Summary
여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.
Abstract
메신저 RNA (mRNA)의 개발-기반 치료제 다양 한 질병의 치료에 긍정적인 때문에 점점 더 중요 한 된다 생체 외에서 의 속성 (IVT) mRNA를 베 꼈 다. IVT mRNA의 도움으로, 원하는 단백질의 de novo 종합 목표 셀의 생리 적 상태를 변경 하지 않고 유도 될 수 있다. 또한, 단백질 생 합성 IVT mRNA의 일시적 효과의 한 정확 하 게 제어할 수 있습니다.
셀의 효율적인 transfection nanoliposomes (NLps) 치료 mRNA에 대 한 안전 하 고 효율적인 배달 차량을 나타낼 수 있습니다. 이 연구는 IVT mRNA에 대 한 배달 벡터로 안전 하 고 효율적인 양이온 NLps DC 콜레스테롤 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 구성 (마약)을 생성 하는 프로토콜을 설명 합니다. NLps를 정의 하는 데 크기, 균일 분포, 그리고 높은 complexation 용량, 그리고 드라이 필름 메서드를 사용 하 여 생성 될 수 있다. 또한, 우리가 다른 테스트 시스템의 complexation 분석을 제시 하 고 합성을 사용 하 여 transfection 신진대사 향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) mRNA, 뿐만 아니라 세포 생존 능력에 미치는 영향. 전반적으로, 제시 프로토콜 mRNA complexation 하 고 치료 mRNA의 관리를 향상 시킬 수 있습니다에 대 한 효과적이 고 안전한 접근을 제공 합니다.
Introduction
치료 응용 프로그램에 대 한 수정 된 mRNA의 사용은 지난 몇 년 동안에에서 큰 잠재력을 보이고 있다. 심장 혈관, 염증, 그리고 monogenetic 질병에서 뿐만 아니라 백신 개발에, mRNA는 유망한 치료 에이전트1.
MRNA와 단백질 대체 요법 대상 셀2에 DNA transfection에 따라 고아 한 유전자 치료를 통해 여러 가지 이점을 제공 합니다. MRNA 함수는 cytosol에서 직접 시작합니다. 비록 플라스 미드 DNA (pDNA), 더블-좌초의 구조, 원형 발기인 지역과 치료 단백질3을 또한 행위 cytosol, 인코딩 유전자 시퀀스를 포함 하는 DNA 그것만 통합 될 수 있다 유사 분열을 겪고 있는 셀에 transfection의 때. 이 조직1,4transfected 세포의 수를 줄입니다. 특히, 심장 세포, 등 약한 유사 분열 활동 조직의 transfection 어려운5입니다. PDNA, 달리 transfection 그리고 mRNA의 번역 조직1,6에 mitotic 그리고 비 mitotic 세포에서 발생합니다. 변이 원 성 영향 또는 면역 반응7,8, 하지만 원하는 단백질의 de novo 종합 단백질 인코딩 mRNA와 세포의 transfection 후 호스트 게놈 DNA의 바이러스 성 통합 올 수 있습니다. 9,10자율적으로 시작합니다. 또한, 단백질 합성 게놈을 방해 하 고 변이 원 성 영향11위험 없이 개별 복용량을 통해 환자의 필요를 정확 하 게 조정할 수 있습니다. 합성으로 생성 된 mRNA의 면역 활성화 잠재력 의사 uridine 및 5'-methylcytidine uridine 및 cytidine12대신 사용 하 여 극적으로 낮아질 수 있습니다. 의사 uridine 수정된 mRNA 또한 증가 생물학적 안정성과 상당히 높은 변환 용량13을 보였다.
mRNA 기반 치료 임상 응용에 유망한 속성에서 이익을 얻을 수 있을, 하 셀으로 mRNA의 전송에 대 한 적합 한 차량을 만들 필수적 이다. 이 차량은 한다 곰 비 독성 속성에서 생체 외에서 그리고 vivo에서, 보호 nuclease 저하에 대 한 mRNA 하 고 장기간된 가용성 및14mRNA 번역에 대 한 충분 한 세포질 통풍 관을 제공.
Vivo에서 약물 전달, 탄소 나노튜브, 양자 점, 등 리에 대 한 모든 가능한 캐리어 종류 중에서 후자 되었습니다 공부 가장15,16. 리는 지질 bilayer10구성 된 소포. 그들은 amphiphilic는 소수 성 및 친수성 섹션, 그리고 이러한 분자의 자기 배열을 통해 구형 더블 레이어는 형성된17. 리, 내부 치료 대리인 또는 마약 수 캡슐화 되며, 따라서, 효소 저하18에서 보호. N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium 염화 (DOTMA)19를 포함 하는 리 [1, 2-비스 (oleoyloxy)-3-프로 판 (trimethylammonio)] (DOTAP)20및 dioctadecylamidoglycylspermine (개)21또는 DC-콜레스테롤22, 잘 특징 및 DNA 또는 RNA 세포 transfection에 자주 사용.
양이온 리 충전 된 지질과 충전된 인지질23구성. 양이온 리 통해 transfection 셀24,25으로 핵 산의 수송을 위한 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 양이온 지질 입자 핵 산 분자26의 등뼈에 마이너스로 충전 된 인산 염 그룹으로 복합물을 형성 한다. 이러한 소위 lipoplexes 세포 막의 표면에 부착 하 고 endocytosis 또는 endocytosis 같은 메커니즘27셀을 입력 합니다.
