Summary
Burada tavuk birincil bursal hücrelerden bursa of Fabricius, kültür ve bulaşıcı bursal hastalık virüs içeren hücrelerin enfeksiyon ve viral çoğaltma miktar yalıtım açıklayın.
Abstract
Bursal bulaşıcı hastalık virüstür (IBDV) kanatlı sektörüne ekonomik öneme sahip bir birnavirus. Virüs B hücreleri, morbidite, mortalite ve immünosupresyon virüslü kuşlar neden bozar. Bu çalışmada, tavuk birincil bursal hücrelerden bursa of Fabricius, kültür ve IBDV içeren hücrelerin enfeksiyon ve viral çoğaltma miktar yalıtım açıklar. Tavuk CD40 ligand eklenmesi önemli ölçüde hücre çoğalması kat altı gün kültür ve önemli ölçüde gelişmiş hücre canlılığı arttı. IBDV iki soyu, hücre kültürü zorlanma, D78 ve çok şiddetli bir zorlanma, UK661, de ex vivo hücre kültürde çoğaltılan uyarlanmış. Bu model nasıl hücreleri ve IBDV enfeksiyon için cevap virüslü kuşlar IBDV patogenezinde çalışmalarda kullanılan sayısında bir azalma verecektir belirlenmesinde kullanımı olacaktır. Modeli de diğer virüsler kapsayacak şekilde genişletildi ve kuşlar farklı türler için uygulanabilir.
Introduction
Küresel Tavukçuluk sanayi genişleyen bir insan popülasyon için yeterli gıda güvenliğini sağlamak için önemlidir. Ancak, immünosupresyon gıda güvenliği için tehdit ve etkilenen kuşların refah ve sanayi için önemli bir ekonomik sorun temsil eder. Tavuklarda immünosupresyon vakalarının büyük çoğunluğu bu sonradan kazanılan bir tropism T ve B lenfositler1için sahip bağışıklık bozulması için en sorumlu olan immünsüpresif virüs enfeksiyonu nedeniyle. Kuşlar, B hücreleri çoğunluğu bursa of Fabricius (BF) bilinen bir organ içinde yer almaktadır. B hücre lizis, IBDV ve Marek'ın hastalığı virüsü (MDV), gibi neden ve dönüşümü, kuş lökozu virüs (ALV) ve reticuloendotheliosis virüs (gibi neden dahil olmak üzere birkaç immünsüpresif virüs enfeksiyonu yatkındır REV).
Bu enfeksiyonlar kontrol etmek için daha iyi stratejiler geliştirmek amacıyla, belgili tanımlık virüs etkileşim tavuk B hücreleri ile karakterize etmek için esastır. B hücreleri bir kuştan kaldırılır, ancak, IBDV etkileşimleri tavuk B hücreleri veya ALV veya REV enfeksiyonu takip erken olayları ile ayrıntılı bir analiz gerçekleştirmek üzere de ex vivo kültür2, hayatta değil. Sonuç olarak, birçok ana hücre-virüs etkileşimleri okudu vivo içinde3,4,5,6,7,8,9oldunuz. 10. Bu çalışmalar bilgilendirici olsa da, onlar ağır olabilir hastalıklardan muzdarip virüslü kuşlar kullanımını içerir.
CD40 ligand B hücre proliferasyonu11indükler bir moleküldür. Kimlik (chCD40L) gen kodlama tavuk CD40L, çözünür füzyon proteini mühendislik, kültür ortamına eklendiğinde, tavuk birincil B hücreleri ex vivo12yayılması indüklenen. 2015 yılında bu şekilde kültürlü B hücreleri çoğaltma MDV2 ve 2017 yılında, biz ve diğerleri desteklemek için birincil bursal hücre chCD40L ile uyarılan IBDV çoğaltma13,14çalışma için bir model olarak kullanılabilir bulundu bulundu. Burada, yalıtım ve kültür tavuk birincil bursal hücre, hücre IBDV ile enfeksiyon ve viral çoğaltma miktar açıklayın. Her ne kadar biz BF bağlamında yöntemi açıklamak, bu farklı lenfoid organ izole etmek ve kültür hücrelere uygulanan olabilir.
Protocol
Hayvanlarla tüm yordamları etik önceden onaylanması gerekir. Kuruluşumuz, tüm yordamlar iç hayvan refahı ve etik İnceleme Kurulu (AWERB) onaylandıktan sonra İçişleri Bakanlığı kuruluş, kişisel ve proje lisansları, İngiltere'de hayvan (bilimsel yordamlar) Yasası 1986 uygun olarak gerçekleştirilir.
