Summary
Hier beschrijven we de isolatie van kip primaire bursal cellen uit de bursa van Fabricius, de cultuur en de infectie van de cellen met bursal infectieziekte virus, en de kwantificering van de virale replicatie.
Abstract
Bursal infectieziekte virus (IBDV) is een birnavirus van economisch belang voor de pluimvee-industrie. Het virus infecteert B-cellen, waardoor morbiditeit en mortaliteit bij immuunsuppressie bij besmette vogels. In deze studie beschrijven we het isolement van kip primaire bursal cellen uit de bursa van Fabricius, de cultuur en de infectie van de cellen met IBDV, en de kwantificering van de virale replicatie. De toevoeging van kip interactie CD40-ligand aanzienlijk verhoogd celproliferatie verviervoudiging meer dan zes dagen van de cultuur en de levensvatbaarheid van de aanzienlijk verbeterde cellen. Twee stammen van IBDV, een cel-cultuur aangepast stam, D78 en een zeer virulente stam, UK661, goed in de celculturen ex vivo gerepliceerd. Dit model zal zijn voor gebruik bij het bepalen van hoe de cellen reageren op IBDV infectie en toestaat een vermindering in het aantal besmette vogels gebruikt in IBDV pathogenese studies. Het model kan ook worden uitgebreid tot andere virussen en kan worden toegepast op verschillende soorten vogels.
Introduction
De globale pluimvee-industrie is essentieel voor het veilig genoeg voedsel voor een groeiende bevolking. Echter, bij immuunsuppressie is de bedreiging voor de voedselzekerheid en het welzijn van de betrokken vogels en vormt een belangrijke economische uitdaging voor de industrie. De meerderheid van de gevallen bij immuunsuppressie bij kippen worden veroorzaakt door de infectie met immunosuppressieve virussen, met de meest verantwoordelijken voor afbreuk te doen aan verworven immuniteit hebben een tropisme voor T en B lymfocyten1. Bij vogels liggen de meerderheid van de B-cellen op een orgel dat bekend staat als de bursa van Fabricius (BF). B-cellen zijn gevoelig voor infectie met verschillende immunosuppressieve virussen, met inbegrip van die veroorzaken van lysis, zoals IBDV en Marek van ziekte-virus (MDV), en degenen die het veroorzaken van transformatie, zoals aviaire leukose virus (ALV) en reticuloendotheliosis virus) REV).
Om betere strategieën voor het beheersen van deze infecties te ontwikkelen, is het essentieel te karakteriseren van de interactie van de virussen met kip B cellen. Echter, wanneer B cellen uit een vogel zijn verwijderd, ze niet overleven goed in ex vivo cultuur2, waardoor het moeilijk voor het uitvoeren van een grondige analyse van de interacties van IBDV met kip B-cellen, of de vroege gebeurtenissen na ALV of REV infectie. Bijgevolg, veel gastheer cel-virus interacties geweest studeerde in vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Hoewel deze studies informatief zijn, daarbij het gebruik van besmette vogels die lijden aan ziekten die ernstig kunnen.
De interactie CD40-ligand is een molecuul dat B cel proliferatie11 induceert. Na identificatie van het gen coderen kip CD40L (chCD40L), een oplosbare fusieproteïne werd ontworpen dat, wanneer toegevoegd aan de voedingsbodems, veroorzaakte de proliferatie van kip primaire B cellen ex vivo12. In 2015, B-cellen gekweekt op deze manier gevonden ter ondersteuning van de replicatie van MDV2 en in 2017, wij en anderen gevonden dat primaire bursal cellen gestimuleerd met chCD40L kunnen worden gebruikt als een model om te studeren van IBDV replicatie13,14. Hier beschrijven we het isolement en de cultuur van kip primaire bursal cellen, de infectie van de cellen met IBDV en de kwantificering van de virale replicatie. Hoewel we de methode in het kader van de BF beschrijven, kon dit worden toegepast op cellen isoleren en cultuur van verschillende lymfoïde organen.
