Summary
Aqui descrevemos um protocolo para a geração de nanoliposomes catiônico, o qual se baseia o método seco-filme e pode ser usado para o cofre e entrega eficiente do in vitro transcrito de RNA mensageiro.
Abstract
O desenvolvimento do RNA mensageiro (mRNA)-com base em terapêutica para o tratamento de várias doenças se torna cada vez mais importante devido o positivo Propriedades in vitro transcrito (IVT) mRNA. Com a ajuda de IVT mRNA, a síntese de novo de uma proteína desejada pode ser induzida sem alterar o estado fisiológico da célula alvo. Além disso, a biossíntese de proteínas pode ser controlada precisamente devido ao efeito transiente de mRNA IVT.
Para a eficiente transfecção de células, nanoliposomes (NLps) pode representar um veículo de entrega segura e eficiente para a terapêutica do mRNA. Este estudo descreve um protocolo para gerar segura e eficiente catiônica NLps consistindo de DC-colesterol e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga) como um vetor de entrega para IVT mRNA. NLps tendo um definido tamanho, uma distribuição homogénea e uma capacidade de complexação de alta e pode ser produzidos usando o método seco-filme. Além disso, apresentamos os sistemas de teste diferente para analisar sua complexação e eficácias de transfeccao usando sintética reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) mRNA, bem como seus efeitos sobre a viabilidade celular. No geral, o protocolo apresentado fornece uma abordagem eficaz e segura para complexação de mRNA, que pode avançar e melhorar a administração de terapêutica mRNA.
Introduction
O uso de mRNA modificados para aplicações terapêuticas tem mostrado grande potencial no último par de anos. Em doenças cardiovasculares, inflamatórias e eurogenética, bem como no desenvolvimento de vacinas, o mRNA é um promissor agente terapêutico1.
Terapia de reposição de proteína com mRNA oferece diversas vantagens sobre a terapia de gene clássica, que se baseia a transfeccao de ADN em células alvo2. A função do mRNA inicia diretamente no citosol. Embora o plasmídeo de DNA (pDNA), uma construção de dupla-hélice, circular DNA contendo uma região promotora e uma sequência de genes codificação da proteína terapêutica3, também atos no citosol, pode apenas ser incorporado em células que estão passando por mitose no momento do transfection. Isso reduz o número de células transfectadas em tecido1,4. Especificamente, o transfeccao de tecidos com atividade fraca mitose, como as células cardíacas, é difícil5. Em contraste com pDNA, a transfeccao e tradução do mRNA ocorrem em células mitóticas e não-mitótica no tecido1,6. A integração viral do DNA no genoma do hospedeiro pode vir com efeitos mutagénicos ou reações imunes7,8, mas depois a transfecção de células com um mRNA de codificação de proteínas, a síntese de novo da proteína desejada começa-se autonomamente9,10. Além disso, a síntese de proteína pode ser ajustada precisamente a necessidade do paciente através de doses individuais, sem interferir com o genoma e arriscar efeitos mutagénicos11. O potencial imunológico-ativando de mRNA sinteticamente gerado poderia ser drasticamente reduzido usando pseudo uridina e 5'-methylcytidine em vez de uridina e citidina12. Uridina pseudo mRNA modificados também foi mostrado para ter uma maior estabilidade biológica e um significativamente maior capacidade translacional13.
Para poder beneficiar das propriedades promissoras de terapia baseada em mRNA em aplicações clínicas, é essencial para criar um veículo adequado para o transporte do mRNA para a célula. Este veículo deve suportar tóxicos propriedades in vitro e em vivo, proteger o mRNA contra nuclease-degradação e prever uma disponibilidade prolongada e tradução do mRNA14suficiente absorção celular.
Entre todos os tipos de portador possível para na vivo entrega da droga, como nanotubos de carbono, pontos quânticos e lipossomas, este último tem sido estudado a mais de15,16. Lipossomas são vesículas consistindo de bicamada lipídica10. Eles são anfifílica com uma hidrofóbica e uma parte hidrofílica, e através do auto arranjo destas moléculas, uma dupla camada esférica é formada de17. Dentro os lipossomas, agentes terapêuticos ou drogas podem ser encapsuladas e, assim, protegidas contra a degradação enzimática de18. Lipossomas contendo N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloreto (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimetilamonio) propano] (DOTAP)20e dioctadecylamidoglycylspermine (cães)21, ou DC-colesterol22, estão bem caracterizados e frequentemente utilizada para transfecção celular com DNA ou RNA.