1. chCD40L hazırlanması
- Stabil bir çözünür chCD40L hızlı kültür HEK 293-msCD8-CD40L hücreleri inşa 1 x %10 ile ısı inaktive takıma Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) Orta (Merhaba) fetal buzağı serum (FCS) ve % 5 içeren bir ortamda 37 ° C'de 1 µg/mL puromisindir CO 2.
Not: Bu hücreler Pirbright uygun malzeme transfer anlaşması imzalanması sonrasında Enstitüsü'nden kullanılabilir. - Konfluent ne zaman 1:5 yoğunluğu, hücreleri bölün. Toplamak (çözünür chCD40L yapı içeren) süpernatant her seferinde hücreleri bölme, 400 x g hücresel enkaz kaldırma ve 4 ° C'de depolamak 5 min için de santrifüj kapasitesi
- Toplanan 500 mL süpernatant sıvı havuz ve filtre sterilize-bu 0.2 µm filtreden.
- 10 k üretici yönergelerine göre bir molekül ağırlıklı kesim ile santrifüj protein yoğunlaştırıcıları kullanarak süpernatant konsantre. Konsantre süpernatant her sütundan ayıklamak, birlikte havuz ve filtre-bu bir 0,22 µm şırınga filtreden geçirilerek sterilize.
- Seri olarak 1 chCD40L çözümünde sulandrarak deneylerde kullanılacak son konsantrasyonu belirlemek x Iscove'nın modifiye Dulbecco'nın orta (IMDM) (açıklandığı adım 2,4) ve dilutions huzurunda kodlamayla birincil bursal hücreleri. Bir haftaya kadar her gün için hücrelerin sayısı ve yüzdesi canlılığı belirlemek.
Not: hücre çoğalması ve canlılığı yeterli nerede en düşük konsantrasyon assay olarak kullanmak için bölgedir. Bu 1:20 ile 1:50 arasında olması muhtemeldir.
2. tavuk birincil Bursal hücre izolasyon için çözümler hazırlanması
- 1 Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBBS) x 90 mL steril H2O ve 0,47 Ca ile 10 x HBBS 10 mL ekleyerek kalsiyum (Ca) ile hazırlamak µL % 7.5 NaHCO3.
- Collagenase D hisse senedi eriyik 8 mg/mL Ca. filtre sterilize etmek ile 1 x HBBS içinde vasıl belgili tanımlık eriyik 0.2 µM filtreden hazırlayın.
Not: 5 mL aliquots hazırlamak ve bunları-20 ° C'de dondurmak için tavsiye edilir - 1 hazırlamak x RPMI orta takıma % 5 ile Merhaba FCS. Medya 4 ° C'de depolayın
- Hazırlamak IMDM 1 x 500 mL takıma %8 ile Merhaba FCS, % 2 Merhaba tavuk serum, 50 mM β-mercaptoethanol, insülin transferrin Sodyum selenit ve % 1 penisilin/streptomisin 50 µL. Medya 4 ° C'de depolayın
Not: yukarıda belirtilen çözümleri önceden hazırlayın. - 1 x HBBS Ca. Store ile çözüm buz üzerinde hazırlamak.
- 1 x HBBS olmadan Ca Ca olmadan 10 x HBBS 10 mL steril H2O, 0,47 µL % 7.5 NaHCO3ve EDTA adlı 10 mM son bir konsantrasyon 90 mL ekleyerek hazırlayın. Çözüm buz üstünde depolar.
- 1 x collagenase D çözüm HBBS 18 mL toplamda yapmak Ca ile 13 mL 5 mL collagenase D stok çözeltisi eklenerek hazırlayın. Çözüm buz üstünde depolar.
Not: belirtilen adımları 2.5-2.7 denemenin gün çözümleri hazırlayın.
3. Bursa of Fabricius (BF) kaldırılması
- Kapak ve arka tavuk uygun, onaylanmış bir tesis ve insancıl onları itlaf 2-3 hafta-in yaş.
Not: yüzey kaldırma için Enstitüsü onaylı yöntemleri kullanın. -
BF aseptik teknikler kullanarak her tavuktan toplamak.
Not: kurum yerde iletişim kurallarını kullanın.- Karkas dorsal recumbency yerleştirin ve deri ve tüyler suda seyreltilmiş % 70 etanol çözeltisi ile karın ve göğüs overlaying sterilize.
- Ventral ensizyon alt karın bir steril neşter veya makas kullanılarak olun.