Protocol
Alle procedures met dieren moeten ethisch vooraf worden goedgekeurd. In onze instelling, worden alle procedures uitgevoerd overeenkomstig de UK dier (wetenschappelijke Procedures) Act 1986 onder vestiging van het Bureau van het huis, persoonlijke en Project licenties, na de goedkeuring van de interne dierenwelzijn en de ethische Review Board (AWERB).
1. bereiding van chCD40L
- Cultuur HEK 293-msCD8-CD40L cellen die stabiel express een oplosbare chCD40L bouwen in 1 x Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd (Hoi), foetaal kalfsserum (FCS) en 1 µg/mL puromycin bij 37 ° C in een atmosfeer met 5% CO 2.
Opmerking: Deze cellen zijn verkrijgbaar bij het Instituut van de Pirbright na de ondertekening van de overeenkomst van passende materiële overdracht. - Splits de cellen bij een dichtheid van 1:5 wanneer confluent. Verzamel het supernatant (met de constructie van de oplosbare chCD40L) elke keer dat de cellen worden gesplitst, na het centrifugeren bij 400 x g gedurende 5 min cellulaire puin verwijderen en opslaan bij 4 ° C.
- 500 mL van het supernatans dat is verzameld, de vloeistof bundelen als filter-steriliseren het door een 0,2 µm filter.
- Concentreren het supernatant concentrators centrifugaal eiwitten met een moleculair-gewicht cutoff van 10 K volgens de instructies van de fabrikant. Pak het geconcentreerde supernatant van elke kolom, het samen bundelen en filter-steriliseren het door het passeren van een 0,22 µm spuit filter.
- Bepalen van de uiteindelijke concentratie moet worden gebruikt in experimenten door serieel verdunning van de oplossing van de chCD40L in 1 x Iscove van gemodificeerde Dulbecco van medium (IMDM) (beschreven in stap 2.4) en kweken primaire bursal cellen in aanwezigheid van de verdunningen. Het bepalen van het aantal en percentage levensvatbaarheid van de cellen dagelijks voor tot een week.
Opmerking: De laagste concentratie waar celproliferatie en levensvatbaarheid geschikt zijn is de concentratie in de test wilt gebruiken. Dit is waarschijnlijk te zijn tussen de 1:20 en 1:50.
2. voorbereiding van oplossingen voor kip primaire Bursal cel isolatie
- 1 x Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBBS) met calcium (Ca) voor te bereiden door het toevoegen van 10 mL 10 x HBBS met Ca 90 ml steriele H2O en 0.47 µL van 7,5% NaHCO3.
- Bereid de oplossing collagenase D stockoplossing bij 8 mg/mL in 1 x HBBS met Ca. Filter-steriliseren door een 0,2 µM filter.
Opmerking: Het is raadzaam om te bereiden 5 mL aliquots en bevriezen ze bij-20 ° C. - Bereiden 1 x RPMI medium aangevuld met 5% Hallo FCS. Opslaan van de media bij 4 ° C.
- Bereiden 1 x 500 mL IMDM aangevuld met 8% Hallo FCS, 2% Hallo kip serum, 50 mM β-mercaptoethanol, 50 µL van insuline-transferrine--Natriumseleniet en 1% penicilline/streptomycine. Opslaan van de media bij 4 ° C.
Opmerking: Bereiden van tevoren alle bovengenoemde oplossingen. - Bereiden 1 x HBBS met Ca. opslag de oplossing op het ijs.
- 1 x HBBS zonder Ca voor te bereiden door het toevoegen van 10 mL 10 x HBBS zonder Ca 90 ml steriele H2O, 0.47 µL van 7,5% NaHCO3en EDTA op een eindconcentratie van 10 mM. Bewaar de oplossing op het ijs.
- Bereid 1 x collagenase D oplossing door toevoeging van 5 mL van de stockoplossing collagenase D 13 ml HBBS met Ca om een totaal van 18 mL. Bewaar de oplossing op het ijs.
Opmerking: Voor te bereiden op de dag van het experiment in stappen 2.5-2.7 genoemde oplossingen.
