Summary
ここでカチオン性 nanoliposomes、ドライ フィルム法に基づいており、安全のため使用することができますの生成のためのプロトコルについて述べるし、体外の効率的な配信は、メッセンジャー RNA を転写しました。
Abstract
メッセンジャー RNA (mRNA) の開発-正のため様々 な疾患の治療がより重要になる治療法に基づく体外のプロパティ (IVT) mRNA の転写。IVT mRNA の助けを借りて、ターゲット細胞の生理的状態を変更せず目的タンパク質のde novo合成を誘導することができます。さらに、蛋白質の生合成は、IVT mRNA の一時的な効果により正確に制御できます。
細胞の効率的な遺伝子導入の nanoliposomes (NLps) 治療 mRNA の安全かつ効率的な配信手段があります。本研究では、IVT mRNA の配信ベクトルとして安全かつ効率的なカチオン NLps DC コレステロールと 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine で構成される (ドープ) を生成するプロトコルについて説明します。定義を持つ NLps のサイズ、均一な分布と高錯形成能力とドライ フィルム法を使用して作り出すことができます。また、錯を分析するさまざまなテスト システムを提案し、トランスフェクションの効率、合成を使用して強化された緑の蛍光蛋白質 (eGFP) mRNA として細胞生存率に及ぼす影響。全体的にみて、提案するプロトコルは進めるし、治療 mRNA の管理を向上させる可能性のある mRNA の錯形成の効果的かつ安全なアプローチを提供します。
Introduction
治療への応用のため変更された mRNA の使用は最後の数年間で大きな可能性を示しています。心血管、炎症性、複成火山と疾患だけでなく、ワクチンの開発には、mRNA は有望な治療剤1です。
MRNA とタンパク質補充療法では、ターゲット セル2に DNA トランスフェクションに基づいている古典的な遺伝子療法にいくつかの利点を提供しています。MRNA 関数は、細胞質に直接開始します。プラスミド DNA (pDNA)、二本鎖の構築、円形がプロモーター領域および治療用タンパク質3、細胞質でも行為をエンコードする遺伝子の塩基配列を含む DNA それだけに組み込むことが細胞分裂している細胞トランスフェクション時。これは組織1,4transfected セルの数を減らします。具体的には、心筋細胞などの弱い細胞分裂活性を持つ組織の導入は困難な5です。PDNA と対照をなして、トランスフェクションと mRNA の翻訳は組織1,6の分裂と非分裂細胞で発生します。変異原性、または免疫反応7,8が蛋白質符号化の mRNA、目的タンパク質のde novo合成と細胞のトランスフェクション後、宿主ゲノムへの DNA のウイルスの統合が来るかもしれない9,10を自律的に起動します。さらに、タンパク質合成は、ゲノムと干渉や変異原効果11を危険にさらすことがなく個々 の用量で患者のニーズに正確に調整できます。シチジン、ウリジンの12の代わりに擬似ウリジンと 5'-methylcytidine を使用して総合的に生成された mRNA の免疫活性化の可能性を大幅に下げることができます。擬似ウリジン変更された mRNA は、生物学的安定性と有意に高い翻訳能力13に示されています。
臨床応用における mRNA ベース療法の有望なプロパティから利益を得ることができる、セルに mRNA の輸送に適した車両を作成することが不可欠です。この車必要があります非毒性特性の in vitroとin vivoの負担、ヌクレアーゼ劣化に対する mRNA を保護し、十分な細胞内取り込みは、長期にわたる可用性と14の mRNA の翻訳。
薬物送達など単層カーボンナノ チューブ量子ドットのリポソームは、体内のすべての可能なキャリア タイプの間で後者をされている最も15,16を検討しました。リポソームは、10脂質二分子膜からなる小胞。彼らは、疎水性と親水性部分を持つ両親媒性であり、これらの分子の自己整理、球形の二重層が形成された17。リポソーム、内部治療薬または薬カプセル化でき、したがって、酵素分解18から保護します。N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium 塩化物 (DOTMA)19リポソーム [1, 2-ビス (oleoyloxy)-3-(トリメチルアンモニオ-) プロパン] (DOTAP)20、および dioctadecylamidoglycylspermine (犬)21、またはDC コレステロール22、よく特徴があり、DNA または RNA の細胞のトランスフェクションの頻繁に使用されます。
