКЛ |
| 5'-Methylcytidin | 7,5 мм | 3 МКЛ |
| Ψ | 7,5 мм | 3 МКЛ |
| ARCA | 2,5 мм | 10 МКЛ |
| Шаблон ДНК | 1,5 мкг | |
| Буфер микс | 1 x | 4 МКЛ |
| T7 фермента микс | 4ΜL | |
| АБС битор РНКазы | 1 МКЛ | |
| Нуклеаза свободной воды | заполнить до 40 мкл | |
Таблица 2: Смесь для в пробирке транскрипция ДНК к мРНК.
| Объем свободной от нуклеиназы H2O (мкл) | Объем раствора eGFP мРНК высокого диапазона штока (мкл) | Объем 1: 200 Люминесцентную краску (мкл) | Конечная концентрация (нг/мл) |
| 0 | 100 | 100 | 1000 |
| 50 | 50 | 100 | 500 |
| 90 | 10 | 100 | 100 |
| 98 | 2 | 100 | 20 |
| 100 | 0 | 100 | пустой |
Таблица 3: Протокол для стандартной кривой высокого диапазона.
| Объем свободной от нуклеиназы H2O (мкл) | Объем раствора eGFP мРНК диапазон низких запасов (мкл) | Объем 1: 2000 Люминесцентную краску (мкл) | Конечная концентрация (нг/мл) |
| 0 | 100 | 100 | 50 |
| 50 | 50 | 100 | 25 |
| 90 | 10 | 100 | 5 |
| 98 | 2 | 100 | 1 |
| 100 | 0 | 100 | пустой |
Таблица 4: Протокол для стандартной кривой диапазон низких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленные протокол описывает поколения NLps с высоким инкапсуляции эффективность для искусственно модифицированных мРНК, а также надежных transfection клетки в пробирке. Кроме того NLps гарантируют освобождение мРНК, который в свою очередь, будет переведен на функциональных белков внутри клетки. Кроме того transfections, с помощью NLps могут быть выполнены в среде обычных клеток, что приводит к высокой сотовые коммуникации во время трансфекции, и длиться до трех дней после transfection.
Чтобы использовать мРНК как терапевтические, самостоятельной сборки системы для его доставки является предпочтительным. Наиболее распространенными трансфекции реагенты включают Катионный липиды, включая липосомы. Как липосомы положительно заряженными, отрицательно заряженных нуклеиновые кислоты может быть инкапсулирована в них, тем самым позволяя электростатического отталкивания клеточных мембран для преодоления35. Катионоактивный липид DC-холестерин уже была описана в предыдущих исследованиях как стабильного и биосовместимых автомобиль36. Добавлением нейтральных липидов ДОПИНГ приводит к расширенной трансфекции эффективность37. Учитывая изложенные преимущества, упомянутых выше, эти липиды были выбраны для подготовки NLps. Кроме того предыдущие исследования показали, что использование этих двух липиды предпочтительнее над другими из-за увеличение сотовой трансфекции курс с отрицательно заряженных нуклеиновые кислоты38.
Для успешного создания NLps и nanolipoplexes важно обратить особое внимание на некоторые шаги. Процедура nanoliposome поколения должно осуществляться под O2-свободных условиях. Наличие2 O во время генерации НЛП может привести к деградации фосфолипидов и снижение воспроизводимость39. Кроме того несмотря на изменения, мРНК очень чувствительной в отношении деградации через nucleases. Следовательно для регидратации липидной пленки, использование свободных РНКазы H2O настоятельно рекомендуется для предотвращения деградации мРНК в процессе комплексообразования. Кроме того должна обеспечиваться РНКазы свободных условий для хранения nanolipoplexes.
Кроме того NLps могут образовывать агрегаты со временем из-за нестабильной термодинамической системы. Влияние параметров включают температура хранения и поверхности заряд в липосомах40. НЛП агрегирование может привести к дестабилизации липосом мембраны и риск нежелательных мРНК выпуск41, приводит к плохой трансфекции эффективность и мРНК деградации внеклеточного пространства. Однако как уже показано, nanolipoplexes может храниться при температуре 4 ° C на срок до шести месяцев без агрегирования или потери эффективность трансфекции35.