3. verwijdering van de Bursa van Fabricius (BF)
- Achter- en hatch kippen in een voorkomend geval goedgekeurde faciliteit en humaan ruiming hen op 2 – 3 weken oud.
Opmerking: Gebruik Instituut-erkende methoden voor ruimen. -
De BF verzamelen van elke kip met behulp van aseptische technieken.
Opmerking: Gebruik de protocollen in plaats van de instelling.- Plaats van het karkas in dorsale lighouding en steriliseren van de huid en de veren de buik en borstkas te bedekken met een oplossing van 70% ethanol, verdund in water.
- Maak een ventral midline incisie in de onderbuik met een gesteriliseerde scalpel of schaar.
- Zoek de bursa van Fabricius, die is aangesloten op het caudal gedeelte van de dikke darm, Cranio aan de cloaca.
- Met behulp van gesteriliseerde pincet en schaar, knip de bursa van Fabricius vrij van de dikke darm. Zorg om te voorkomen dat de darm prikken.
- Plaats het orgel in koude PBS en het overbrengen van het laboratorium op ijs.
Opmerking: primaire cellen worden geïsoleerd zo spoedig mogelijk na de oogst van het orgel.
4. isolatie van kip primaire Bursal cellen
- Werken in een microbiologische veiligheid kabinet, het wassen van de BF minstens 3 x in 30 mL koud PBS.
- Het weefsel overbrengen in een petrischaal (92 mm in diameter en 21 mm in hoogte) en voeg toe 5 mL 1 x collagenase D oplossing.
- Met behulp van steriele schaar of een mes scalpel, snij de BF in stukken van minder dan 5 mm in diameter.
- Incubeer het weefsel bij 37 ° C met periodieke zachte agitatie voor 30 min.
Opmerking: De collagenase oplossing zal beginnen te verteren het weefsel. - Met behulp van een steriele Pipet van Pasteur, herhaaldelijk gecombineerd het mengsel ter bevordering van de desintegratie van het weefsel. Indien nodig, het weefsel in kleinere stukjes gesneden.
- Voeg een andere 5 mL 1 x collagenase D oplossing aan het weefsel en het Incubeer bij 37 ° C met periodieke zachte agitatie voor een andere 30 min.
- Herhaal de stappen 4.6 en 4.7 om het weefsel wordt volledig verteerd.
Opmerking: Er worden kleine korrels die lossen niet op verder. - De celsuspensie passeren door een 100 µm cel zeef in 20 mL van de 1 x HBBS zonder Ca.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 mL van de 1 x RPMI met 5% FCS.
- 10 mL van de celsuspensie bovenop 5 mL kleurovergang medium dichtheid met polysucrose en natrium diatrizoate-overlay of 5 mL van de kleurovergang media dichtheid onder de 10 mL celsuspensie onderlaag. Zorg ervoor er een duidelijke interface tussen de twee.
- Centrifugeer de overlay bij 900 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verlagen of te schrappen van de centrifuge pauze.
Opmerking: De cellen moeten vormen een band op het raakvlak tussen de cel media en de dichtheid kleurovergang. - Met behulp van een steriele Pipet van Pasteur, verwijderen van de cellen en plaats ze in koude PBS. Wassen van de cellen 3 x door centrifugeren hen bij 400 x g gedurende 5 min en resuspending hen in koude PBS.
5. cultuur van kip primaire Bursal cellen
- Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 min en resuspendeer hen in 1 x volledige IMDM.
- Neem een aliquoot gedeelte van de celsuspensie, toe te voegen aan de oplossing van een Trypan blauw en het aantal levensvatbare cellen dat de blauwe Trypan uitsluiten. Het aantal cellen en de levensvatbaarheid van het percentage te bepalen.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 min en resuspendeer het in volledige IMDM aangevuld met een 1:20 verdunning van kip CD40L bij een dichtheid van 1 x 107 cellen/mL. Titreer de geconcentreerde bovendrijvende substantie met de chCD40L om te bepalen van de optimale verdunning, die dreigt te liggen in het bereik van 1:10 tot 1:50.