カチオン性リポソームは、正荷電脂質および中性リン脂質23を構成します。カチオン性リポソームによる遺伝子導入細胞24,25に核酸の輸送のための最も一般的な方法であります。カチオン性脂質粒子は、核酸分子26のバックボーンに負荷電の隣酸塩グループと複合体を形成します。これらのいわゆるリポプレックスは細胞膜の表面に添付し、エンドサイトーシス、エンドサイトーシスようなメカニズム27セルを入力します。
1989 年、マローンら。正常にカチオン性脂質を介した mRNA トランスフェクション28をについて説明します。しかし、DOTMA と 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ドープ) 混合物を使用すると、グループは、DOTMA が細胞毒性28を明示されることを発見しました。また、Zohraらは、mRNA のトランスフェクション試薬29として DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-トリメチル アンモニウム-プロパン塩化ビニル) を使用できることを示した。ただし、細胞の効率的な遺伝子導入の DOTAP をフィブロネクチン29やドープ30など、その他の試薬との組み合わせで使用してください。これまでのところ、DOTMA は遺伝子配達31用市場で最初のカチオン性脂質です。他脂質治療キャリアとして使用されるまたは、臨床試験のさまざまな段階でテストされている (例えば、EndoTAG-私は、脂質キャリアとして DOTAP を含む)、フェーズ II 臨床試験32で現在調査中です。
この作品は、DC コレステロールと麻薬を含む NLps の世代のプロトコルを説明します。このメソッドを実行するは簡単です、サイズの異なる NLps の生成が可能します。ドライ フィルム法による NLp 世代の一般的な目標は、効率的かつ生体適合性細胞の in vitro14,トランスフェクション33をできるように、mRNA に対するリポソームを作成します。
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Protocol
1. カチオン性 Nanoliposomes (図 1) の生成
- DC コレステロール (3-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) カルバモイルリン] コレステロール塩酸) とドープ (dioleoyl ホスファチジルエタノールアミン) クロロホルム 25 mg/mL の最終的な集中を達成するために、粉末として提供される脂質を溶解します。
注: 保存-20 ° C で分解された脂質 - 両方の脂質の 25 mg/mL 原液で動作します。溶存 DC コレステロールおよび溶存ドープ ガラスのフラスコの中の 80 μ L のミックス 40 μ L。
注: 総脂質量は 3 mg です。クロロホルムの速い蒸発を避けるためには、ピペッティング時に氷に脂質を配置します。 - アルゴン ガス流動場下における 15 分のクロロホルムを蒸発させます。その後、シリカゲルで乾燥器を埋める、内、オープン ガラス フラスコを配置し、残りのクロロホルムを蒸発し、ガラス フラスコ内脂質膜が形成されるかどうかを確認する一晩真空を適用します。
注: は、高速動作し、不要な O2の接触を避けます。 - ヌクレアーゼ フリー水と渦 15 分 (図 2 a) の懸濁液の 1 mL で形成された脂質膜を水分補給します。その後、1 時間 (図 2 b) 超音波浴に懸濁液を配置します。
注: 懸濁液は少し曇りでしょう。 - 製造元の指示に従って小型押出機を組み立てる脂質サスペンションと注射器を記入し、押出機の両側に満たされた注射器と空の注射器を配置します。他、x-懸濁液 (図 2) を押し出すの 25 x 20 に 1 つの注射器から膜脂質懸濁液を押します。