1989 년에 말론 외. 성공적으로 양이온 지질 중재 mRNA transfection28설명. 그러나, 그룹 DOTMA 각 세포 독성 효과28성 발견 혼합물의 DOTMA 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (마약)를 사용 하 여. 또한, Zohra 외 보여주었다 DOTAP (1, 2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-프로 판 염화) mRNA transfection 시 약29으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 세포의 효율적인 transfection에 대 한 DOTAP는 다른 시 약, fibronectin29 등 마약30와 함께에서 사용 해야 합니다. 지금까지, DOTMA 유전자 배달31사용 시장에 첫 번째 양이온 지질 이었다. 다른 지질 치료 운반대로 사용 또는 임상 시험의 다른 단계에서 테스트 되 고 있습니다 (예를 들어, EndoTAG-나 지질 운반대로 DOTAP를 포함)는 현재 단계 II 임상 시험32에서 조사 되 고.
이 작품에서는 NLps DC 콜레스테롤 및 마약의 세대에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 실행 하기 쉬운 이며 다양 한 크기의 NLps 생성 수 있습니다. 드라이 필름 메서드를 사용 하 여 NLp의 일반적인 목표는 mRNA complexation, 따라서 효율적이 고 생체 세포 transfection 생체 외에서14,33를 허용에 대 한 리를 만드는 것입니다.
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Protocol
1. 양이온 Nanoliposomes (그림 1)의 생성
- DC-콜레스테롤 (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] 콜레스테롤 염)과 마약 (dioleoyl phosphatidylethanolamine), 25 mg/mL의 최종 농도 달성 하기 위해 클로 프롬에 분말으로 전달 지질을 분해.
참고:-20 ° c.에 녹은 지질 저장 - 25 mg/mL 두 지질 재고 솔루션 사용. 녹은 DC-콜레스테롤과 유리 플라스 크에 녹아 마약의 80 µ L의 믹스 40 µ L.
참고: 총 지질 금액은 3 mg 이다. 클로 프롬의 빠른 증발을 방지 하려면 pipetting 동안 얼음에 지질을 놓습니다. - 아르곤 가스 흐름에서 15 분에 대 한 클로 프롬을 기체 화할. 그 후, a desiccator 실리 카 젤, 내부, 오픈 유리 플라스 크를 배치를 하룻밤 진공 나머지 클로 프롬, 증발 및 지질 영화 유리 플라스 크 안에 형성 되도록 적용.
참고: 빠른 작업과 불필요 한 O2 접촉을 피하십시오. - Nuclease 무료 물과 소용돌이 15 분 (그림 2A)에 대 한 서 스 펜 션의 1 mL와 함께 형성된 된 지질 영화 리하이드레이션 그 후, 1 h (그림 2B)에 대 한 쥡니다 목욕으로 정지를 놓습니다.
참고: 중단 약간 흐린 것입니다. - 제조업체의 지침에 따라 미니 압출 조립, 주사기 지질 중단와 압출 기의 양쪽에 채워진된 주사기와 빈 주사기를 놓습니다. X-서 스 펜 션 (그림 2C)을 돌출 하려면 25 x 20 다른 한 주사기에서 막 통해 지질 정지를 누릅니다.
참고:는 NLps의 크기는 사용 하는 막의 기 공 크기에 의해 결정 됩니다. - 추가 사용 때까지 4 ° C에서 유리 플라스 크에는 NLps를 저장 합니다.
참고: 장기간된 보관 시간 후는 NLps 두어야 한다 다시 15 분 동안 쥡니다 목욕에 35 kHz 복잡 한 형성을 우회 하 여.
2. 생체 외에서 합성 mRNA의 전사
- EGFP 인코딩 준비 mRNA는 프로토콜에 따라 출판 이전34.
- 앞으로의 0.7 µ M와 플라스 미드에서 eGFP 시퀀스를 증폭 (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3')와 역 (5'-T120 CTT CTT 법 CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3') 뇌관과는 중 합 효소는 PCR와 키트.
- 20 µ L 중 합 효소 키트에서 5 배 혼합의 뿐만 아니라 DNA (자료 테이블)의 녹는 동작을 변경 하는 상업 버퍼 솔루션의 20 µ L를 혼합. 각 (정방향 및 역방향) 뇌관의 7 µ L를 추가 합니다.
- 추가 25 중 합 효소 키트에서 혼합물을 중 합 효소의 2 µ L eGFP 플라스 미드의 ng.
참고: 솔루션에 pipetting 전에 얼음에 중 합 효소를 유지. - 추가 nuclease 무료 H2O 100 µ L의 볼륨까지 혼합물에.
- 표1에서 프로토콜을 따르고 thermocycler에서 PCR 주기를 실행 합니다.
- PCR 정화 키트 eGFP 인코딩 DNA 시퀀스를 정화.
- 따라서, 바인딩 버퍼 키트에서 500 µ L를 PCR 솔루션을 혼합 하 고 정화 열을 채우기 위해 그것을 사용 하 여.
- 1 분 동안 최대 속도로 열을 원심 고는 여과 액을 버리고.
- 워시 버퍼 나 열, 최대에 다시 원심 분리기에 1 분 동안 속도 삭제는 filtrate의 750 µ L를 추가 합니다.
- 원심 분리기 단계 1 x 열 필터에서 버퍼를 제거를 반복 합니다.
- 신선한 1.5 mL 튜브에 열을 전송.
- 20 µ L nuclease 무료 H의 추가 열에2O 1 분 및 최대 속도에서 1 분 동안 원심 분리기에 품 어. 이 단계를 반복 합니다.