С помощью липосомы как препарат несущей системы, два ключевых проблем доставки лекарств может быть решена. Липосомы защитить инкапсулированные препарат от деградации и возможность пассивно тканях-мишенях с разрывными эндотелия, таких как печень или костного16. Для доставки терапевтического нуклеиновые кислоты, такие параметры, как размер частиц и инкапсуляции потенциала имеют решающее значение для оценки и клеточного поглощения липосомальных транспортных средств. В частности размер липосомы в нанометровом масштабе позволяет взаимодействие с клеточной мембраны42 и, таким образом, важное значение в естественных условиях использования позже. Во-первых липосомы должен быть достаточно небольшим, чтобы избежать Распродажа через почечной и печеночной системы43. Во-вторых размер липосом должно помочь преодолеть барьер кровеносных сосудов целевой ячейки желаемого органа. Было сообщено, что липосомы в диапазоне размеров от 100-300 Нм смогли эффективно transfect гепатоцитов44; Однако, большая размера липосомы (например, 400 Нм) не смогли преодолеть эндотелиальный барьер45.
Хотя описанные метод был создан для доставки мРНК, он также может осуществляться для других терапии нуклеиновых кислот, таких как микроРНК. В недавнем исследовании мы продемонстрировали, что могут быть выборочно направлены микроРНК 126 и, таким образом, развитие аневризмы брюшной аорты может быть эффективно предотвратить46. Как терапия ДНК/РНК может вызвать побочные эффекты, такие как активации тромбоцитов, когда они вступают в непосредственный контакт с клетками, упаковка в липосомах этого можно избежать, таким образом делает его далее выгодно47. Таким образом метод, представленные здесь очень универсальна и может использоваться для разработки лекарств для лечения многих заболеваний. Протокол позволяет не только быстро и экономически эффективным поколения эффективных мРНК перевозчика с определенным размером, но также предлагает возможность настройки формулировка липида согласно потребностям конкретного приложения: (1) размер липосомы могут быть легко изменены, изменив фильтры; (2) поверхность положительно заряженных липосомы может быть изменен с помощью, например, полиэтиленгликоль, для увеличения стабильности и задержка крови Распродажа во время в vivo 48приложения. Связывание специфических антител к липосомы позволяет адресности инкапсулированные наркотиков49. С дальнейшего рассмотрения и более подробное понимание физических свойств протокол может все еще быть улучшены.
Для генерации липосомы, доступны три общие методы: сухой фильм, инъекции этанола и реверс фаза испарения. В Ян и др. исследования, эти три технологии изготовления были сравнению35. Было установлено, что липосомы с определенным размером и равное распределение в решении могут быть получены с помощью метода сухой фильм. Кроме того, процедура сухой фильм провел в это исследование привело к производству NLps с определенным размером 200 Нм, равномерное распределение и высоким инкапсуляции потенциала.
С одной стороны положительный заряд липосом приводит к повышенной инкапсуляции потенциала и лучше клеток поверхности фьюжн50,51,52, но с другой стороны, она может дестабилизировать клеточной мембраны и активировать различные иммунной активации пути и ячейки смерти27,53. Однако apoptotic свойств катионного липиды могут быть минимизированы, используя вспомогательный липидов ДОПИНГ54,55. В исследовании Zhang et al.было обнаружено, что соотношение 1:2 DC-холестерина и ДОПИНГ во время формирования липосом приводит к наиболее эффективным сотовой трансфекции, с использованием нуклеиновых кислот38. В метод, реализованный в настоящем исследовании, липидов соотношение 1:2 DC-холестерина и ДОПИНГ был использован в смешанной липидов подвеска при подготовке фильма липидов, и подготовленный липосомы привело трансфекции высокой эффективности и, одновременно, высокая ячейка жизнеспособности. Аналогичные результаты были также обнаружены другие исследователи, такие как Ciani56 и37Farhood.
В целом липосомы были использованы для лет в клинических испытаниях, показывая большой биосовместимость и низкой токсичности в естественных условиях. В сочетании с мРНК NLps может использоваться для эффективной доставки мРНК клеток или органов в пробирке и в естественных условиях, чтобы побудить de novo синтеза желаемого белка. Что касается терапевтического применения nanolipoplexes могут использоваться, например, в рану исцеления патчи для мРНК трансдермальной доставки57 активировать регенерации клеток, или как спрей для распыления мРНК58 для лечения легких болезней59,60 таких муковисцидоз.
Представленные протокол гарантирует, что простой и доступный способ для генерации NLps, используя метод сухой фильм, который затем может использоваться для эффективного инкапсуляции в vitro трансляции мРНК и безопасного transfection клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Нет
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
| Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
| Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
| RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
| Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |
References
- Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
- Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
- Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
- Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
- Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8 (2014).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
- Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
- Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
- Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
- Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
- Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
- Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
- Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
- Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
- Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
- Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
- Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
- Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
- Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497 (2011).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
- Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943 (2014).
- Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
- Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
- Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
- Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
- Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
- Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
- Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
- Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H.
- Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
- Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
- Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
- Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
- Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
- Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
- Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
- Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
- Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
- Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
- Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
- Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
- Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
- Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504 (2015).
- Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
