Summary
Aquí describimos el aislamiento de las células bursal primarias del pollo de la bolsa de Fabricio, la cultura y la infección de las células con virus de la enfermedad bursal infecciosa y la cuantificación de la replicación viral.
Abstract
Virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa (VEIB) es un birnavirus de importancia económica para la industria avícola. El virus infecta las células de B, causando inmunosupresión, morbilidad y mortalidad en la aves infectadas. En este estudio, describimos el aislamiento de las células bursal primarias del pollo de la bolsa de Fabricio, la cultura y la infección de las células con VEIB y la cuantificación de la replicación viral. La adición de ligando de CD40 de pollo aumentó significativamente la proliferación celular cuatro veces en seis días de la cultura y de la viabilidad celular significativamente mejorada. Dos cepas de VEIB, un cultivo celular adaptado cepa D78 y una cepa muy virulenta, UK661, bien en los cultivos de células ex vivo . Este modelo será de utilidad en la determinación de cómo las células responden a la infección del VEIB y permitirán una reducción en el número de aves infectadas en estudios de patogénesis del VEIB. El modelo también puede ser ampliado para incluir otros virus y puede ser aplicado a diferentes especies de aves.
Introduction
La industria avícola mundial es esencial para garantizar suficientes alimentos para una creciente población humana. Sin embargo, la inmunosupresión es la amenaza a la seguridad alimentaria y el bienestar de las aves afectadas y representa un desafío económico clave para la industria. La mayoría de los casos de inmunodepresión en los pollos es causada por la infección con los virus inmunosupresores, con los más responsables de alterar la inmunidad adquirida tiene un tropismo por los linfocitos de T y B1. En las aves, la mayoría de las células B se encuentran dentro de un órgano conocido como la bolsa de Fabricio (BF). Las células de B son susceptibles a la infección por varios virus inmunosupresores, incluidos los que causan lisis, como el virus de la enfermedad de VEIB y Marek (MDV) y los causantes de la transformación, como el virus de la leucosis aviar (ALV) y () virus de la reticuloendoteliosis REV).
Con el fin de desarrollar mejores estrategias para el control de estas infecciones, es esencial para caracterizar la interacción de los virus con las células de pollo B. Sin embargo, cuando se eliminan las células de B de un pájaro, no sobreviven bien en vivo ex cultura2, lo que dificulta realizar un análisis exhaustivo de las interacciones de VEIB con células de pollo B, o los acontecimientos tempranos después de la infección de ALV o REV. En consecuencia, muchas interacciones de célula virus host han sido estudiados en vivo3,4,5,6,7,8,9, 10. Aunque estos estudios son de caracter informativos, involucran el uso de aves infectadas que sufren de enfermedades que pueden ser graves.
El ligando de CD40 es una molécula que induce la proliferación de células B11. Tras la identificación del pollo codificación gen CD40L (chCD40L), una proteína de fusión soluble fue diseñada que, cuando se añade a los medios de cultivo, indujo la proliferación de pollo primaria B células ex vivo12. En 2015, B células cultivadas de esta manera fueron encontradas apoyar la replicación de MDV2 y en el 2017, nosotros y otros encontrado que primaria bursal las células estimuladas con chCD40L podrían utilizarse como modelo para el estudio de VEIB replicación13,14. Aquí, describimos el aislamiento y cultivo de células bursal primaria de pollo, la infección de las células con VEIB y la cuantificación de la replicación viral. Aunque se describe el método en el contexto de la BF, esto podría aplicarse a aislamiento y cultivo de células de diferentes órganos linfoides.
Protocol
Todos los procedimientos con animales deben ser éticamente aprobados de antemano. En nuestra institución, se realizan todos los procedimientos de conformidad con la ley de Reino Unido animales (procedimientos científicos) de 1986 bajo licencia de proyecto, Personal y establecimiento de domicilio, después de la aprobación del Bienestar Animal interno y la Junta de revisión ética (AWERB).
1. preparación de chCD40L
- Construcción cultura HEK 293-msCD8-CD40L las células que expresan de forma estable un chCD40L soluble en 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% inactivado con calor (Hola) suero fetal de ternero (FCS) y 1 puromicina μg/mL a 37 ° C en atmósfera con 5% CO 2.
Nota: Estas células están disponibles desde el Instituto de Pirbright tras la firma del acuerdo de transferencia de material apropiado. - Dividir las células en una densidad de 1:5 cuando confluente. Recoger el sobrenadante (que contiene la construcción de chCD40L soluble) cada vez que las células se dividen, centrifugar a 400 x g durante 5 min eliminar los residuos celulares y almacenar a 4 ° C.