- Cultuur van de cellen in beide 96 - of 24-Wells-platen bij 37 ° C voor 48 / 72 h. U bodem 96-wells-platen zijn te verkiezen boven platbodem platen.
Opmerking: Cellen kunnen ook worden gekweekt bij 40 ° C
6. infectie van kip primaire Bursal cellen met IBDV
- 48-72 uur na isolatie, ontdooien van een aliquoot deel van het virus, vortex het monster, en sla deze op het ijs.
- Resuspendeer de primaire bursal cellen, neem een 10-µL aliquoot van de celsuspensie toe te voegen aan 10 µL van een blauw Trypan-oplossing en bepalen van het aantal cellen en percentage levensvatbaarheid.
- Verdun het virus in 1 x volledige IMDM aan de juiste veelheid van infectie (MOI) kan het virus entmateriaal en vortex.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in het entmateriaal virus.
- Incubeer de celsuspensie bij 37 ° C gedurende 1 uur met periodieke agitatie.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 min, verwijderen van het virus entmateriaal en wassen van de cellen in 1 x volledige IMDM media.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in volledige IMDM media aangevuld met kip CD40L bij een dichtheid van 1 x 107 cellen per mL.
- Cultuur van de cellen in beide 96 - of 24-Wells-platen bij 37 ° C.
Opmerking: Cellen kunnen ook worden gekweekt bij 40 ° C
7. kwantificering van IBDV replicatie in kip primaire Bursal cellen
- Op het gewenste tijdstip postinfection, resuspendeer de cellen, overbrengen naar een passende buis, centrifugeer ze bij 400 x g gedurende 5 min en het supernatant voor virus titratie oogsten door plaque assay of TCID50 assay volgens de Reed-Muench methode15.
- Wassen van de cellen in 1 mL PBS en bereiden hen voor immunokleuring met een antilichaam specifiek voor IBDV, of uittreksel van RNA met behulp van een passende kit (na instructies van de fabrikant) en uitvoeren van omgekeerde transcriptie kwantitatieve polymerase ketting reactie (RT-qPCR) met behulp van primers specifiek voor een IBDV-gen (Forward, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Omgekeerde, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Mock-besmette celculturen moeten worden gebruikt als een besturingselement.
Representative Results
Kip primaire Bursal cellen kunnen worden gekweekt in aanwezigheid van kip CD40L
Als kip primaire bursal cellen werden gekweekt in aanwezigheid van oplosbare chCD40L, het aantal cellen verviervoudigd van 9.02 x 105 3,63 x 106 per mL over een periode van 6 dagen, in tegenstelling tot wanneer het afwezig was (p < 0.05) ( Figuur 1A). Levensvatbaarheid van de cellen is ook aanzienlijk verbeterd, bijvoorbeeld van 25% op dag 3 na cultuur in de afwezigheid van chCD40L tot 48% in de aanwezigheid van chCD40L (p < 0.05) (figuur 1B)13.
Kip primaire Bursal cellen kunnen ondersteunen de replicatie van beide-celkweek aangepast en zeer virulente stammen van IBDV
Mock-besmet en geïnfecteerde celculturen werden gerepareerd 18u postinfection, gelabeld met een monoclonal antilichaam tegen IBDV VP2 en een secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 488, en counterstained met DAPI. Geïnfecteerde cellen had bewijs van groene fluorescentie rond de kern (figuur 2A), consistent met de aanwezigheid van IBDV in het cytoplasma. Dit bleek voor twee stammen van IBDV, een cel-cultuur aangepast stam, D78 en een zeer virulente stam, UK661 (figuur 2A). Op 5, 18, 24 en 48 h postinfection, werd RNA gewonnen uit besmette culturen en onderworpen aan RT-qPCR met primers specifiek naar een geconserveerde regio van het IBDV VP4-gen. De expressie van VP4 was eerst genormaliseerd naar de house-keeping gen TBP en vervolgens uitgedrukt als vouw verandering ten opzichte van mock monsters in een analyse van de ΔΔCt. IBDV VP4 expressie verhoogd tot 16,603 exemplaren op 48 h postinfection met D78 en 38,632 exemplaren op 48 h postinfection met UK661. Samen genomen, deze gegevens tonen aan dat de kip primaire bursal cellen kunnen ondersteuning voor de replicatie van cel-cultuur-aangepast en zeer virulente IBDV stammen13.