注: NLps のサイズは、使用される膜の細孔径によって決定されます。 - さらに使用するまで 4 ° C でガラスのフラスコに、NLps を格納します。
注: 長期貯蔵時間の後、NLps によって置かれなければなりません再び 15 分間超音波処理浴の複合体形成を回避するために 35 kHz。
2 合成 mRNA のin Vitro転写。
- EGFP エンコード準備 mRNA のプロトコルに従う公開以前34。
- 0.7 μ m の前方のプラスミドから eGFP シーケンスを増幅 (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') および逆引き (5'-T120 CTT CTT 法 CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') PCR のプライマーおよびポリメラーゼのキットします。
- 20 μ L のポリメラーゼ キットから 5 倍ミックスだけでなく、20 μ L の DNA (材料表) の溶融挙動の変化する商業緩衝液を混ぜます。各 (前方および後方) プライマーの 7 μ L を追加します。
- 25 を追加ポリメラーゼ キットから混合物およびポリメラーゼの 2 μ L に eGFP のプラスミッドの ng。
注意: 氷上ポリメラーゼをソリューションにピペッティングする前に削除します。 - ヌクレアーゼ フリー H を追加2O 100 μ L のボリュームまで、混合物に。
- 次の表 1にプロトコルたちで PCR のサイクルを実行します。
- PCR 精製キットに eGFP エンコーディング dna を浄化します。
- したがって、500 μ L のキットから結合バッファーで PCR 溶液を混合、精製列に入力するために使用します。
- 1 分の最高の速度で列を遠心分離機、濾液を廃棄します。
- 洗浄バッファー列、最大で再び遠心分離に私は 1 分の高速化し、濾液を破棄の 750 μ L を追加します。
- 遠心分離機を手順 1 x 列フィルターからバッファーを削除する.
- 列を新しい 1.5 mL チューブに転送します。
- ヌクレアーゼ フリー H の 20 μ L を追加2O 列にはインキュベート 1 の最小値と最大速度で 1 分間遠心します。この手順を繰り返します。
- 光度計で DNA の濃度を測定し、-20 ° C で保存
- ゲル電気泳動による DNA の品質分析を実行します。Tris ホウ酸 EDTA (TBE) バッファーの agarose の 0.5 g を追加し、agarose を完全に溶解するまで強火で電子レンジで熱しなさい。
- 液体の agarose のゲル染色液 5 μ L を追加、ゲル室にソリューションを埋める、ゲルの重合まで待ちます。
- 染料と塗りつぶしの 12 μ L の端ボリュームまでそれはゲルの井戸に DNA サンプルと同様に、DNA の梯子のピペット、100 V で 1 時間電気泳動を実行ロード x 6 の 2 μ L で DNA のミックス 200 ng。
- 紫外線の下でゲル分析ステーションを使用してゲルを分析します。
- 含む T7 ポリメラーゼの in vitro転写キットと、dna から mRNA を生成する生体外のトランスクリプションを実行し、Ψ UTP とメチル CTP UTP と CTP の修正されたヌクレオチドを代用します。
- 生体外のトランスクリプションのためには、次の表 2材料を混ぜます。
メモ: 交換 1.5 μ L 1:10 とメチル CTP のヌクレアーゼ フリー H で希釈した Cy3 CTP2O eGFP の生体外のトランスクリプションの間に、mRNA の Cy3 標識を達成するために mRNA。 - 37 ° C で 4 h の IVT 反応混合物を孵化させなさい
- DNase を 1 μ l 添加 T7 ポリメラーゼからキットし、DNA のテンプレートを消化する 37 ° C で 15 分間インキュベートします。
- 生体外のトランスクリプションのためには、次の表 2材料を混ぜます。
- MRNA を浄化するには、RNA クリーン アップ キットを使用します。
- ヌクレアーゼ フリー H で 100 μ L のボリュームに IVT ミックスを埋める2o.