- Cuando se han recogido 500 mL del sobrenadante, el líquido de la piscina y filtro-esterilizar mediante filtro 0.2 μm.
- Concentran el sobrenadante utilizando concentradores centrífugos de proteína con un peso molecular de corte de 10 K según las instrucciones del fabricante. Extraer el sobrenadante concentrado de cada columna, piscina juntos y filtro-esterilizar haciéndola pasar por un filtro de jeringa de 0,22 μm.
- Determinar la concentración final para ser utilizado en experimentos en serie diluyendo la solución de chCD40L 1 x Iscove modificado de Dulbecco medio (IMDM) (se describe en el paso 2.4) y cultivo las células primarias bursal en presencia de las diluciones. Determinar el número y porcentaje de viabilidad de las células diariamente por hasta una semana.
Nota: La concentración más baja que la proliferación celular y la viabilidad son adecuadas es la concentración a utilizar en el ensayo. Esto suele ser entre 1:20 y 1:50.
2. preparación de soluciones para el aislamiento primario de la célula Bursal de pollo
- Preparar 1 x solución salina equilibrada de Hanks (HBBS) con calcio (Ca) agregando 10 mL de 10 x HBBS con Ca a 90 mL de H2O y 0.47 estéril μl de 7.5% de NaHCO3.
- Preparar solución stock de colagenasa D 8 mg/ml en 1 x HBBS con filtro de Ca. esterilizar la solución a través de un filtro de 0.2 μm.
Nota: Es recomendable preparar alícuotas de 5 mL y congelar a-20 ° C. - Preparar 1 x RPMI medio suplementado con 5% Hola FCS. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C.
- Preparar 1 x 500 mL de IMDM suplementado con 8% Hola FCS, 2% Hola pollo suero, β-mercaptoetanol de 50 mM, 50 μl de insulina-transferrina-selenito de sodio y 1% de penicilina/estreptomicina. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C.
Nota: Preparar todas las soluciones mencionadas con antelación. - Preparar 1 x HBBS con aprox. tienda la solución en el hielo.
- Preparar 1 x HBBS sin Ca añadiendo 10 mL de 10 x HBBS sin Ca y 90 mL de estéril H2O, 0.47 μl de 7.5% de NaHCO3y EDTA a una concentración final de 10 mM. Almacenar la solución en el hielo.
- Preparar solución de colagenasa D x 1 añadiendo 5 mL de solución stock de colagenasa D y 13 mL de HBBS con Ca para hacer un total de 18 mL. Almacenar la solución en el hielo.
Nota: Preparar las soluciones mencionadas en pasos de 2.5 – 2.7 en el día del experimento.
3. extracción de la Bursa de Fabricio (BF)
- Posterior y hatch pollos en un centro adecuado, aprobado y humanamente sacrificar a 2 – 3 semanas de edad.
Nota: Utilice métodos aprobados por el Instituto para el sacrificio. -
Recoger el BF de cada pollo utilizando técnicas asépticas.
Nota: Use los protocolos en vigor en la institución.- Colocar el cadáver en dorsal recumbency y esterilizar la piel y plumas superponiendo el abdomen y el tórax con una solución de etanol al 70%, diluido en agua.
- Haga una incisión de línea media ventral en el abdomen utilizando un bisturí esterilizado o tijeras.
- Coloque la bolsa de Fabricio, que está conectado a la sección caudal de la Colón, craneal a la cloaca.
- Usando pinzas esterilizadas y las tijeras, cortadas la bolsa de Fabricio de los dos puntos. Tenga cuidado de no perforar el intestino.
- Colocar el órgano en PBS frío y traslado al laboratorio en hielo.
Nota: debe aislarse células primarias tan pronto como sea posible después de la cosecha de órganos.
4. aislamiento de células Bursal primaria de pollo
- Trabajo en un gabinete de seguridad lavar el BF por lo menos 3 x en 30 mL de PBS frío.
- Transferir el tejido a una placa Petri (a 92 mm de diámetro y 21 mm de altura) y añadir 5 mL de solución de colagenasa D x 1.
- Utilizando tijeras estériles o una hoja de bisturí, corte el BF en trozos de menos de 5 mm de diámetro.
- Incubar el tejido a 37 ° C con agitación periódica apacible durante 30 minutos.