Figuur 1: kip primaire bursal cellen kunnen worden gekweekt in aanwezigheid van kip CD40L. Kip primaire bursal cellen werden gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van chCD40L (zwarte balken en witte balken, respectievelijk). (A) het aantal levende cellen en (B) het aantal levensvatbare cellen werden vastgesteld op de aangegeven tijd-punten postinfection. De gegevens die worden weergegeven zijn representatief voor ten minste drie replicaat experimenten, de foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van het gemiddelde en de statistische significantie werd bepaald met behulp van de Student van een gepaarde t-test op elk tijdstip, * p < 0.05. dit cijfer is met toestemming van Dulwich et al. gewijzigd 13.
Figuur 2: kip primaire bursal cellen kunnen ondersteunen de replicatie van zowel cel-cultuur aangepast en zeer virulente stammen van IBDV. (A) kip primaire bursal cellen werden mock-besmet of besmet met D78 of UK661 en een steekproef uit elke cultuur was vastgesteld, met het label en beeld: IBDV VP2, groen; kernen, blauw. Schaal bar = 7 µm. (B) RNA werd gewonnen op de aangegeven tijd-punten postinfection, omgekeerde-getranscribeerd, en een geconserveerde regio van het gen IBDV VP4 werd versterkt door kwantitatieve PCR. De log10 vouw wijzigen in VP4 exemplaaraantal was genormaliseerd naar het gen van de huishouding TBP en uitgesproken ten opzichte van mock-geïnfecteerde monsters volgens de 2-ΔΔCT -methode. De gegevens die worden weergegeven zijn representatief voor ten minste drie replicaat experimenten, en de foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van het gemiddelde. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Dulwich et al. 13.
Discussion
In deze studie, wij beschrijven de succesvolle cultuur van kip primaire bursal cellen ex vivo in aanwezigheid van oplosbare chCD40L en aantonen dat deze cellen kunnen ondersteuning voor de replicatie van een verzwakte stam en een zeer virulente stam van IBDV. Dit ex vivo -model kan worden gebruikt om te bepalen hoe de cellen reageren op een IBDV infectie13, dat verschillende voordelen ten opzichte van in vivo en in vitro studies heeft.
Bij het verzamelen van de BF, is het cruciaal voor niet doorprikken de darm om bacteriële besmetting van de geïsoleerde bursal cellen voorkomen. Daarnaast is het belangrijk om te isoleren van de primaire cellen zo spoedig mogelijk na de oogst van de orgel te beperken van celdood. De noodzaak om het gebruik van chCD40L is een beperking van de techniek; werk uitgevoerd door Soubies et al. blijkt echter dat het gebruik van phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) te verlengen van de levensvatbaarheid van de bursal cellen in plaats van chCD40L14 het model kunnen vastgesteld door een groter aantal laboratoria. Het hierboven beschreven protocol bepaalt de optimale concentratie van chCD40L empirisch, door het kweken van primaire B cellen serieel verdunde concentraties van de molecuul en observeren celproliferatie en levensvatbaarheid. Een mogelijke wijziging van het protocol kan zijn voor het zuiveren van het chCD40L molecuul en een specifieke concentratie toevoegen aan de cel voedingsbodems te vermijden-charges-variabiliteit.