- 上下にピペッティングで 350 μ L の換散バッファーとミックスを追加します。
- 100% エタノールの 250 μ L を加え、再度混ぜます。ピペットのクリーンアップ列にミックス。
- 15 遠心分離機 x gと濾液破棄 8,000 で s。
- 列、15 のために再度遠心分離機に洗浄液 500 μ L を追加 8,000 g、および削除濾液 x で s。
- コラム 1 を洗浄洗浄バッファーの 8,000 の x gで 2 分間遠心分離機 500 μ L と x。
- 新鮮な 1.5 mL の反応管に列を移動します。溶出が mRNA 2 ヌクレアーゼ フリー H の 20 μ L の 1 分孵化によって x2O 列膜上に続いて最高速度で 1 分遠心分離。
- 脱燐酸化キットを使用して mRNA から隣酸塩グループを削除します。MRNA に 10 x ホスファターゼ バッファーの 4.5 μ L とホスファターゼ 1 μ L を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート
- 手順 2.5.1 - 2.5.7 mRNA を再度、浄化します。
- MRNA concertation を光度計で測定します。
- ゲル電気泳動を使用して、分析、純度および mRNA のサイズ。したがって、手順 2.3.9 - 2.3.10 で agarose のゲルを準備します。
- ホルムアミド、37% ホルムアルデヒドの 1 μ L、x の男性、10 の 1 μ L とローディングの染料 200 x 6 の 1.7 μ L ミックス 3.3 μ L mRNA の ng、ヌクレアーゼ フリー H で 10 μ L まで塗りつぶす2O 各サンプルの RNA マーカー。
- MRNA の変性の 65 ° C で 10 分間のミックスを孵化させなさい。MRNA RNA マーカーとゲルの井戸を読み込み、100 V で 1 時間のためのゲルを実行します。
- 紫外光を用いたゲル ドック ステーションを使用してゲルを分析します。
3. 合成 mRNA の錯形成
- 氷の上の合成の mRNA を解凍渦、それとチューブを開く直前に遠心分離機。
- 合成 mRNA のミックス 10 μ L (mRNA 濃度は 100 ng/μ L) 1 μ L、2.5 μ L、5 μ、10 μ L または NLp 懸濁液 20 μ L を (自然言語処理濃度が 3 mg/mL)。簡単に遠心し、室温 (RT) nanolipoplex 形成で 20 分間インキュベートします。
注: は、ピペッティングにより混在させないでください。これは、ボリュームの損失につながることができます。徹底した混合直後の渦。 - Nanolipoplexes に通常細胞培地 1 mL を追加し、上下にピペッティングで混ぜます。
4. Nanoliposomes のカプセル化効率の解析
- カプセル化の実験を実行するには、RNA 定量キットを使用します。
- 高範囲の蛍光染料レバレッジと低域の試金のための 1:2,000 を希釈して、実用的なソリューションを準備します。
注: は、氷の上の蛍光染料を解凍します。使用する前に直接作業ソリューションを準備します。 - EGFP の 2 μ g/mL の原液 1 mL を使って高域と低域の標準曲線を準備 mRNA ヌクレアーゼ フリー H2o.
注: 標準の曲線では、カプセル化の実験で使用される mRNA を使用します。 - 高範囲標準 (20 ng/mL の-1 μ g/mL) の準備のため表 3を使用します。
- 低範囲の標準は、mRNA 原液 1:20 100 ng/mL の最終的な集中を達成するために 2 μ G/ml eGFP を薄くしなさい。表 4で説明されているように低範囲標準 (1 ng/mL の-50 ng/mL) を準備します。
- EGFP の 1 μ g を組み合わせる mRNA (10 μ L) と NLps の 7.5 μ g (2.5 μ L) ルートで 20 分間インキュベートし、
注意: 劣化を避けるために氷の上 mRNA。 - ヌクレアーゼ フリー H の 1 mL を追加フォーム nanolipoplexes と上下にピペッティングしてミックスする2O.