Nota: Comenzará a la solución de la colagenasa digerir el tejido. - Repetidamente usando una pipeta Pasteur estéril, aspirar la mezcla para fomentar la desintegración de los tejidos. Si es necesario, cortar el tejido en trozos más pequeños.
- Añadir otros 5 mL de solución de D de colagenasa de x 1 en el tejido e incubar a 37 ° C con agitación periódica apacible durante otros 30 minutos.
- Repita los pasos del 4.6 y 4.7 hasta que el tejido se digiere totalmente.
Nota: Habrá pequeños gránulos que no se disuelven más. - Pasar la suspensión celular a través de un tamiz de celular 100 μm a 20 mL de 1 x HBBS sin Ca.
- Centrifugue la suspensión de células a 400 x g durante 5 minutos.
- Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 mL de 1 x RPMI con 5% de FCS.
- Superposición de 10 mL de la suspensión de células en 5 mL de medio de gradiente de densidad que contiene polysucrose y sodio Diatrizoato o arpillera de 5 mL de medio gradiente de densidad por debajo de la suspensión de células de 10 mL. Asegúrese de que hay una interfaz transparente entre los dos.
- Centrifugue la superposición a 900 x g por 20 min a 4 ° C. Baje o retire la rotura de la centrifugadora.
Nota: Las células forman una banda en la interfaz entre los medios de comunicación de la célula y el medio de gradiente de densidad. - Utilizando una pipeta Pasteur estéril, sacar las células y en PBS frío. Lavar las células 3 x por centrifugación a 400 x g durante 5 min y resuspender en PBS frío.
5. cultivo de células Bursal primaria de pollo
- Centrifugue la suspensión de células a 400 x g durante 5 min y resuspender en 1 x completo IMDM.
- Tomar una alícuota de la suspensión de células, agrega a una solución de azul de tripano y contar el número de células viables que excluyen el tripán azul. Determinar el número de células y el porcentaje de viabilidad.
- Centrifugue la suspensión de células a 400 x g durante 5 min y resuspender en completa IMDM suplementado con un 1:20 dilución de pollo CD40L en una densidad de 1 x 107 células/mL. Valorar el sobrenadante concentrado que contiene el chCD40L para determinar la dilución óptima, que es probable que mienten en la gama de 1:10 a 1:50.
- La cultura las células ya sea 24 o 96 pocillos las placas a 37 ° C para placas de 96 pocillos de fondo en U de 48 – 72 h. son preferibles a las placas de fondo plano.
Nota: Las células también pueden ser cultivadas a 40 ° C
6. infección de células primarias de Bursal pollo con VEIB
- aislamiento después de 48-72 h, descongele una alícuota del virus, vórtice de la muestra y almacenar en hielo.
- Resuspender las células primarias bursal, tomar alícuotas de la suspensión de células a 10 μl, añadir a 10 μl de una solución de azul de tripano y determinar el número de células y el porcentaje de viabilidad.
- Diluir el virus en 1 x IMDM completa a la correspondiente multiplicidad de infección (MOI) para que el virus del inóculo y vortex.
- Centrifugue la suspensión de células a 400 x g durante 5 minutos.
- Quite el sobrenadante y resuspender las células en el inóculo de virus.
- Incubar la suspensión de células a 37 ° C por 1 h con agitación periódica.
- Centrifugue la suspensión de células a 400 x g durante 5 min, eliminar el inóculo de virus y lavar las células 1 x medios IMDM completo.
- Centrifugue la suspensión de células a 400 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante y resuspender las células en medios completo IMDM suplementados con pollo CD40L en una densidad de 1 x 107 células por mL.
- Cultura las células ya sea 24 o 96 pocillos las placas a 37 ° C.
Nota: Las células también pueden ser cultivadas a 40 ° C
7. cuantificación de VEIB replicación en las células Bursal primarias de pollo
- En el postinfection de punto del tiempo deseado, resuspender las células, transferirlos a un tubo adecuado, centrifugar a 400 x g durante 5 min y recoger el sobrenadante para la titulación de virus por ensayo de placa o ensayo TCID50 según Reed-Muench método15.
- Lavar las células en 1 mL de PBS y prepararlos para immunostaining con un anticuerpo específico de VEIB, o extracto de RNA con un kit adecuado (siguiendo las instrucciones del fabricante) y realizar la cadena de la polimerasa cuantitativa de reversa de la transcripción reacción (RT-qPCR) utilizando cebadores específicos para un gen VEIB (delantero, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Atrás, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Cultivos celulares infectados con Mock deben utilizarse como un control.