In vivo studies hebben aangetoond dat volgende infectie van de IBDV, dat er is een toename van de expressie van genen die betrokken zijn bij het pro-inflammatoire cytokine reacties, Type I IFN reacties en apoptosis in de BF5,,9,10 . Echter, na infectie is er een toevloed van ontstekingscellen en effector T cellen in de BF, die verschillen in de genen die zij uitdrukken ten opzichte van de geïnfecteerde B-cel bevolking9. Het is daarom moeilijk te interpreteren hoe geïnfecteerde cellen reageren op IBDV. Om aan te pakken dit, hebben sommige onderzoeksgroepen gekenmerkt de transcriptionele reactie van cellen geïnfecteerd met IBDV in cultuur16,17,18,19,20. Deze in vitro studies hebben het voordeel van welomschreven MOIs en tijdstippen postinfection. In vitro studies hebben echter doorgaans gekenmerkt in fibroblast cellen16,17,20 of dendritische cellen18. Terwijl sommige inzicht in gastheer cel-IBDV interacties, de huidige overtuiging is dat de infectie van B-cellen cruciaal voor de pathogenese van IBDV en, dus, de relevantie van de gegevens is kan niet worden overinterpreted. Voorafgaand aan onze ex vivo bursal cel cultuur model, had slechts één studie gekenmerkt de cellulaire reactie van B-cellen op IBDV infectie19; echter, deze studie gebruikt een vereeuwigd B cellijn die was omgetoverd als gevolg van infectie met ALV, beperking van de conclusies die kunnen worden aangebracht. Daarentegen kan de ex vivo -model van IBDV infectie beschreven hier onderzoekers te behouden van de voordelen van in vitro studies, zoals de gedefinieerde MOIs en tijd-punten, terwijl het bestuderen van de interactie van het virus met de relevante gastheercel. Als de primaire bursal cellen zijn verkregen uit niet-geïnfecteerde BF weefsel, er zijn geen inflammatoire of T-cellen aanwezig, en we hebben aangetoond door stroom cytometry (met behulp van standaardvoorwaarden) dat volgende chCD40L stimulatie, 97% van de bevolking van de cel is positief voor de markering van de B-cel Bu-1 (gegevens niet weergegeven). Gezien het feit dat 3% van de cellen Bu-1 negatief, het zal interessant zijn om te bepalen of deze cellen met IBDV besmet raken en hun genexpressie en bijdrage aan de pathogenese verkennen.
Wij verwachten dat de ex vivo kip primaire bursal cel cultuur model kan ook worden uitgebreid om te bestuderen van de gastheer cel-virus interacties van andere B-cel tropic virussen infecteren van de kippen, zoals ALV of REV, en kan ook worden uitgebreid tot andere vogelsoorten ( bijvoorbeeldeenden en kalkoenen). De mogelijkheid om ook primaire bursal cellen ex vivo cultuur biedt de mogelijkheid te bestuderen van aspecten van de pathogenese en de immuunsuppressie veroorzaakt door deze virussen zonder de noodzaak om het infecteren van vogels. Als in vivo studies aanzienlijke morbiditeit veroorzaken, zal dit hebben een aanzienlijke invloed op de vervanging, verfijning en vermindering van het gebruik van dieren in het onderzoek.
Kortom, de ex vivo kip primaire bursal cel cultuur model hier beschreven heeft het potentieel om uit te breiden van het begrip van hoe aviaire B-cel tropic virussen interactie met de cellen van hun gastheer terwijl het verminderen van het aantal vogels gebruikt in in vivo studies van de infectie. De technieken kunnen worden toegepast op meerdere lymfoïde organen, meerdere virussen en, potentieel, meerdere soorten vogels, waardoor het een aantrekkelijk model dat tot de aviaire velden op het gebied van virologie en immunologie bijdragen kan.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank het Animal Services-team aan het Pirbright Instituut voor hun expertise in broedeieren fokken en de vogels en de expertise van Caroline Holt cohorten aseptisch verwijderen van de slijmbeurs van Fabricius. A.B. wordt gefinancierd door de biotechnologie en biologische wetenschappen onderzoek Raad (BBSRC) via verlenen BBS/E/I/00001845, K.D. wordt gefinancierd via de BBSRC via studententijd BBS/E/I/00002115, en A.A. wordt gefinancierd door het nationaal centrum voor de Vervanging, verfijning en vermindering van dieren in het onderzoek (NC3Rs) via verlenen NC/R001138/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
| FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56 °C for 1 h |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
| 0.22 µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl22 - MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
| Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
| Insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
| 100 µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
| Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
| Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Hoerr, F. J.