- İki nokta üst üste, lağım için kafatası kaudal bölümüne bağlı bursa of Fabricius bulun.
- Steril forseps ve bursa of Fabricius kolon ücretsiz kesme Makası kullanarak. Gut delinme önlemek için dikkat ediniz.
- Org soğuk PBS yerleştirin ve buza laboratuvara aktar.
Not: Primer hücre en kısa zamanda organ hasat sonrası yalıtılması gerekir.
4. yalıtım tavuk birincil Bursal hücre
- Mikrobiyolojik güvenlik kabini, çalışma yıkama BF en az 3 x 30 ml soğuk PBS.
- Petri kabına (92 mm çapında, 21 mm içinde yükseklik) doku aktarmak ve 5 mL 1 x collagenase D çözeltisi ekleyin.
- Steril makas ya da daha az 5 mm çapında parçalarını BF oyulmuş bir neşter bıçak kullanıyor.
- 30 dk için periyodik nazik ajitasyon ile 37 ° C'de doku kuluçkaya.
Not: Collagenase çözüm doku sindirmeye başlayacak. - Steril bir Pasteur pipet kullanarak, art arda dokuya dağılması teşvik karışımı Aspire edin. Gerekirse, doku daha küçük parçalar halinde kesin.
- Başka bir 5 mL 1 x collagenase D çözeltisi için doku ekleyin ve başka bir 30 dk için periyodik nazik ajitasyon ile 37 ° C'de kuluçkaya.
- Doku tamamen sindirilmiş 4,6 ve 4,7 tamamlayana dek.
Not: Daha fazla geçiyoruz değil küçük tanecikler olacak. - Hücre süspansiyon 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla Ca olmadan 1 x HBBS 20 mL içine geçmek.
- 400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant atmak ve Pelet 10 mL 1 resuspend x RPMI % 5 FCS ile.
- 10 mL 5 mL polysucrose ve sodyum diatrizoate içeren yoğunluk gradient medya de üstüne hücre süspansiyon yerleşimi veya yoğunluk gradient medya 10 mL hücre süspansiyon altında 5 mL altına koymak. İkisi arasında bir açık arayüz olduğundan emin olun.
- Yerleşimi, 900 x g 4 ° C'de 20 dk için santrifüj kapasitesi Alt veya santrifüj sonunu kaldırmak.
Not: Hücreleri bir grup hücre medya ve yoğunluk gradient medya arayüzü oluşturmalıdır. - Steril bir Pasteur pipet kullanarak, hücre kaldırma ve soğuk PBS koyun. 3 hücreleri yıkama x 400 x g 5 min için de centrifuging ve onları soğuk PBS resuspending.
5. kültür tavuk birincil Bursal hücre
- 400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve onları tam IMDM x 1 resuspend.
- Bir aliquot hücre süspansiyon al, Trypan mavi ekleyin ve mavi Trypan dışı hücrelerin sayısını saymak. Hücreleri ve yüzde canlılığı sayısını belirler.
- 400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve bir 1:20 ile desteklenmiş tam IMDM içinde resuspend tavuk CD40L 1 x 107 hücre/mL yoğunluğu, seyreltme. 1:10 ile 1:50 aralığında yalan muhtemelen en iyi seyreltme belirlemek için chCD40L içeren konsantre süpernatant titre.
- 48-72 h. U popolu 96-şey plakaları düz oturaklı tabakaları bana tercih edilir için ya 96 - veya 24-da tabak 37 ° C'de hücreler kültür.
Not: Hücreleri de 40 ° C'de kültürlü
6. IBDV tavuk birincil Bursal hücrelerle enfeksiyonun
- 48-72 h sonrası yalıtım, bir aliquot girdap örneği, virüsün çözülme ve buza saklayın.
- Birincil bursal hücreleri resuspend, 10 µL hücre süspansiyon aliquot al, bir Trypan mavi çözüm 10 µL için eklemek ve hücreleri ve yüzde canlılığı sayısını belirler.
- Virüs enfeksiyonu (virüs inoculum ve girdap yapmak için MOI) uygun çokluğu için tam IMDM x 1 oranında seyreltin.
- 400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve virüs inoculum hücrelerde resuspend.
- Hücre süspansiyon için periyodik ajitasyon ile 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- 400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi, virüs inoculum kaldırmak ve 1 x komple IMDM medya hücrelerde yıkayın.
- 400 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve tam IMDM medya ile tavuk CD40L mL başına 1 x 107 hücre yoğunluğu, takıma hücrelerde resuspend.