- Photometer와 DNA의 농도 측정 하 고-20 ° c.에 그것을 저장합니다
- 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 DNA 품질 분석을 수행 합니다. 트리 스-Borate-EDTA (TBE) 버퍼에 agarose의 0.5 g을 추가 하 고 열 고 열에 전자 레인지에는 agarose는 완전히 녹아 때까지.
- 액체 agarose 젤 얼룩이 솔루션의 5 µ L 추가, 솔루션 젤 실로 젤 생산 될 때까지 기다립니다.
- 염료와 채워 12 µ L. 최종 볼륨까지 젤 우물에 DNA 샘플으로 DNA 사다리를 플라스틱 100 V에 1 시간에 대 한 전기를 실행 로드 x 6의 2 µ L로 DNA의 믹스 200 ng
- 젤 아래 자외선 젤 분석 역을 사용 하 여 분석 합니다.
- 녹음 방송 생체 외에서 생체 외에서 전사 키트 포함 T7 중 합 효소 DNA 순서에서 mRNA를 생성 하 실행 하 고 대체 Ψ UTP와 메 틸 CTP UTP와 CTP의 수정 된 뉴클레오티드.
- 생체 외에서 전사에 대 한 다음 표 2재료를 섞는다.
참고: 대체 1.5 µ L 1시 10분으로 메 틸 CTP의 Cy3 CTP nuclease 무료 H에 희석 eGFP 생체 외에서 녹음 하는 동안2O mRNA는 mRNA의 Cy3 라벨을 달성 하기 위해. - 37 ° c.에 4 h IVT 반응 혼합을 품 어
- 추가 1 µ L DNase의 T7 중 합 효소에서 내가 키트 및 DNA 템플렛 소화 37 ° C에서 15 분 동안 품 어.
- 생체 외에서 전사에 대 한 다음 표 2재료를 섞는다.
- 정화는 mRNA, RNA 청소 키트를 사용 합니다.
- IVT 믹스 nuclease 무료 h 100 µ L의 볼륨을 채워2o.
- 아래로 pipetting으로 350 µ L의 세포의 용 해 버퍼와 믹스를 추가 합니다.
- 100% 에탄올의 250 µ L을 추가 하 고 다시 혼합. 정리 열으로 혼합 플라스틱
- 원심 분리기 15 g 및 삭제는 filtrate x 8000에서 s.
- 열, 15에 대 한 다시 원심 분리기에 세척 버퍼의 500 µ L를 추가 8000 x g및 제거는 filtrate에 s.
- 1 열 워시 워시 버퍼 및 8000 x g2 분에 대 한 원심 분리기의 500 µ L x.
- 신선한 1.5 mL 반응 관에 열을 이동 합니다. 2 mRNA elute nuclease 없는 H의 20 µ L의 1 분 외피에 의해 x2O 열 막에 최대 속도에서 1 분 원심 분리 하 여 다음.
- Dephosphorylation 키트를 사용 하 여 mRNA에서 인산 염 그룹을 제거 합니다. 4.5 µ L 10 x 인산 가수분해 효소 버퍼의와 인산 가수분해 효소의 1 µ L는 mRNA를 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어
- 정화는 mRNA 다시 다음 단계 2.5.1-2.5.7.
- Photometer와 mRNA concertation를 측정 합니다.
- 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 순도 분석 하는 mRNA의 크기. 따라서, 같이 2.3.9-2.3.10에 설명 된 대로 agarose 젤을 준비 합니다.
- 혼합 3.3 µ L formamide, 37% 포름알데히드의 1 µ L, 남자, x 10의 1 µ L 200 염료 로드 x 6의 1.7 µ L의 mRNA의 ng nuclease 무료 H 10 µ L까지 채우는 각 샘플 및 RNA 마커2O.
- MRNA 변성 65 ° C에서 10 분 동안 혼합 품 어. MRNA와 RNA 마커 젤의 우물을 로드 하 고 100 V에 1 시간을 위한 젤을 실행.
- 자외선과 젤 의사 역을 사용 하 여 젤 분석.
3입니다. 합성 mRNA의 complexation
- 얼음, 합성 mRNA를 녹여 소용돌이, 그리고 원심 분리기 튜브를 열기 직전.
- 합성 mRNA의 믹스 10 µ L (mRNA 농도 100 ng / µ L) 1 µ L, 2.5 µ L, 5 µ L, 10 µ L, 또는 NLp 중지 20 µ L (NLp 집중력은 3 mg/mL). 짧게 원심 및 nanolipoplex 형성에 대 한 실 온 (RT)에서 20 분 동안 품 어.
참고: pipetting으로 혼합 하지 마십시오. 이 볼륨의 손실로 이어질 수 있습니다. 곧 철저 한 혼합에 대 한 소용돌이입니다. - 일반 셀 매체의 1 mL는 nanolipoplexes를 추가 하 고 아래로 pipetting으로 그들을 혼합.
4. Nanoliposomes의 캡슐화 효율의 분석
- RNA 정량화 키트를 사용 하 여 캡슐화 실험을 수행.
- 높은 범위에 대 한 형광 염료 1: 200와 낮은 범위 분석 결과 대 한 1:2,000를 diluting 하 여 작업 솔루션을 준비 합니다.
참고: 얼음에 형광 염료를 녹여. 사용 하기 전에 직접 작업 솔루션을 준비 합니다. - 높은 범위와 낮은 범위 표준 곡선의 eGFP 2 µ g/mL 재고 솔루션의 1 mL를 사용 하 여 준비 mRNA nuclease 무료 h에서2o.
참고: 표준 곡선에 대 한 사용 하 여 캡슐화 실험에 사용 될 mRNA. - 표 3 를 사용 하 여 높은 범위 표준 (20 ng/mL-1 µ g/mL)의 준비에 대 한.