Os lipossomas catiônicos compõem um lipido carregado positivamente e um fosfolipídeo descarregado23. Transfecção via catiônicos lipossomas é um dos métodos mais comuns para o transporte de ácidos nucleicos em células24,25. As partículas de lipídios catiônicos formam complexos com os grupos fosfato negativamente carregados na espinha dorsal de moléculas de ácido nucleico26. Estes chamados lipoplexes anexar à superfície da membrana celular e entrar na célula por endocitose ou mecanismos de endocitose-como27.
Em 1989, Malone et al. com êxito descrito mediada por lipídios catiônicos mRNA transfeccao28. No entanto, usando uma mistura de DOTMA e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga), o grupo encontrou que DOTMA manifestou efeitos citotóxicos28. Além disso, Zohra et al mostrou que DOTAP (cloreto de 1,2-dioleoyloxy-3-trimetilamónio-propano) pode ser usado como um de reagente de Transfeccao de mRNA29. No entanto, para a eficiente transfecção de células, DOTAP deve ser usado em combinação com outros reagentes, tais como fibronectina29 ou DOPE30. Até agora, DOTMA foi o primeiro lipídios catiônicos no mercado usado para o gene entrega31. Outros lipídios são utilizados como terapêuticas portadores ou estão a ser testados em diferentes fases de ensaios clínicos, (por exemplo, EndoTAG-eu, contendo DOTAP como um portador de lipídios), atualmente está sendo investigado em uma fase-II de julgamento clínico32.
Este trabalho descreve um protocolo para a geração de NLps contendo DC-colesterol e drogas. Esse método é fácil de executar e permite a geração de NLps de tamanhos diferentes. O objetivo geral de PNL geração usando o método seco-filme é criar lipossomas para complexação de mRNA, permitindo assim a célula eficiente e biocompatível transfecção em vitro14,33.
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Protocol
1. geração de Nanoliposomes catiônica (Figura 1)
- Dissolva os lipídios DC-colesterol (3beta-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoil] colesterol cloridrato) e drogas (fosfatidiletanolamina dioleoyl), fornecido como um pó, em clorofórmio para obter uma concentração final de 25 mg/mL.
Nota: Guarde os lipídios dissolvidos em-20 ° C. - Trabalhar com 25 mg/mL de solução de ambos os lipídios. Mix de 40 µ l do DC-colesterol dissolvido e 80 µ l da droga dissolvida em um balão de vidro.
Nota: A quantidade de lipídios totais é de 3 mg. Para evitar a rápida evaporação do clorofórmio, coloque os lipídios no gelo durante a pipetagem. - Vaporize o clorofórmio por 15 min sob um fluxo de gás argônio. Posteriormente, preencher um dessecador com sílica gel, colocar o balão de vidro aberto dentro e aplicar um vácuo durante a noite para certificar-se que o clorofórmio remanescente é evaporado, e um filme lipídico é formado dentro do frasco de vidro.
Nota: Trabalho rápido e evite o contato de2 O desnecessário. - Re-hidratar o filme lipídico formado com 1 mL de água livre de nuclease e levar a suspensão por 15 min (Figura 2A). Depois, coloque a suspensão em um banho de sonication por 1h (Figura 2B).
Nota: A suspensão será ligeiramente turva. - Montar a mini extrusora de acordo com as instruções do fabricante, encher uma seringa com a suspensão lipídico e coloque a seringa cheia e uma seringa vazia de ambos os lados da extrusora. Pressione a suspensão lipídico através da membrana de uma seringa para o outro, 20 x – x 25, para expulsar a suspensão (Figura 2).
Nota: O tamanho da NLps é determinado pelo tamanho dos poros da membrana utilizada. - Armazene o NLps num balão de vidro a 4 ° C até utilização posterior.
Nota: Após o tempo de armazenamento prolongado, o NLps deve ser colocado no banho sonication novamente por 15 min a 35 kHz para contornar a formação do complexo.
2. in Vitro a transcrição do mRNA sintético
- Prepare a eGFP-codificação mRNA seguindo o protocolo publicado anterior34.