- 1: 200 の 1 mL を追加または 1:2,000 RNA の蛍光染料のカプセル化されたサンプルおよび標準に取り組んで解決策と暗闇の中で室温で 5 分間インキュベートします。
- 黒 96 ウェル プレートにピペットの標準および重複のサンプルと 530 で蛍光を測定マイクロ プレート リーダー (図 3) の nm。
5. セルの Transfection のための準備
- プレート 1.5 x 105 12 ウェル プレート トランスフェクション前に 1 d の A549 細胞/ウェル。
- 37 ° C、5% CO2通常細胞用培地 (10% 牛胎児血清 [売却]、2 mM L-グルタミン 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを DMEM/高血糖) で細胞をトランスフェクション前に 24 h にインキュベートします。
6. 細胞のトランスフェクション
- 洗って準備 1 mL/ウェル PBS で 1 x を細胞 (Ca なし2 +/Mg2 +)。
- 準備された nanolipoplex の混合物の 1 つの mL を追加、eGFP の 1 μ g を含む mRNA は、1 μ L、2.5 μ L、5 μ、10 μ L、または A549 細胞を準備板の 1 つに、20 μ L NLps にカプセル化されます。
- セルに nanolipoplex 懸濁液を追加し、正規条件トランスフェクション効率を分析する 24 h や 24 h、トランスフェクション後の細胞生存率を分析する 72 時間インキュベートします。
注: NLps のトランスフェクションでは、媒体の変更は必要ありません。
7. 細胞トランスフェクション性フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡を用いた解析
- 上澄みを除去し洗浄を 1 ml/残り NLps を削除する (なし Ca2 +/Mg2 +) PBS をよきます。
- フローサイトメトリー用セルを準備します。
- Trypsinize 500 μ L/ウェル トリプシン/edta (0.05%) 3 分停止の 37 ° C で細胞プロセス、通常の FBS を含む媒体の同じ量 (500 μ L/ウェル) を追加することによって、トリプシンを不活化します。
- 400 × gで 5 分間細胞を遠心し、細胞ペレットを触れることがなく上澄みを慎重に取り外します。
- 1 ml の PBS のセルを洗浄 (Ca なし2 +/Mg2 +)。
- 1 x 固定の解決の 300 μ L で細胞を再懸濁し、流れ cytometry チューブにセルを転送します。
- 488 で細胞を分析 (図 4 a) 流れの cytometer で nm。
注: 渦を測定する前に x を直接セル 1。
- 蛍光顕微鏡用細胞を準備します。
- -20 ° C で保存しておいた 1 mL/よく 100% メタノールは、セルを修復します。
- 追加 500 μ L/ウェル 300 nM DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) (せずに Ca2 +/Mg2 +) PBS に溶解し、暗闇の中で 5 分間インキュベートします。
- DAPI のソリューションを削除し、セルを洗浄して再び-20 ° C で保存されている 100% メタノール
- 蛍光顕微鏡 (図 4 b) を使用してセルを分析します。
注: を使用して、次の励起/蛍光波長: eGFP 488/509 nm、DAPI 358/461 nm、Cy3 550/570 nm。
8. セル実行可能性の試金
- MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ブロマイド) 5 mg を RPMI (なし) 1 mL に溶かしてください。
注: 溶存 MTT 必要がありますさらに希釈 1:10 (最終濃度: 0.5 mg/mL) 使用前に RPMI で。 - 洗浄 transfected セル 3 x 1 mL/ウェル PBS (Ca2 +/Mg2) なし。
注: 通常のセル中のまま完全に削除してください。 - 1:10 の 500 μ L/ウェルの細胞に MTT ソリューションを希釈し、37 ° C で 4 時間インキュベートを追加します。
- 培養後、細胞から MTT ソリューションを削除し、500 μ L/ウェル DMSO (ジメチルスルホキシド) を追加します。再び 37 ° C で 10 分間インキュベートします。
- 540 で吸着を行いクリア下 96 ウェル プレートに三つ子の DMSO 溶液をピペット nm マイクロ プレート リーダーを使用しています。
- 未処理細胞の生存率を 100% に設定し、無処理細胞 (図 5) と比較すると他のグループの細胞生存率を計算します。