- 낮은 범위 표준 희석 2 µ g/mL eGFP mRNA 재고 솔루션 1:20 100 ng/mL의 최종 농도 달성 하기 위해. 표 4에 설명 된 대로 낮은 범위 표준 (1 ng/mL-50 ng/mL)를 준비 합니다.
- 1 µ g의 eGFP 결합 mRNA (10 µ L) 및 NLps의 7.5 µ g (2.5 µ L) 및 실시간에 20 분 동안 품 어
참고: 계속을 저하를 피하기 위해 얼음에 mRNA. - Nuclease 없는 H의 1 mL을 추가 양식 nanolipoplexes을 위아래로 pipetting으로 믹스2O.
- 캡슐화 된 샘플을 표준 1: 200 또는 1:2,000 RNA 형광 염료 작업 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 어둠 속에서 RT에 5 분 동안 품 어.
- 표준 및 샘플 중복에 검은 96 잘 접시에 플라스틱 및 530에서 형광 측정 microplate 리더 (그림 3) nm.
5입니다. 세포 Transfection에 대 한 준비
- 플레이트 1.5 x 105 A549 세포/12-잘 접시 transfection 이전 1 d의 잘.
- Transfection 전에 24 h에 대 한 일반 셀 매체 (DMEM/높은 포도 당 10% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS], 2 m m L-글루타민, 1% 페니실린/스와 함께)에서 37 ° C, 5% CO2 에서 셀을 품 어.
6입니다. 세포의 transfection
- 준비는 세척 세포를 1 mL/잘 PBS 1 x (Ca 없이2 +Mg2 +).
- 1 µ g의 eGFP mRNA 캡슐 1 µ L, 2.5 µ L, 5 µ L, 10-µ L, 또는 20 µ L NLps A549 세포와 준비 된 접시의 한 우물을 포함 하는 준비 nanolipoplex 혼합물의 1 mL를 추가 합니다.
- Nanolipoplex 현 탁 액 셀에 추가 하 고 일반 조건 transfection 효능을 분석 하는 24 시간 또는 24 시간 및 transfection 후 세포 생존 능력 분석을 72 h에 품 어.
참고: Transfection NLps와 중간 변화를 필요 하지 않습니다.
7. 세포 Transfection 효능 Cytometry 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석
- 제거는 상쾌한 1 mL로 세포 세척/나머지 NLps 제거 (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +) PBS를 잘.
- Cytometry에 대 한 셀을 준비 합니다.
- Trypsinize 500 µ L/잘 트립 신/EDTA (0.05%) 3 분 중지에 대 한 37 ° C에를 가진 세포는 과정 하 고 일반 FBS 포함 된 매체의 동일한 금액 (500 µ L/잘)을 추가 하 여는 트립 신을 비활성화.
- 400 x g 에 5 분에 대 한 셀을 원심 고 셀 펠 릿을 건드리지 않고는 상쾌한을 조심 스럽게 제거.
- 1 mL의 PBS로 세포 세척 (Ca 없이2 +Mg2 +).
- Resuspend 1 x 고정 솔루션의 300 µ L에서 세포 고 흐름 cytometry 튜브로 셀을 전송.
- 488에서 세포 분석 흐름 cytometer (그림 4A)에 nm.
참고: 소용돌이 측정 하기 전에 직접 x 1 셀.
- 형광 현미경 검사 법에 대 한 셀을 준비 합니다.
- 1 mL/음 100% 메탄올,-20 ° c.에 이전에 저장 된 셀 수정
- 추가 500 µ L/잘 300 nM DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) (없이 캘리포니아2 +/Mg2 +) PBS에 녹이 고 어둠 속에서 5 분 동안 품 어.
- DAPI 솔루션을 제거 하 고 다시 100% 메탄올-20 ° c.에 저장 된 셀 세척
- 형광 현미경 (그림 4B)를 사용 하 여 셀을 분석 합니다.
참고: 사용 하 여 다음 여기/방출 파장: eGFP 488/509 nm, DAPI 358/461, 및 Cy3 550/570 nm.
8. 세포 생존 능력 분석 실험
- (페 놀 레드) 없이 RPMI의 1 mL에 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드)의 5 mg을 디졸브.
참고: 녹은 MTT 해야 더 희석된 1시 10분 (최종 농도: 0.5 mg/mL) 사용 하기 전에 RPMI에. - 씻어 transfected 세포 3 x 1 mL/잘 PBS (Ca2 +/Mg2) 없이.
참고: 일반 셀 매체의 수 완전히 제거 한다. - 추가 1시 10분의 500 µ L/잘 셀에 MTT 솔루션을 희석 하 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어
- 부 화 후 셀에서 MTT 솔루션을 제거 하 고 추가 500 µ L/잘 DMSO (디 메 틸 sulfoxide). 37 ° c.에서 10 분 동안 다시 품 어
- 세 쌍둥이에서 DMSO 솔루션 클리어 아래 96 잘 접시에 플라스틱 및 540에 흡착 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.
- 100% 치료 세포의 생존 능력을 설정 하 고 치료 제어 셀 (그림 5)에 비해 다른 그룹의 세포 생존 능력 계산.
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Representative Results
설명 된 대로 프로토콜을 사용 하 여, DC-콜레스테롤과 마약 지질 구성 된 NLps 드라이 필름 방법 (그림 1)를 사용 하 여 준비 되었다. 준비를 하는 동안 nanoliposome 솔루션 탁 (그림 2)에서 다른 단계를 보여 줍니다.