- Amplificar a sequência de eGFP do plasmídeo com 0,7 µM do RCS (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') e reversa (5'-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTC TTA AAA GAC CA-3') primers e o polymerase kit com PCR.
- Mix 20 µ l de uma solução-tampão comercial que muda o comportamento de derretimento do DNA (Tabela de materiais), bem como de 20 µ l do mix 5 x do kit da polimerase. Adicione 7 µ l de cada primer (frente e verso).
- Adicionar 25 ng do plasmídeo eGFP para a mistura e 2 µ l de polymerase do kit da polimerase.
Nota: Mantenha o polymerase no gelo antes de pipetagem-lo à solução. - Adicionar livre de nuclease H2O, para a mistura, até um volume de 100 µ l.
- Manter o ciclo de PCR no thermocycler seguindo o protocolo na tabela 1.
- Purifica a sequência de DNA eGFP-codificação com o kit de purificação de PCR.
- Portanto, misturar a solução PCR com 500 µ l de tampão de ligação do kit e usá-lo para preencher colunas de purificação.
- Centrifugar as colunas na velocidade máxima por 1 min e descartar o filtrado.
- Adicione 750 µ l de tampão de lavagem eu à coluna, centrifugue novamente com o máximo de velocidade por 1 min e descartar o filtrado.
- Repita a etapa de centrifugação 1 x para remover o tampão do filtro da coluna.
- Transfira a coluna para um tubo de 1,5 mL a fresco.
- Adicionar 20 µ l de nuclease livre H2O para a coluna, incubar durante 1 min e centrifugar por 1 min na velocidade máxima. Repita este passo.
- Medir a concentração de DNA com um fotômetro e armazená-lo a-20 ° C.
- Realize as análises de qualidade de DNA usando electroforese em gel. Adicionar 0,5 g de agarose no tampão Tris-borato-EDTA (TBE) e aquecê-la no microondas em fogo alto até que a agarose é completamente dissolvido.
- Adicionar 5 µ l de solução de gel-coloração para o líquido do agarose, encher a solução na câmara de gel e espere até que o gel é polimerizado.
- Mix 200 ng de DNA com 2 µ l de 6 x carregamento tintura e encha até um volume final de 12 µ l. Pipetar uma escada de DNA, bem como a amostra de DNA, os poços de gel e executar a eletroforese para 1 h a 100 V.
- Analise o gel usando uma gel-analisando a estação sob luz UV.
- Executar a transcrição em vitro para gerar o mRNA da sequência de DNA com um kit da transcrição em vitro contendo T7-polymerase e substituir os nucleotídeos modificados de UTP e CTP com Ψ-UTP e metil-CTP.
- Para a transcrição em vitro , misture os ingredientes seguindo a tabela 2.
Nota: Substitua 1,5 µ l de metil-CTP com 01:10 Cy3-CTP diluído em livre de nuclease H2O durante a transcrição em vitro de eGFP mRNA para alcançar Cy3-rotulagem do mRNA. - Incubar a mistura de reação IVT por 4 h a 37 ° C.
- Adicione 1 µ l de DNase I, a partir do polymerase T7 kit e incube por 15 min 37 ° c para digerir o modelo de DNA.
- Para a transcrição em vitro , misture os ingredientes seguindo a tabela 2.
- Para purificar o mRNA, use o kit de limpeza de RNA.
- Encher o mix IVT para o volume de 100 µ l com nuclease livre H2O.
- Adicione 350 µ l de tampão de Lise e misture pipetando para cima e para baixo.
- Adicionar 250 µ l de etanol 100% e misture novamente. Pipete o mix nas colunas de limpeza.
- Centrifugar por 15 s em 8.000 x g e descarte o filtrado.
- Adicionar 500 µ l de buffer de lavagem em uma coluna, centrifugue novamente 15 s em 8.000 x ge remover o filtrado.
- Lavar a coluna 1 x com 500 µ l de tampão de lavagem e centrifugação por 2 min a 8.000 x g.
- Mova a coluna para um tubo de reação de 1,5 mL fresco. Eluir o mRNA 2 x por uma incubação de 1-min de 20 µ l de nuclease livre H2O na membrana da coluna, seguido por uma centrifugação de 1 min na velocidade máxima.
- Remova os grupos fosfato do mRNA usando um kit de desfosforilação. Adicionar 4,5 µ l de tampão de fosfatase 10 x e 1 µ l de fosfatase de mRNA e incubar durante 1 h a 37 ° C.