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Representative Results
前述のプロトコルを使用して、DC コレステロールおよびドープ脂質から成る NLps ドライ フィルム法 (図 1) を使用してを調製しました。準備中、nanoliposome ソリューションは、濁度 (図 2) のさまざまな段階を示しています。
NLps のカプセル化の効果は、無料 RNA 定量キット (図 3) を使用してないカプセル化され、ある mRNA 量を分析することによって mRNA の eGFP エンコーディングの 1 μ g カプセル化後分析できます。
NLps、形成された nanolipoplexes の異なった量の mRNA は細胞培養できます eGFP のカプセル化後の in vitroと eGFP 発現細胞の割合を用いて解析できる流れ cytometry 24 h posttransfection (図 4 a).Nanoliposome ソリューションのも 1 μ L で細胞の生体外の高発現を達成するために十分です。セル、Cy3 標識 eGFP を含む NLps をトランスフェクトしたとき (図 4 b) 可視化 mRNA、すでに生成された eGFP 蛋白質 (蛍光グリーン) と同様に、細胞質 (赤い蛍光性) の mRNA は、eGFP の存在。
細胞の生存率が 24 h (図 5 a) にテストされた nanolipoplexes を用いた細胞のトランスフェクションは、細胞に悪影響を持つことができます、ので、72 h (図 5 b) posttransfection。セルはそれぞれ NLps の nanolipoplexes、2.5 または 5 μ L で扱われたとき、細胞生存率に及ぼす影響は検出されませんでした。
図 1: カチオン性 nanoliposomes の製造プロセスの図式的な概観します。まず、ガラスのフラスコの中溶存脂質 DC コレステロールと麻薬を一緒に混合する必要があります。第二に、可視クロロホルム液体はアルゴンの下で蒸発する必要があります。 または窒素ガス流動およびクロロホルムの残り物を真空中で一晩蒸発を許可する必要があります。ヌクレアーゼ フリー H でガラスのフラスコの底に形成された脂質膜を復元する必要があります第三に、2O、多重リポソームを形成するボルテックスが続きます。超音波処理とリポソーム液の押し出しで、すぐに使用できるリポソーム NLps が生産されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 製造時にさまざまな段階で nanoliposome ソリューションです。この図 (A) 脂質膜および (B) 後、超音波で 1 h お風呂 (C) と同様に、15 分のボルテックスの水分補給後直接リポソーム液に続いて押出の 25 のサイクルを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: nanoliposomes の封止効果。このパネルは無料 eGFP の定量化を示しています NLps でカプセル化した mRNA。± SEM を手段として結果が表示されます (n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: nanolipoplexes のトランスフェクション効率。(A) このパネルは、トランスフェクション NLps のさまざまな量を使って eGFP mRNA 24 h posttransfection の 1 μ g をカプセル化するための最適な mRNA/nanoliposome 比率の決意を示しています。(B) このパネルは 2.5 μ L にカプセル化、Cy3 標識合成の mRNA の検出を示しています NLps とセル 24 h posttransfection の eGFP 発現 (スケールバー = 50 μ m)。± SEM を手段として結果が表示されます (n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: nanoliposomes とカプセル化された mRNA トランスフェクション後生存率をセルします。このパネルは、MTT の試金 24 h (A) と (B) 72 h posttransfection を使用してセル実行可能性の測定を示しています。± SEM を手段として結果が表示されます (n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ステップ | ° C の温度 | 期間 |
| 1 | 95 | 5 分 |
| 2 | 94 | 15 s |
| 3 | 55 | 1 分 |
| 4 | 72 | 1 分 |
| 5 | 2 30 へ x | |
| 6 | 72 | 10 分 |
| 7 | 4 | ホールド |
表 1: PCR サイクル DNA 増幅のためのプロトコル。
| 濃度 | 量 | |