Representative Results
Pollo primaria Bursal células pueden cultivarse en presencia de CD40L de pollo
Cuando las células bursal primarias pollo fueron cultivadas en presencia de chCD40L soluble, cuadruplicado el número de células de 9.02 x 105 a 3.63 x 106 / mL durante un período de 6 días, a diferencia de cuando estaba ausente (p < 0.05) ( Figura 1A). Viabilidad celular también mejoró significativamente, por ejemplo del 25% en la cultura posterior al día 3 en ausencia de chCD40L al 48% en presencia de chCD40L (p < 0.05) (figura 1B)13.
Las células Bursal primarias pollo pueden apoyar la replicación de ambos cultivos celulares adaptados y cepas muy virulentas de VEIB
Cultivos celulares infectados con mofa e infectadas se fijaron h 18 agentes, marcado con un anticuerpo monoclonal contra VEIB VP2 y un anticuerpo secundario conjugado a Alexa Fluor 488 y contratinción con DAPI. Las células infectadas tenían evidencia de fluorescencia verde alrededor del núcleo (figura 2A), consistente con la presencia de VEIB en el citoplasma. Esto fue evidente para dos cepas de VEIB, adaptado de un cultivo de células cepa D78 y una cepa muy virulenta, UK661 (figura 2A). 5, 18, 24, y el postinfection de 48 h, ARN fue extraído de cultivos infectados y sometido a RT-qPCR con cebadores específicos a una región conservada del gen VP4 VEIB. La expresión de VP4 fue normalizada para el mantenimiento de la casa gen TBP primero y luego expresada como cambio de pliegue en relación con las muestras simuladas en un análisis ΔΔCt. Expresión de VP4 VEIB aumentó a 16.603 copias en el postinfection de 48 h con D78 y 38.632 copias en el postinfection de 48 h con UK661. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que las células primarias bursal de pollo podrían apoyar la replicación de la célula cultura adaptados y muy virulentas VEIB cepas13.
Figura 1: principales células bursal pollo pueden cultivarse en presencia de pollo CD40L. Las células bursal primarias pollo fueron cultivadas en la presencia o ausencia de chCD40L (negro barras y barras blancas, respectivamente). (A) el número de células vivas y (B) se determinó el porcentaje de células viables en el postinfection de puntos de tiempo indicados. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos replicados, las barras de error representan el desvío estándar de la media y la significación estadística se determinó usando pares del estudiante t-pruebas en cada momento, * p < 0.05. en esta figura se ha modificado con permiso de Dulwich et al. 13.
Figura 2: principal células bursal pollo pueden apoyar la replicación de ambos-cultivo celular adaptado y cepas muy virulentas de VEIB. (A) las células bursal primarias pollo fueron mock-infectados o infectadas con D78 o UK661 y una muestra de cada cultura era fijo, marcada y reflejada: VP2 del VEIB, verde; núcleos, azul. Barra de escala = 7 μm. (B) el RNA se extrajo en el postinfection de puntos de tiempo indicados, transcripción inversa, y una región conservada del gen VP4 VEIB fue amplificada por PCR cuantitativa. El doblez de10 log cambio en VP4 copia número normalizado para el gene TBP limpieza y expresado en relación con mock infectados muestras según el métodoΔΔCT 2–. Los datos mostrados son representativos de al menos tres experimentos repetidos, y las barras de error representan el desvío estándar de la media. Esta figura ha sido modificada con permiso de Dulwich et al. 13.
Discussion
En este estudio, describimos la exitosa cultura de pollo las células primarias de bursal ex vivo en presencia de chCD40L soluble y demostrar que estas células pueden apoyar la replicación de una cepa atenuada y una cepa muy virulenta de VEIB. Este modelo ex vivo se puede utilizar para determinar cómo las células responden a un VEIB infección13, que tiene distintas ventajas sobre los estudios en vivo y en vitro .