- Purifica o mRNA novamente, seguindo passos 2.5.1 - 2.5.7.
- Medir a concertação de mRNA com um fotômetro.
- Eletroforese em gel de uso para analisar a pureza e o tamanho do mRNA. Portanto, prepare um gel de agarose, conforme descrito nas etapas 2.3.9 - 2.3.10.
- 3.3 Mix µ l de formamida, 1 µ l de formol 37%, 1 µ l de 10 x homens e 1,7 µ l de 6 x carregamento tintura com 200 ng de mRNA e preenchê-lo até 10 µ l com nuclease livre H2O para cada amostra e marcador de RNA.
- Incube a mistura durante 10 minutos a 65 ° C para desnaturação do mRNA. Carregar os poços do gel com o mRNA e o marcador de RNA e funcione o gel durante 1 h a 100 V.
- Analise o gel usando uma estação de doutor de gel com luz UV.
3. complexação de mRNA sintético
- Descongelar o mRNA sintético no gelo, vórtice e centrífuga pouco antes da abertura do tubo.
- Mix 10 µ l de mRNA sintético (concentração de mRNA é 100 ng / µ l) com 1 µ l, 2,5 µ l, 5 µ l, 10 µ l ou 20 µ l de suspensão de PNL (concentração de PNL é 3 mg/mL). Centrifugue brevemente e incubar durante 20 min em temperatura ambiente (RT) para formação de nanolipoplex.
Nota: Não misture por pipetagem. Isto pode levar à perda de volume. Vórtice em breve para uma mistura completa. - Adicionar 1 mL de meio de célula normal para o nanolipoplexes e misturá-los pipetando para cima e para baixo.
4. análise da eficiência de encapsulação de Nanoliposomes
- Para realizar os experimentos de encapsulamento, use o kit de quantificação de RNA.
- Prepare a solução diluindo-se para uma alta-escala 1: 200 a tintura fluorescente e 1:2,000 para um ensaio de baixa gama.
Nota: Descongele o corante fluorescente no gelo. Prepare a solução de trabalho diretamente antes da utilização. - Preparar as alta-baixa gama e curvas padrão usando 1 mL de uma solução stock de 2 µ g/mL de eGFP mRNA em livre de nuclease H2O.
Nota: Para as curvas padrão, use o mRNA que será usado nas experiências de encapsulamento. - Use a tabela 3 para a preparação do padrão de alta gama (20 ng/mL - 1 µ g/mL).
- Para o padrão de baixa gama, dilua a 2 µ g/mL eGFP mRNA solução estoque 01:20 para atingir uma concentração final de 100 ng/mL. Prepare um padrão de baixa gama (1 ng/mL - 50 ng/mL), conforme descrito na tabela 4.
- Combine 1 µ g de eGFP mRNA (10 µ l) e 7,5 µ g de NLps (2,5 µ l) e incube por 20 min no RT
Nota: Mantenha o mRNA no gelo para evitar a degradação. - Adicione 1 mL de nuclease livre H2O formulário nanolipoplexes e mistura pipetando para cima e para baixo.
- Adicionar 1 mL de 1: 200 ou 1:2,000 solução de trabalho de tintura fluorescente RNA as normas e amostras encapsuladas e incubar durante 5 min à RT no escuro.
- Pipetar os padrões e amostras em duplicatas para uma preta placa de 96 poços e medir a fluorescência a 530 nm em um leitor de microplacas (Figura 3).
5. preparação das células para transfeccao
- Placa de 1,5 x 105 A549 células/poço de uma placa de 12 d 1 antes do transfection.
- Incube as células em 37 ° C e 5% CO2 em meio de célula normal (glicose alta/DMEM com 10% soro bovino fetal [FBS], 2 mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina) durante 24 h antes do transfection.
6. transfection das células
- Lave o preparado células 1 x com 1 mL/poço PBS (sem o Ca2 +Mg2 +).
- Adicione 1 mL da mistura de nanolipoplex preparado, contendo 1 µ g de eGFP que mRNA encapsulada em 1 µ l, 2.5 µ l, 5 µ l, 10 µ l ou 20 µ l NLps, para bem da placa preparada com células A549.
- Adicionar a suspensão de nanolipoplex para as células e incubar a condições regulares para 24 h analisar a eficácia de transfeccao, ou por 24 h e 72 h para analisar a viabilidade celular depois do transfection.