NLps의 캡슐화 효능 다음 mRNA, 캡슐화 되지는 RNA 정량화 키트 (그림 3)를 사용 하 여 무료 금액을 분석 하 여 eGFP 인코딩 mRNA의 1 µ g의 캡슐 후 분석할 수 있습니다.
EGFP NLps, 형성된 nanolipoplexes 서로 다른 양의 mRNA 세포와 알을 품 수의 캡슐화 후 체 외에서 고 eGFP 표현 세포의 비율 분석 될 수 있다 교류 cytometry 24 h posttransfection (그림 4A)를 사용 하 여 . Nanoliposome 솔루션의도 1 µ L 셀 체 외의 높은 transfection를 달성 하기 위해 충분 하다. 셀 NLps Cy3 표시 eGFP 포함와 페는 때 mRNA를 세포질 (레드 형광), 이미 생산된 eGFP 단백질 (녹색 형광)에 있는 mRNA 수 eGFP 존재 시각 (그림 4B).
Nanolipoplexes를 사용 하 여 세포의 transfection는 셀에 불리 한 영향을 미칠 수, 세포의 생존 24 h (그림 5A) 테스트 했다 및 72 h (그림 5B) posttransfection. 세포 생존 능력에 아무 효과 셀 NLps 또는 nanolipoplexes, 2.5 또는 5 µ L로 각각 치료 했다 때 검출 될 수 있는.
그림 1: 양이온 nanoliposomes의 제조 프로세스의 도식 개요. 첫째, 녹아 지질 DC-콜레스테롤과 마약 유리 플라스 크에 함께 혼합 되어야 한다. 둘째, 보이는 클로 프롬 액체 아르곤 증발 한다 또는 질소 가스 흐름 및 클로 프롬 남은 하룻밤 사이에 진공 증발을 허용 한다. 셋째, 유리 플라스 크의 바닥에 형성된 된 지질 영화 nuclease 무료 h rehydrated 한다2O, multilamellar 리를 형성 하는 vortexing에 의해 따라. 통해 쥡니다 liposome 솔루션의 압출, 준비-사용 unilamellar NLps 생산 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 제조 과정 중 여러 단계에서 nanoliposome 솔루션. (A)이이 그림 지질 영화와 (B)는 쥡니다 1 h (C) 목욕 후 뿐만 아니라 15 분, vortexing의 재 후 직접 liposome 솔루션 다음 압출의 25 주기를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 캡슐화 된 nanoliposomes의 효능. 이 패널 표시 무료 eGFP의 정량화 NLps에 캡슐화 후 mRNA. 결과 ± SEM을 의미 하는 대로 표시 됩니다 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Transfection는 nanolipoplexes의 효능. (A)이이 패널 transfection eGFP mRNA 24 h posttransfection의 1 µ g를 캡슐화 하기 위해 서로 다른 양의 NLps 사용 하 여에 대 한 최고의 mRNA/nanoliposome 비율의 결정을 보여줍니다. (B)이이 패널 표시 Cy3 표시 된 합성 mRNA에 2.5 µ L의 검출 NLps와 셀 24 h posttransfection의 eGFP 식 (눈금 막대 = 50 µ m). 결과 ± SEM을 의미 하는 대로 표시 됩니다 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: nanoliposomes와 캡슐화 된 mRNA transfection 후 생존 세포. 이 창에 표시 한 MTT 분석 결과 (A) 24 시간 및 (B) 72 h posttransfection을 사용 하 여 세포 생존 능력의 측정. 결과 ± SEM을 의미 하는 대로 표시 됩니다 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 단계 | ° C에 온도 | 기간 |
| 1 | 95 | 5 분 |
| 2 | 94 | 15 s |
| 3 | 55 | 1 분 |
| 4 | 72 | 1 분 |
| 5 | 2 30 이동 x | |
| 6 | 72 | 10 분 |
| 7 | 4 | 보류 |
표 1: PCR 주기 DNA 확대를 위한 프로토콜.
| 농도 | 금액 | |
| ATP | 7, 5 m m | 4 Μ L |
| GTP | 1875 mM | 1 Μ L |
| 5'-Methylcytidin | 7, 5 m m | 3 Μ L |
| Ψ | 7, 5 m m | 3 Μ L |
| ARCA | 2, 5 m m | 10 Μ L |
| DNA 템플렛 | 1.5 µ g | |
| 버퍼 믹스 | 1 x | 4 Μ L |
| T7 효소 혼합 | 4ΜL | |
| RNase 억제제 | 1 Μ L | |
| Nuclease 무료 물 | 최대 40 µ L를 채우기 | |
표 2: 에 대 한 혼합은 생체 외에서 mRNA에 DNA의 녹음 방송.
| 양의 nuclease 무료 H2O (µ L) | 양의 eGFP mRNA 높은 범위 재고 솔루션 (µ L) | 볼륨 1: 200 형광 염료 (µ L)의 | 최종 농도 (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 1000 |
| 50 | 50 | 100 | 500 |
| 90 | 10 | 100 | 100 |
| 98 | 2 | 100 | 20 |
| 100 | 0 | 100 | 빈 |
표 3: 높은 범위 표준 곡선에 대 한 프로토콜.
| 양의 nuclease 무료 H2O (µ L) | 양의 eGFP mRNA 범위가 낮은 재고 솔루션 (µ L) | 볼륨 1: 2000 형광 염료 (µ L)의 | 최종 농도 (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 50 |
| 50 | 50 | 100 | 25 |
| 90 | 10 | 100 | 5 |
| 98 | 2 | 100 | 1 |
| 100 | 0 | 100 | 빈 |
표 4: 낮은 범위 표준 곡선에 대 한 프로토콜.