- Schermuly, J., et al. In vitro model for lytic replication, latency, and transformation of an oncogenic alphaherpesvirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7279-7284 (2015).
- Farhanah, M. I., et al. Bursal immunopathology responses of specific-pathogen-free chickens and red jungle fowl infected with very virulent infectious bursal disease virus. Archives of Virology. , (2018).
- Farhanah, M. I., et al. Bursal transcriptome profiling of different inbred chicken lines reveals key differentially expressed genes at 3 days post-infection with very virulent infectious bursal disease virus. Journal of General Virology. 99 (1), 21-35 (2018).
- Guo, X., et al. Differential expression of the Toll-like receptor pathway and related genes of chicken bursa after experimental infection with infectious bursa disease virus. Archives of Virology. 157 (11), 2189-2199 (2012).
- He, X., et al. Differential Regulation of chTLR3 by Infectious Bursal Disease Viruses with Different Virulence. In Vitro and In Vivo. Viral Immunology. 30 (7), 490-499 (2017).
- Ou, C., et al. Transcription profiles of the responses of chicken bursae of Fabricius to IBDV in different timing phases. Virology Journal. 14 (1), 93 (2017).
- Rasoli, M., et al. Differential modulation of immune response and cytokine profiles in the bursae and spleen of chickens infected with very virulent infectious bursal disease virus. BMC Veterinary Research. 11, 75 (2015).
- Ruby, T., et al. Transcriptional profiling reveals a possible role for the timing of the inflammatory response in determining susceptibility to a viral infection. Journal of Virology. 80 (18), 9207-9216 (2006).
- Smith, J., et al. Analysis of the early immune response to infection by infectious bursal disease virus in chickens differing in their resistance to the disease. Journal of Virology. 89 (5), 2469-2482 (2015).
- Tregaskes, C. A., et al. Conservation of biological properties of the CD40 ligand, CD154 in a non-mammalian vertebrate. Developmental & Comparative Immunology. 29 (4), 361-374 (2005).
- Kothlow, S., et al. CD40 ligand supports the long-term maintenance and differentiation of chicken B cells in culture. Developmental & Comparative Immunology. 32 (9), 1015-1026 (2008).
- Dulwich, K. L., et al. Differential gene expression in chicken primary B cells infected ex vivo with attenuated and very virulent strains of infectious bursal disease virus (IBDV). Journal of General Virology. 98 (12), 2918-2930 (2017).
- Soubies, S. M., et al. Propagation and titration of infectious bursal disease virus, including non-cell-culture-adapted strains, using ex vivo-stimulated chicken bursal cells. Avian Pathology. 47 (2), 179-188 (2018).
- Reed, L., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 494-497 (1938).
- Hui, R. K., Leung, F. C. Differential Expression Profile of Chicken Embryo Fibroblast DF-1 Cells Infected with Cell-Adapted Infectious Bursal Disease Virus. PLoS One. 10 (6), e0111771 (2015).
- Li, Y. P., et al. Transcriptional profiles of chicken embryo cell cultures following infection with infectious bursal disease virus. Archives of Virology. 152 (3), 463-478 (2007).
- Lin, J., et al. Genome-wide profiling of chicken dendritic cell response to infectious bursal disease. BMC Genomics. 17 (1), 878 (2016).
- Quan, R., et al. Transcriptional profiles in bursal B-lymphoid DT40 cells infected with very virulent infectious bursal disease virus. Virology Journal. 14 (1), 7 (2017).
- Wong, R. T., et al. Screening of differentially expressed transcripts in infectious bursal disease virus-induced apoptotic chicken embryonic fibroblasts by using cDNA microarrays. Journal of General Virology. 88 (Pt 6), 1785-1796 (2007).