Nota: Transfection com NLps não exige uma mudança de média.
7. análise da eficácia de transfecção celular usando citometria de fluxo e microscopia de fluorescência
- Remover o sobrenadante e lavar as células com 1ml/bem PBS (sem o Ca2 +/ mg2 +) para remover o restante NLps.
- Prepare as células por citometria de fluxo.
- Trypsinize as células com 500 µ l/poço tripsina/EDTA (0.05%) a 37 ° C por 3 min. parar o processo e inativar a tripsina, adicionando a mesma quantidade (500 µ l/poço) de médio regular contendo FBS.
- Centrifugar as células durante 5 min à 400 x g e remova cuidadosamente o sobrenadante sem tocar o centrifugado.
- Lavar as células com 1 mL de PBS (sem o Ca2 +Mg2 +).
- Ressuspender as células em 300 µ l de solução de fixação 1 x e transferir as células nos tubos de citometria de fluxo.
- Analisar as células em 488 nm em um citômetro de fluxo (Figura 4A).
Nota: Vórtice as células 1 x diretamente antes de medir.
- Prepare as células para microscopia de fluorescência.
- Consertar as células com 1 mL/bem 100% metanol, que anteriormente foi armazenado a-20 ° C.
- Adicionar 500 µ l/poço 300 nM DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) dissolvido em PBS (sem o Ca2 +/ mg2 +) e incube por 5 min no escuro.
- Remover a solução DAPI e lavar as células novamente com 100% de metanol armazenado a-20 ° C.
- Analise as células usando um microscópio de fluorescência (Figura 4B).
Nota: Use os seguintes comprimentos de onda de excitação/emissão: eGFP 488/509 nm, nm DAPI 358/461 e Cy3 550/570 nm.
8. ensaio da viabilidade celular
- Dissolva 5 mg de MTT (brometo de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) em 1 mL de RPMI (sem vermelho de fenol).
Nota: O MTT dissolvido deve ser ainda mais diluído 01:10 (concentração final: 0,5 mg/mL) em RPMI antes do uso. - Lavar as células transfectadas 3 x com 1 mL/poço PBS (sem o Ca2 +/ mg2).
Nota: Os restos do meio de célula normal devem ser completamente removidos. - Adicionar 500 µ l/poço de 01:10 diluído solução MTT para as células e incube por 4 h a 37 ° C.
- Remova a solução MTT das células após a incubação e adicione 500 µ l/poço DMSO (Dimetilsulfóxido). Incube novamente por 10 min a 37 ° C.
- Pipetar a solução de DMSO em trigêmeos para uma placa de 96 poços de clear-inferior e medir a adsorção a 540 nm, utilizando um leitor de microplacas.
- Definir a viabilidade da célula não tratada em 100% e calcular a viabilidade celular dos outros grupos em comparação com as células controle não tratados (Figura 5).
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Representative Results
Usando o protocolo como descrito, NLps consistindo de lipídeos DC-colesterol e droga foram preparadas usando o método seco-filme (Figura 1). Durante a preparação, a solução de nanoliposome mostra diferentes fases na turbidez (Figura 2).
A eficácia de encapsulamento do NLps pode ser analisada após o encapsulamento de 1 µ g de mRNA eGFP-codificação, analisando a quantidade livre de mRNA, que não estava encapsulado, usando o kit de quantificação de RNA (Figura 3).
Após o encapsulamento de eGFP que mRNA em quantidades diferentes de NLps, o nanolipoplexes formado pode ser incubadas com células in vitro e a percentagem de células eGFP-expressando podem ser analisados usando posttransfection de 24 h de citometria de fluxo (Figura 4A) . Até 1 µ l da solução de nanoliposome é suficiente para alcançar uma alta transfecção de células in vitro. Quando as células são transfected com NLps contendo eGFP Cy3-rotulados mRNA, a presença do eGFP mRNA no citoplasma (fluorescência vermelha), bem como a proteína já produzidos eGFP (fluorescência verde) pode ser visualizada (Figura 4B).
Como a transfecção de células usando o nanolipoplexes pode ter efeitos adversos sobre as células, a viabilidade das células foi testada 24 h (Figura 5A) e posttransfection de 72 h (Figura 5B). Sem efeitos na viabilidade celular poderiam ser detectados quando as células foram tratadas com 2,5 ou 5 µ l de NLps ou nanolipoplexes, respectivamente.