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Discussion
제시 프로토콜 종합적 수정된 mRNA에 대 한 높은 캡슐화 효능 NLps의 세대 뿐만 아니라 세포에 생체 외에서의 신뢰할 수 있는 transfection에 설명합니다. 또한,는 NLps 차례로 셀 내부 기능적인 단백질으로 번역은 mRNA의 출시를 보장 합니다. 또한, NLps를 사용 하 여 transfections 일반 세포 매체에서 수행할 수 있습니다, 그리고 높은 결과 viabilities 동안 transfection, 세포 transfection 후 최대 3 일.
MRNA는 치료로 사용 하려면 자동 조립 시스템의 배달에 대 한 선호 이다. 가장 일반적인 transfection 시 약 양이온 지질, 리 등이 포함 됩니다. 로 리는 긍정적으로 충전, 부정적으로 위탁 된 핵 산 수 캡슐화 될, 그들의 세포 막 극복된35수의 정전기 반발 작용을 하므로. 양이온 지질 DC-콜레스테롤은 이미 이전 연구에서 설명 안정적이 고 생체 차량36로. 중립 지질 추가 마약 향상 된 transfection 효능37이끌어 낸다. 개요 장점 고려 위에서 언급 한, 이러한 지질 NLps의 준비에 대 한 선정 됐다. 또한, 이전 연구는이 두 지질 사용 바람직합니다 다른 부정적으로 위탁 된 핵 산38는 증가 세포 transfection 속도 때문 증명 하고있다.
NLps 및 nanolipoplexes의 성공적인 세대에 대 한 일부의 단계에 유의 중요 하다. O2에서 nanoliposome 세대의 절차를 실시 한다-무료 조건. NLp 생성 하는 동안 O2 의 존재는 인지질 및 감소 재현성39의 저하로 이어질 수 있습니다. 또한, 수정에도 불구 하 고 mRNA nucleases 통해 저하에 관하여 아주 과민 하다. 따라서, 지질 영화 재 대 한 RNase 무료 H2O의 사용이 좋습니다는 complexation 동안 mRNA 저하를 방지 하기 위해. 또한, RNase 무료 조건 nanolipoplexes의 스토리지에 대 한 보장 되어야 합니다.
또한, NLps 불안정 열역학 시스템 때문에 시간이 지남에 집계를 형성할 수 있습니다. 영향을 미치는 매개 변수 저장 온도40리 표면 충전 포함 됩니다. NLp 집계 liposome 막 불안 및 mRNA 세포 외 공간에서 가난한 transfection 효능과 mRNA 저하로 이어지는41, 해제 하는 원하지 않는의 위험에 발생할 수 있습니다. 그러나, 이전 표시, nanolipoplexes 집계 또는 transfection 효능35의 손실 없이 최대 6 개월까지 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
마약 캐리어 시스템으로 서 리를 사용 하 여 두 약물 전달의 중요 한 문제 해결할 수 있습니다. 리 저하에서 캡슐화 된 약물을 보호 하 고 수 동적 대상 조직 간 또는 골16같은 불연속 피를 수 있습니다. 치료 핵 산, 입자 크기 및 캡슐화 같은 매개 변수 전달에 대 한 용량은 자주 차량의 평가 및 세포질 통풍 관에 대 한 중요 합니다. 특히, 나노미터 스케일에 리의 크기 세포 막42 와 함께 상호 작용을 허용 하 고, 그로 인하여 이다, vivo에서 사용 나중에 대 한 중요 한. 첫째, 리는 신장과 간 시스템43를 통해 허가 피하기 위해 충분히 작은 되어야 합니다. 둘째, liposome 크기는 원하는 장기의 세포를 대상으로 혈관의 벽을 극복 하는 데 도움이 됩니다. 그것은 리 100-300 nm의 크기 범위에서 효율적으로 transfect hepatocytes44; 수 있었다 보고 했다 그러나, 대형 리 (예를 들어, 400 nm)45내 피 방 벽 극복 하지 못했습니다.
설명된 방법은 mRNA 배달을 위해 설립 되었습니다, 하지만 그것 또한 예측에 관한 같은 다른 핵 산 치료제에 구현할 수 있습니다. 최근 연구에서 우리는 예측에 관한 126 선택적으로 타겟팅 할 수 있습니다, 따라서, 복 부 대동맥 동맥 류 개발 효과적으로 막 았된46수를 증명 하고있다. DNA/RNA 치료제 세포와 직접 접촉으로 올 때 혈소판 활성화 등의 부작용이 발생할 수 있습니다, 리 내 포장 피할 수 있다, 따라서 그것은 더 유리한47렌더링. 따라서, 여기에 제시 된 메서드는 매우 다양 한 이며 많은 질병에 대 한 약물 전달 설계에 사용할 수 있습니다. 설립된 프로토콜 뿐만 아니라 정의 된 크기와 효율적인 mRNA 캐리어의 신속 하 고 비용 효율적인 생성을 허용 하지만 또한 지질 제제는 특정 응용 프로그램의 필요에 따라 사용자 지정 가능성을 제공 합니다: (1)의 크기는 리는; 필터를 변경 하 여 쉽게 변경할 수 있습니다. (2) 충전 된 리의 표면을 사용 하 여, 예를 들어 폴 리 에틸렌 글리콜, vivo에서 응용 프로그램48동안 안정성과 지연 혈액 클리어런스를 증가 수정 될 수 있습니다. 특정 항 체는 리에의 바인딩 캡슐화 된 약49의 타겟된 배달을 허용합니다. 추가 검사 및 물리적 특성에 대 한 자세한 통찰력, 프로토콜 여전히 시 향상 시킬 수 있습니다.