| ATP | 7, 5 mM | 4 Μ L |
| GTP | 1,875 mM | 1 Μ L |
| 5'-Methylcytidin | 7, 5 mM | 3 Μ L |
| Ψ | 7, 5 mM | 3 Μ L |
| アルカ | 2, 5 mM | 10 Μ L |
| DNA のテンプレート | 1.5 μ g | |
| バッファー ミックス | 1 x | 4 Μ L |
| T7 酵素ミックス | 4ΜL | |
| リボヌクレアーゼ阻害剤 | 1 Μ L | |
| ヌクレアーゼ フリー水 | 最大 40 μ L を記入します。 | |
表 2:ミックス、体外mRNA に DNA のトランスクリプション。
| ヌクレアーゼ フリー H のボリューム2O (μ L) | EGFP mRNA 高範囲原液 (μ L) のボリューム | 1: 200 の蛍光染料 (μ L) のボリューム | 最終濃度 (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 1000 |
| 50 | 50 | 100 | 500 |
| 90 | 10 | 100 | 100 |
| 98 | 2 | 100 | 20 |
| 100 | 0 | 100 | 空白 |
テーブル 3:高範囲標準曲線のためのプロトコル。
| ヌクレアーゼ フリー H のボリューム2O (μ L) | EGFP mRNA 低域原液 (μ L) のボリューム | 配分蛍光染料 (μ L) のボリューム | 最終濃度 (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 50 |
| 50 | 50 | 100 | 25 |
| 90 | 10 | 100 | 5 |
| 98 | 2 | 100 | 1 |
| 100 | 0 | 100 | 空白 |
表 4:低範囲の標準曲線のためのプロトコル。
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Discussion
提案するプロトコルでは、総合的に変更された mrna は、高い封止効果 NLps の世代だけでなく、細胞の in vitroの信頼性の高いトランスフェクションをについて説明します。また、NLps mRNA は、ターンでは、細胞内タンパク質に翻訳はのリリースを保証します。さらに、NLps を使用して transfections 通常細胞培地で行うことが、高の結果セルの目をトランスフェクション効率を促進し、最後トランスフェクション後 3 日前まで。
治療として mRNA を使用するため、配信用システムを自己組織化が好ましいです。最も一般的なトランスフェクション試薬には、リポソームを含むカチオン性脂質が含まれます。リポソームは正荷電、負荷電の核酸カプセル化できる、それらの克服35細胞膜の静電気の拒絶ができます。カチオン性脂質安定性と生体適合性の車両36としては以前の研究に記載されて DC コレステロールが既にいます。中性脂質添加ドープは、強化されたトランスフェクション効率37につながります。輪郭を描かれた利点を考慮した上記のこれらの脂質が NLps の準備のために選ばれました。さらに、これらの 2 つの脂質の利用が望ましい他のものより負荷電の核酸38増加細胞トランスフェクション率による前の調査は示した。
NLps の nanolipoplexes 成功の世代のための手順の一部に余分な注意を払うことが重要です。Nanoliposome 生成の手順は、O2の下で実施されるべき-無料の条件。NLp の生成中に O2の存在は、リン脂質と減らされた再現性39の劣化につながります。また、変更、にもかかわらず mRNA は核酸の分解に関して非常に敏感です。したがって、脂質膜の水分補給、RNase フリー H2O の使用は強くお勧めします錯形成反応中の mRNA の低下を防ぐ。また、RNase フリーの条件は、nanolipoplexes の貯蔵のために確保されなければなりません。
さらに、NLps は熱力学システムの不安定のため時間をかけて集計を形成できます。影響のパラメーターには、貯蔵温度およびリポソーム40の表面電荷が含まれます。NLp 集計リポソーム膜の不安定化、望ましくない mRNA 解放41、貧しいトランスフェクション細胞外スペースの有効性と mRNA が低下するリスクがあります。ただし、以前に示すように、nanolipoplexes を集計やトランスフェクション効率35の損失なしで最長 6 ヶ月の 4 ° C で保存できます。