Figura 1: visão geral esquemática do processo de fabricação de nanoliposomes catiônica. Primeiro, os lipídios dissolvidos DC-colesterol e drogas devem ser misturados num balão de vidro. Em segundo lugar, o líquido de clorofórmio visível deve ser evaporado sob argônio ou fluxo de gás nitrogênio e as sobras de clorofórmio devem evaporar-se durante a noite no vácuo. Em terceiro lugar, o filme lipídico formado no fundo do recipiente de vidro deve ser reidratado com nuclease livre H2O, seguido por num Vortex para formar multilamellar lipossomas. Através do sonication e extrusão da solução em lipossomas, o ready-to-use unilamellar NLps são produzidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A solução de nanoliposome em diferentes estágios durante a fabricação. (A) esta figura mostra a solução de lipossoma diretamente depois da hidratação do filme lipídico e num Vortex para 15 min, bem como (B) depois de 1 h em um sonication banho (C) seguida de 25 ciclos de extrusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: eficácia de encapsulamento do nanoliposomes. Este painel mostra a quantificação da enciclopédia eGFP mRNA após encapsulamento em NLps. Os resultados são apresentados como média ± SEM (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: eficácia de transfeccao do nanolipoplexes. (A), este painel mostra a determinação da relação de mRNA/nanoliposome melhor para transfeccao usando diferentes quantidades de NLps para encapsular a 1 µ g de posttransfection de 24 h de mRNA eGFP. (B) este painel mostra a detecção de Cy3-rotulado mRNA sintético encapsulado em 2,5 µ l NLps e a expressão de eGFP na posttransfection de 24 h de células (barra de escala = 50 µm). Os resultados são apresentados como média ± SEM (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: viabilidade celular após o transfection com nanoliposomes e mRNA encapsulado. Este painel mostra a medição da viabilidade celular usando um ensaio de MTT (A) 24 h e (B) 72 h posttransfection. Os resultados são apresentados como média ± SEM (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Passo | Temperatura em ° C | Duração |
| 1 | 95 | 5 min |
| 2 | 94 | 15 s |
| 3 | 55 | 1 min |
| 4 | 72 | 1 min |
| 5 | Vá para 2 30 x | |
| 6 | 72 | 10 min |
| 7 | 4 | Segure |
Tabela 1: Protocolo para a amplificação de DNA de ciclo de PCR.
| Concentração | Quantidade | |
| ATP | 7,5 mM | 4 Μ l |
| GTP | 1.875 mM | 1 Μ l |
| 5'-Methylcytidin | 7,5 mM | 3 Μ l |
| Ψ | 7,5 mM | 3 Μ l |
| ARCA | 2,5 mM | 10 Μ l |
| Modelo de DNA | 1,5 µ g | |
| Mistura de tampão | 1 x | 4 Μ l |
| Mistura de enzima T7 | 4ΜL | |
| Inibidor de RNase | 1 Μ l | |
| Água livre de nuclease | Encha até 40 µ l | |
Tabela 2: Mix para o em vitro transcrição do DNA para mRNA.
| Volume de nuclease livre H2O (µ l) | Volume de solução-mãe alta gama de mRNA eGFP (µ l) | Volume de 1: 200 tintura fluorescente (µ l) | Concentração final (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 1000 |
| 50 | 50 | 100 | 500 |
| 90 | 10 | 100 | 100 |
| 98 | 2 | 100 | 20 |
| 100 | 0 | 100 | em branco |
Tabela 3: Protocolo para uma curva padrão de alta gama.
| Volume de nuclease livre H2O (µ l) | Volume de solução-mãe baixa gama de mRNA eGFP (µ l) | Volume de 1: 2000 tintura fluorescente (µ l) | Concentração final (ng/mL) |
| 0 | 100 | 100 | 50 |
| 50 | 50 | 100 | 25 |
| 90 | 10 | 100 | 5 |
| 98 | 2 | 100 | 1 |
| 100 | 0 | 100 | em branco |
Tabela 4: Protocolo para uma curva padrão de baixa gama.