Cuando se cosecha el BF, es fundamental para no pinchar la tripa para evitar la contaminación bacteriana de las células aisladas de bursal. Además, es importante aislar las células primarias tan pronto como sea posible después de la cosecha de órganos para limitar la muerte celular. La necesidad de usar chCD40L es una limitación de la técnica; sin embargo, trabajo realizado por Soubies et al muestra que el uso de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) para prolongar la viabilidad de las células bursal en lugar de chCD40L14 puede permitir el modelo a ser adoptado por un mayor número de laboratorios. El protocolo descrito determina la concentración óptima de chCD40L empíricamente, por cultivo de células primarias B en concentraciones diluidas en serie de la molécula y observar la proliferación celular y la viabilidad. Podría ser una potencial modificación del protocolo para purificar la molécula chCD40L y agregar una concentración específica a los medios de cultivo celular para evitar la variabilidad lote a lote.
In vivo los estudios han demostrado esa Infección siguiente de VEIB, que hay un aumento en la expresión de genes involucrados en las respuestas de citoquinas pro inflamatorias, las respuestas IFN tipo I y apoptosis en el BF5,9,10 . Sin embargo, después de la infección, hay un influjo de células inflamatorias y células efectoras T en el BF, que se diferencian en los genes que se expresan en comparación con la población de células B infectadas9. Por lo tanto, es difícil de interpretar como infectado las células responden a VEIB. Para hacer frente a esto, algunos grupos de investigación han caracterizado la respuesta transcripcional de células infectadas con VEIB en cultura16,17,18,19,20. Estos estudios en vitro tienen la ventaja de MOIs bien definidas y puntos temporales postinfection. Sin embargo, estudios en vitro han caracterizado típicamente en fibroblastos de las células16,17,20 o células dendríticas18. Mientras no se overinterpreted proporcionar información en las interacciones célula-VEIB de host, la creencia actual es que la infección de las células de B es crucial y la patogenesia del VEIB, por lo tanto, la relevancia de los datos. Antes de nuestro ex vivo bursal cultura modelo de célula, solamente un estudio había caracterizado la respuesta celular de las células B a VEIB infección19; sin embargo, este estudio utilizó una línea de células B inmortalizadas transformada debido a la infección con ALV, limitan las conclusiones que se podían hacer. En contraste, el modelo ex vivo de infección VEIB aquí descrito permite a los investigadores conservar las ventajas de los estudios en vitro , como MOIs y momentos, mientras estudia las interacciones del virus con su célula huésped pertinentes. Como las células bursal primarias se obtienen de tejido no infectado de BF, hay no inflamatoria o las células T presentes y nos hemos demostrado por flujo citometría (con condiciones estándares) que, después del estímulo chCD40L, 97% de la población de la célula es positivo para el marcador de células B Bu-1 (datos no mostrados). Dado que el 3% de las células son Bu-1 negativo, sería interesante determinar si estas células se infectan con VEIB y explorar su expresión génica y su contribución a la patogenia.
Anticipamos que el modelo de cultura ex vivo pollo bursal primario de la célula también se puede ampliar para estudiar las interacciones de la célula virus host de otros virus Trópico de células B infectar pollos, como ALV o REV y podría ampliarse también a otras especies de aves ( por ejemplo, patos o pavos). La capacidad de las células primarias de bursal ex vivo la cultura también abre la posibilidad para estudiar aspectos de la patogenesia y la inmunosupresión causada por estos virus sin necesidad de infectar a las aves. Como en vivo estudios causan una morbilidad significativa, esto tendrá un impacto sustancial sobre el reemplazo, el refinamiento y la reducción del uso de animales en investigación.
En Resumen, el ex vivo pollo bursal primario de la célula cultura modelo descrito aquí tiene el potencial para ampliar la comprensión de la célula de B Cómo aviar virus trópico interactúan con las células de su huésped reduciendo el número de aves en vivo en estudios de infección. Las técnicas pueden aplicarse a múltiples órganos linfoides, múltiples virus y, potencialmente, múltiples especies de aves, lo que es un modelo atractivo que puede contribuir a los campos de Inmunología y virología aviares.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al equipo de servicios de Animal en el Instituto de Pirbright por su experiencia en incubación, cría y sacrificio de aves y la experiencia de Caroline Holt en la eliminación de forma aséptica la bolsa de Fabricio. A.B. es financiado a través de la biotecnología y Consejo de investigación de ciencias biológicas (BBSRC) vía concesión BBS/E / / 00001845, K.D. es financiado por el BBSRC vía beca BBS/E / / 00002115, y A.A. está financiado a través del centro nacional para la Reemplazo, refinamiento y reducción de animales en investigación (NC3Rs) a través de concesión R001138/NC/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
| FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56 °C for 1 h |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
| 0.22 µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl22 - MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
| Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
| Insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
| 100 µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
| Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
| Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
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