리의 생성에 대 한 세 가지 일반적인 방법을 사용할 수 있습니다: 드라이 필름, 에탄올 주입 및 역 상 증발. 양 외에 연구,이 세 가지 제조 기술 했다35비교. 정의 된 크기와 솔루션에는 동등 하 게 분배 리 드라이 필름 메서드를 사용 하 여 생성 될 수 있습니다 발견 했다. 드라이 필름 절차에서 실시 하는 또한,이 연구 결과 200의 정의 된 크기와 NLps의 생산에, 균질 배급, 및 높은 캡슐화 용량.
한 손에 리의 포지티브 차지 증가 캡슐화 용량 및 더 나은 셀 표면 퓨전50,51,52, 리드 하지만 다른 한편으로, 그것은 세포 막 불안정 하 고 활성화 수 있습니다. 다른 면역 활성화 경로 그리고 세포 죽음27,53. 그러나, 양이온 지질 apoptotic 속성 도우미 지질 마약54,55를 사용 하 여 최소화할 수 있습니다. 장 외에의해 연구에서 liposome 생성 하는 동안 DC 콜레스테롤 및 마약 1:2 비율 핵 산38을 사용 하 여 가장 효율적인 세포 transfection에 이르게 발견 했다. 현재 연구에서 구현 하는 방법에 지질 영화 준비 하는 동안 지질 비율 1:2 DC-콜레스테롤, 마약의 혼합된 지질 서 스 펜 션에 사용 되 고 준비 된 리 led 높은 transfection 효능, 동시에, 높은 셀 생존 능력입니다. 비슷한 결과 또한 Ciani56 Farhood37등 다른 연구자에 의해 발견 됐다.
전반적으로, 리 임상 시험, 훌륭한 생체 적합성 및 낮은 독성 vivo에서 년 동안 사용 되었습니다. MRNA와 함께, NLps 드 노 보 원하는 단백질의 합성을 유도 하에 세포 나 장기에서 생체 외에서 그리고 vivo에서, mRNA의 효율적인 배달을 위해 사용할 수 있습니다. 치료 응용 프로그램, 관련 nanolipoplexes에에서 사용 될 수, 예를 들어 경 피 세포 재생을 활성화 하기 위해 mRNA 배달57 또는 스프레이 상처 치유 패치 폐의 치료에 대 한 mRNA58 nebulization에 대 한 질병59,60 낭 성 섬유 증 등.
제시 프로토콜 NLps 드라이 필름 메서드를 생체 외에서 의 효율적인 캡슐화에 사용할 수 있습니다 사용의 발생에 대 한 쉬운 접근 방법 복사할 mRNA와 셀의 안전 transfection 보장 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
없음
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
| Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
| Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
| RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
| Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |
References
- Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Devoldere, J., Dewitte, H., De Smedt, S. C., Remaut, K. Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger. Drug Discovery Today. 21 (1), 11-25 (2016).
- Laguens, R. P., Crottogini, A. J. Cardiac regeneration: the gene therapy approach. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (4), 411-425 (2009).
- Hadas, Y., Katz, M. G., Bridges, C. R., Zangi, L. Modified mRNA as a therapeutic tool to induce cardiac regeneration in ischemic heart disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 9 (1), (2017).
- Zohra, F. T., Chowdhury, E. H., Akaike, T. High performance mRNA transfection through carbonate apatite-cationic liposome conjugates. Biomaterials. 30 (23-24), 4006-4013 (2009).
- Youn, H., Chung, J. -K. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1337-1348 (2015).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of Biological Engineering. 8 (1), 8 (2014).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Michel, T., Wendel, H. -P., Krajewski, S. Next-generation Therapeutics: mRNA as a Novel Therapeutic Option for Single-gene Disorders. Modern Tools for Genetic Engineering. Kormann, M. , IntechOpen. 3-20 (2016).
- Karikó, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research. 38 (17), 5884-5892 (2010).
- Michel, T., et al. Cationic Nanoliposomes Meet mRNA: Efficient Delivery of Modified mRNA Using Hemocompatible and Stable Vectors for Therapeutic Applications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 8 (September), 459-468 (2017).
- Tran, M. A., Watts, R. J., Robertson, G. P. Use of Liposomes as Drug Delivery Vehicles for Treatment of Melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research. 22 (4), 388-399 (2009).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Ross, P. C., Hui, S. W. Lipoplex size is a major determinant of in vitro lipofection efficiency. Gene Therapy. 6 (4), 651-659 (1999).
- Xing, H., Hwang, K., Lu, Y. Recent Developments of Liposomes as Nanocarriers for Theranostic Applications. Theranostics. 6 (9), 1336-1352 (2016).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
- Leventis, R., Silvius, J. R. Interactions of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (1), 124-132 (1990).
- Behr, J. P., Demeneix, B., Loeffler, J. P., Perez-Mutul, J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (18), 6982-6986 (1989).
- Gao, X., Huang, L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 280-285 (1991).
- Martin, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current Pharmaceutical Design. 11 (3), 375-394 (2005).
- Yang, S. Y., et al. Comprehensive study of cationic liposomes composed of DC-Chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 101, 6-13 (2013).
- Bennett, M. J., Nantz, M. H., Balasubramaniam, R. P., Gruenert, D. C., Malone, R. W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. Bioscience Reports. 15 (1), 47-53 (1995).
- Son, K. K., Patel, D. H., Tkach, D., Park, A. Cationic liposome and plasmid DNA complexes formed in serum-free medium under optimum transfection condition are negatively charged. Biochimica et Biophysica Acta. 1466 (1-2), 11-15 (2000).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic lipids activate intracellular signaling pathways. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (15), 1749-1758 (2012).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6077-6081 (1989).