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Discussion
O protocolo apresentado descreve a geração de NLps com eficácia elevada de encapsulamento para mRNA sinteticamente modificado, assim como o transfection confiável de células em vitro. Além disso, os NLps garantir a liberação do mRNA, que por sua vez, é traduzida em uma proteína funcional no interior das células. Além disso, os transfections usando NLps podem ser executadas no meio celular regular, resultando em alta realidades da pilha durante a transfeccao, e durar até três dias depois do transfection.
Para usar o mRNA como uma terapêutica, auto montagem sistema de sua entrega é preferencial. Os reagentes de transfecção mais comuns incluem lipídios catiônicos, incluindo os lipossomas. Como lipossomas são carregados positivamente, carregados negativamente ácidos nucleicos pode ser encapsulados em-los, permitindo assim que a repulsão eletrostática das membranas celulares para superar35. Os lipídios catiônicos DC-colesterol já foi descrito em estudos anteriores como um veículo estável e biocompatível36. A adição do lipídio neutro droga leva a uma eficácia de transfeccao reforçada37. Considerando as vantagens descritas acima mencionados, esses lipídios foram escolhidos para a preparação de NLps. Além disso, estudos anteriores demonstraram que o uso destes dois lipídios é preferível sobre outros devido a uma taxa de aumento de transfecção celular com carregados negativamente ácidos nucleicos38.
Para a geração de sucesso de NLps e nanolipoplexes, é fundamental dar atenção extra a algumas das etapas. O processo de geração de nanoliposome deve ser efectuado sob O2-livre de condições. A presença de O2 durante a geração de PNL pode levar à degradação de fosfolipídios e reprodutibilidade reduzida39. Além disso, apesar das modificações, o mRNA é muito sensível no que respeita à degradação por nucleases. Portanto, para a hidratação do filme lipídico, o uso de livre de RNase H2O é altamente recomendável para evitar a degradação do mRNA durante a complexação. Também, condições de RNase-livre devem ser asseguradas para o armazenamento de nanolipoplexes.
Além disso, NLps podem formar agregados ao longo do tempo por causa do sistema termodinâmico instável. Os parâmetros de influência incluem a temperatura de armazenamento e carga de superfície do lipossoma40. Agregação de PNL pode provocar a desestabilização da membrana em lipossomas e o risco de indesejável mRNA liberar41, levando à degradação de eficácia e mRNA de transfeccao pobre no espaço extracelular. No entanto, como anteriormente indicado, nanolipoplexes podem ser armazenadas a 4 ° C por até seis meses sem agregação ou perda de eficácia de transfeccao35.
Usando lipossomas como um sistema de transporte de drogas, dois dos principais problemas de entrega de droga podem ser resolvido. Os lipossomas proteger a droga encapsulada de degradação e são capazes de passivamente os tecidos-alvo que possuem um endotélio descontínuo, tais como o fígado ou medula óssea16. Para a entrega de terapêutica de ácidos nucleicos, parâmetros como o tamanho de partícula e encapsulamento de capacidade são críticos para a absorção celular e avaliação de veículos lipossomas. Particularmente, o tamanho dos lipossomas na escala do nanômetro permite uma interação com a membrana celular42 e é, assim, importante para o uso na vivo mais tarde. Primeiro, os lipossomas devem ser pequenos o suficiente para evitar o acesso através do sistema renal e hepática,43. Em segundo lugar, o tamanho do lipossoma deve ajudar a superar a barreira dos vasos sanguíneos para atingir as células do órgão desejado. Foi relatado que os lipossomas na faixa de 100-300 nm de tamanho foram capazes de transfect eficientemente hepatócitos44; no entanto, de grande porte lipossomas (por exemplo, 400 nm) não foram capazes de superar a barreira endotelial45.