薬物キャリアーとしてリポソームを用いたドラッグデリバリー システムの主要な問題の 2 つが解決できます。リポソームは、カプセル化された薬物を劣化から保護し、16の肝臓や骨髄などの不連続の内皮を持っているターゲット組織受動することができます。治療核酸、粒やカプセル化などのパラメーターの配信容量はリポソーム型車両の評価と細胞取り込みの重要な。特に、ナノメートル スケールにおけるリポソームのサイズは42細胞膜との相互作用を可能し、それにより、体内使用後にとって重要です。まず、リポソームは、腎と肝のシステム43でクリアランスを避けるために十分に小さいはずです。第二に、リポソームの粒径は、目的臓器の細胞をターゲットに血管の障壁を克服するために役立つはずです。肝細胞44を使って効率的に 100-300 nm のサイズの範囲でのリポソームができたことが報告されました。ただし、大型リポソーム (例えば、400 nm)45内皮障壁を克服することができませんでした。
MRNA デリバリーに記述法が確立されたが、マイクロ Rna など、他の核酸治療も実装できます。最近の調査では、マイクロ Rna 126 の対象などに選択的に使用でき、したがって、腹部大動脈瘤の開発ができる効果的に防がれた46を示した。細胞との直接接触に入ってきた、DNA ・ RNA 治療は血小板の活性化などの副作用を引き起こすことができます、従ってそれにさらに有利な47をレンダリング、このリポソーム内で包装からの回避ができます。したがって、ここで紹介した方法は、汎用性の高い、多くの病気のための薬剤投与を設計するために使用できます。確立されたプロトコルだけでなく定義されたサイズで効率的な mRNA キャリアの高速かつコスト効果の高い世代をできますが、特定のアプリケーションのニーズに合わせて脂質製剤をカスタマイズする可能性を提供しています: (1) のサイズ、リポソームは、フィルターを変更することによって簡単に変更することができます。(2) 正電荷リポソームの表面を使用して、たとえば、ポリエチレング リコール、体内アプリケーション48中に安定性と遅延の血クリアランスを増加する変更でした。リポソームに特定の抗体の結合は、カプセル化された薬49のターゲットを絞った配信できます。さらに検査と物性により詳細な洞察力、プロトコルは時にまだ改善可能性があります。
リポソームの生成の 3 つの一般的な方法があります: ドライ フィルム、エタノール注入、逆相蒸発。ヤンら。研究では、これら 3 つの製造技術が35を比較します。ドライ フィルム法によるリポソームと定義されたサイズおよびソリューションの均等分布を生成することを分られました。さらに、ドライ フィルムの手順実施 200 の定義されたサイズと NLps の生産結果今回 nm、均一に分布し高カプセル化能力。
一方、正電荷リポソームにより、増加カプセル化能力やより良いセル表面の融合50,51,52, しかしそれが細胞膜を不安定にし、アクティブにする一方で、別の免疫活性化経路と細胞死27,53.しかし、カチオン性脂質のアポトーシス プロパティは、ヘルパー脂質ドープ54,55を使用して最小化できます。張らによる調査では、リポソームの生成中に DC コレステロールと麻薬の 1:2 の比率が核酸38を使用して最も効率的な細胞のトランスフェクションにつながることが分かった。本研究で実装されるメソッド、脂質比 1:2 DC コレステロールと麻薬は脂質膜の中に、混合脂質懸濁液で使用され準備されたリポソームを導いた高いトランスフェクション効率を同時に、高細胞生存率。同様の結果もチャーニ市立56 Farhood37など、他の研究者によって発見されました。
全体的にみて、リポソームは、優れた生体親和性と低毒性で生体を示す臨床試験で長年使用されています。MRNA と組み合わせて、NLps mRNA の細胞または器官体外と体内への効率的な配信のために使える目的タンパク質のde novo合成を誘導します。治療への応用について nanolipoplexes される可能性があります、たとえば、経皮吸収型 mRNA 配信57細胞の再生を有効にするまたはスプレーとして創傷治癒パッチで肺の治療のための mRNA の58のネブライザーの嚢胞性線維症など疾患59,60 。
提案するプロトコルは、mRNA と安全なトランスフェクション細胞の体外の効率的なカプセル化のため使用することができますドライ フィルム法による NLps の生成のための簡単なアクセス方法が転写される保証します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
どれも
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
| Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
| Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
| RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
| Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |
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