- Zohra, F. T., Maitani, Y., Akaike, T. mRNA delivery through fibronectin associated liposome-apatite particles: a new approach for enhanced mRNA transfection to mammalian cell. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 35 (1), 111-115 (2012).
- Rejman, J., Tavernier, G., Bavarsad, N., Demeester, J., De Smedt, S. C. mRNA transfection of cervical carcinoma and mesenchymal stem cells mediated by cationic carriers. Journal of Controlled Release. 147 (3), 385-391 (2010).
- Balazs, D. A., Godbey, W. Liposomes for use in gene delivery. Journal of Drug Delivery. 2011, 326497 (2011).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
- Abraham, M. K., et al. Nanoliposomes for Safe and Efficient Therapeutic mRNA Delivery: A Step Toward Nanotheranostics in Inflammatory and Cardiovascular Diseases as well as Cancer. Nanotheranostics. 1 (2), 154-165 (2017).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e51943 (2014).
- Yang, S., Chen, J., Zhao, D., Han, D., Chen, X. Comparative study on preparative methods of DC-Chol/DOPE liposomes and formulation optimization by determining encapsulation efficiency. International Journal of Pharmaceutics. 434 (1-2), 155-160 (2012).
- Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. European Biophysics Journal. 41 (10), 815-829 (2012).
- Farhood, H., Serbina, N., Huang, L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer. Biochimica et Biophysica Acta. 1235 (2), 289-295 (1995).
- Zhang, Y., et al. DC-Chol/DOPE cationic liposomes: a comparative study of the influence factors on plasmid pDNA and siRNA gene delivery. International Journal of Pharmaceutics. 390 (2), 198-207 (2010).
- Klein, R. A. The detection of oxidation in liposome preparations. Biochimica et Biophysica Acta. 210 (3), 486-489 (1970).
- Ming-Ren Toh, G. N. C. C. Liposomes as sterile preparations and limitations of sterilisation techniques in liposomal manufacturing. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 8 (2), 88-95 (2013).
- Torchilin, V. P., Omelyanenko, V. G., Lukyanov, A. N. Temperature-dependent aggregation of pH-sensitive phosphatidyl ethanolamine-oleic acid-cholesterol liposomes as measured by fluorescent spectroscopy. Analytical Biochemistry. 207 (1), 109-113 (1992).
- Rabinovich, P. M., Weissman, S. M. Cell engineering with synthetic messenger RNA. Methods in Molecular Biology. 969, 3-28 (2013).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H.
- Freise, J., Muller, W. H., Brolsch, C., Schmidt, F. W. "In vivo" distribution of liposomes between parenchymal and non parenchymal cells in rat liver. Biomedicine. 32 (3), 118-123 (1980).
- Roerdink, F., Dijkstra, J., Hartman, G., Bolscher, B., Scherphof, G. The involvement of parenchymal, Kupffer and endothelial liver cells in the hepatic uptake of intravenously injected liposomes. Effects of lanthanum and gadolinium salts. Biochimica et Biophysica Acta. 677 (1), 79-89 (1981).
- Wang, X., et al. Dual-Targeted Theranostic Delivery of miRs Arrests Abdominal Aortic Aneurysm Development. Molecular Therapy. 26 (4), 1056-1065 (2018).
- Flierl, U., et al. Phosphorothioate backbone modifications of nucleotide-based drugs are potent platelet activators. Journal of Experimental Medicine. 212 (2), 129-137 (2015).
- Woodle, M. C. Controlling liposome blood clearance by surface-grafted polymers. Advanced Drug Delivery Reviews. 32 (1-2), 139-152 (1998).
- Sawant, R. R., Torchilin, V. P. Challenges in development of targeted liposomal therapeutics. The AAPS Journal. 14 (2), 303-315 (2012).
- Ewert, K. K., Evans, H. M., Bouxsein, N. F., Safinya, C. R. Dendritic cationic lipids with highly charged headgroups for efficient gene delivery. Bioconjugate Chemistry. 17 (4), 877-888 (2006).
- Elouahabi, A., Ruysschaert, J. M. Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Molecular Therapy. 11 (3), 336-347 (2005).
- Hoekstra, D., Rejman, J., Wasungu, L., Shi, F., Zuhorn, I. Gene delivery by cationic lipids: in and out of an endosome. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 1), 68-71 (2007).
- Lonez, C., Vandenbranden, M., Ruysschaert, J. M. Cationic liposomal lipids: from gene carriers to cell signaling. Progress in Lipid Research. 47 (5), 340-347 (2008).
- Filion, M. C., Phillips, N. C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1329 (2), 345-356 (1997).
- Takano, S., Aramaki, Y., Tsuchiya, S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. Pharmaceutical Research. 20 (7), 962-968 (2003).
- Ciani, L., et al. DOTAP/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes for gene delivery studied by circular dichroism and other biophysical techniques. Biophysical Chemistry. 127 (3), 213-220 (2007).
- Benson, H. A. Elastic Liposomes for Topical and Transdermal Drug Delivery. Methods in Molecular Biology. 1522, 107-117 (2017).
- Johler, S. M., Rejman, J., Guan, S., Rosenecker, J. Nebulisation of IVT mRNA Complexes for Intrapulmonary Administration. PLoS One. 10 (9), e0137504 (2015).
- Mays, L. E., et al. Modified Foxp3 mRNA protects against asthma through an IL-10-dependent mechanism. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1216-1228 (2013).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