Embora o método descrito foi estabelecido para a entrega do mRNA, também pode ser implementado para outras terapêuticas de ácidos nucleicos, tais como microRNA. Em um estudo recente, demonstrámos que microRNA 126 pode ser seletivamente direcionada e, portanto, o desenvolvimento dos aneurismas da aorta abdominais pode ser efetivamente impedido46. Como terapêutica de DNA/RNA pode causar efeitos secundários, tais como Ativação plaquetária, quando entram em contato direto com as células, embalagem dentro de lipossomas pode ser evitado, assim, tornando-o ainda mais vantajoso47. Portanto, o método apresentado aqui é altamente versátil e pode ser usado para projetar a entrega da droga para muitas doenças. O protocolo estabelecido não só permite a geração rápida e econômica de uma transportadora de mRNA eficiente com um tamanho definido, mas também oferece a possibilidade de personalizar a formulação lipídica de acordo com as necessidades de um determinado aplicativo: (1) o tamanho da lipossomas facilmente podem ser alterados mudando os filtros; (2) a superfície de lipossomas a carga positiva pode ser modificada usando, por exemplo, polietileno glicol, para aumentar a estabilidade e atraso de liberação de sangue durante na vivo aplicação48. A ligação de anticorpos específicos para os lipossomas permite a entrega orientada da droga encapsulada49. Com uma análise mais aprofundada e uma visão mais detalhada sobre as propriedades físicas, o protocolo pode ainda ser melhorado.
Para a geração de lipossomas, três métodos comuns estão disponíveis: o dry-film, a injeção de etanol e a reverso-fase evaporação. No Yang et al. Estas três técnicas de fabricação de estudo, foram comparados a35. Verificou-se que os lipossomas com um tamanho definido e uma repartição equitativa na solução podem ser gerados usando o método seco-filme. Além disso, o processo de seca-filme realizado neste estudo resultou na produção de NLps com um tamanho definido de 200 nm, uma distribuição homogênea e um encapsulamento de alta capacidade.
Por um lado, a carga positiva dos lipossomas leva um encapsulamento maior capacidade e melhor celular fusão superfície50,,51,52, mas por outro lado, pode desestabilizar a membrana celular e ativar vias de ativação imune diferentes e célula morte27,53. No entanto, as propriedades de apoptotic de lipídios catiônicos podem ser minimizadas usando o auxiliar lipídico DOPE54,55. No estudo por Zhang et al, verificou-se que uma proporção de 1:2 de DC-colesterol e drogas durante a geração de lipossoma leva à transfecção celular mais eficiente usando ácidos nucleicos38. O método implementado no presente estudo, a proporção de lipídios de 1:2 DC-colesterol e droga foi usada na suspensão lipídico misto durante a preparação do filme lipídico e os lipossomas preparados levaram a eficácia de transfeccao alta e, simultaneamente, alto celular viabilidade. Resultados semelhantes foram encontrados também por outros pesquisadores, tais como Ciani56 e Sueli37.
Em geral, os lipossomas têm sido usados por anos em ensaios clínicos, mostrando excelente biocompatibilidade e baixa toxicidade em vivo. Em combinação com mRNA, NLps poderia ser usado para a entrega eficiente de mRNA de órgãos ou células in vitro e em vivo, para induzir a síntese de novo de uma proteína desejada. No que diz respeito a aplicações terapêuticas, nanolipoplexes pode ser usado, por exemplo, em ferida cura remendos transdermal mRNA entrega57 activar a regeneração celular, ou como um spray para a nebulização de mRNA58 para a cura do pulmão doenças59,60 , tais como a fibrose cística.
O protocolo apresentado garante uma maneira fácil e acessível para a geração de NLps usando o método seco-filme, que pode ser usado para o encapsulamento eficiente do in vitro transcrito mRNA e a segura transfecção de células.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Nenhum
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | AppliChem, Darmstadt, Germany | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol hydrochloride (DC-Cholesterol) | Avanti, Alabama, USA | 700001 | |
| 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | D1306 | |
| BD FACScan system | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 340181 | |
| Chloroform | Merck, Darmstadt, Germany | 102445 | |
| Dimethyl sulfoxid (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 20385.02 | |
| Dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti, Alabama, USA | 850725 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Axio, Oberkochen, Germany | ||
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11668019 | |
| Mini extruder | Avanti, Alabama, USA | ||
| Nuclease-free water | Qiagen, Hilden, Germany | 129114 | |
| Opti-Mem | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11058021 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA reagent kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | Q33140 | |
| RPMI (w/o phenol red) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 11835030 | |
| Silica gel | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P077 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate (Ψ-UTP) |
TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1019 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies, San Diego, USA | N-1014 | |
| Cyanine 3-CTP | PerkinElmer, Baesweiler, Germany | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs, Ipswich, USA | S1411L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0289S | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium, Fremont, USA | 41003 | |
| peqGOLD DNA ladder mix | VWR, Pennsylvania, USA | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder | Fisher Scientific, Göteborg, Sweden |
11528766 |
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