- Ya 96 - veya 24-da tabak 37 ° C'de hücreler kültür
Not: Hücreleri de 40 ° C'de kültürlü
7. IBDV çoğaltma tavuk birincil Bursal hücrelerdeki miktar
- İstediğiniz zaman noktası postinfection, hücreleri resuspend, onlara uygun bir tüp aktarmak, onları vasıl 400 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve plak tahlil veya TCID50 tahlil Reed Muench göre süpernatant virüs titrasyon için hasat yöntemi15.
- PBS 1 mL hücrelerde yıkama ve immunostaining ile IBDV için belirli bir antikor için onları hazırlamak veya RNA (üreticinin yönergeleri izleyerek) uygun bir seti kullanarak ayıklamak ve Ters transkripsiyon nicel polimeraz zincir gerçekleştirmek reaksiyon (RT-qPCR) kullanarak astar belirli bir IBDV gen (ileri, GAGGTGGCCGACCTCAACT; Tersine, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG). Sahte enfekte hücre kültürlerinde bir denetim olarak kullanılmalıdır.
Representative Results
Tavuk birincil Bursal hücreleri tavuk CD40L huzurunda kültürlü
Ne zaman tavuk birincil bursal hücreleri huzurunda çözünür chCD40L kültürlü, hücre sayısı arttı kat 9.02 x 105 3.63 x 10 mL 6 gün ne zaman yoktu aksine, bir süre içinde6 (p < 0,05) ( Şekil 1A). Hücre canlılığı de önemli ölçüde geliştirilmiş, örneğin %25, 3. gün sonrası kültürüne chCD40L %48 chCD40L varlığında yokluğunda (p < 0,05) (Şekil 1B)13.
Tavuk birincil Bursal hücreleri çoğaltma adapte her iki hücre kültür ve IBDV çok şiddetli suşları destekleyebilir
Sahte enfekte ve enfekte hücre kültürleri 18 h sabit postinfection, IBDV VP2 ve ikincil bir antikor Alexa Fluor 488 için Birleşik ve DAPI ile counterstained karşı monoklonal antikor ile etiketlenmiş. Enfekte hücreleri yeşil floresan çevresinde çekirdeği (Şekil 2A), IBDV varlığı sitoplazmada ile tutarlı kanıt vardı. Bu IBDV iki soyu için açıktı, hücre kültürü zorlanma, D78 ve çok şiddetli bir zorlanma, UK661 adapte (Şekil 2A). 5, 18, 24 ve 48 h postinfection RNA virüslü kültürler çıkarılan ve RT-qPCR için astar IBDV VP4 gen korunmuş bir bölge için belirli ile tabi. VP4 ifade ilk ev tutma gen TBP normalleştirilmiş ve sahte bir ΔΔCt analiz örneklerinde göreli kat değişiklik olarak dile getirdi. 48 h postinfection D78 ile 16,603 kopya ve 48 h postinfection UK661 ile 38,632 kopya IBDV VP4 ifade arttı. Birlikte ele alındığında, bu veriler tavuk birincil bursal hücreleri hücre kültür uyarlanmış ve çok şiddetli IBDV suşları13çoğaltma destek olabilir göstermektedir.
Şekil 1: tavuk birincil bursal hücreler kültürlü tavuk CD40L huzurunda. Tavuk birincil bursal hücreleri kültürlü chCD40L içinde (siyah ve beyaz çubuklarından, sırasıyla). (A) canlı hücreleri ve (B) hücrelerin yüzdesi belirtilen zaman-puan postinfection tespit. Gösterilen veriler en az üç Çoğalt deneyler temsilcisi vardır, ortalama standart sapması hata çubukları temsil ve istatistiksel anlamlılık bir öğrenci tkullanımı belirlendi-test, her zaman-bir noktada, * p < 0,05. bu rakam Dulwich vd izniyle değiştirildi 13.
Şekil 2: tavuk birincil bursal hücreleri-ebilmek çekmek hem hücre-kültür adapte çoğaltılması ve çok öldürücü soy-in IBDV. (A)tavuk birincil bursal hücreleri sahte enfekte veya D78 ya da UK661 ile enfekte ve her kültürden bir örnek sabit, etiketli ve yansıma: IBDV VP2, yeşil; çekirdekleri, mavi. Ölçek çubuğu = 7 µm. (B) RNA belirtilen zaman-puan postinfection, ters-transkripsiyonu, çıkarılan ve korunmuş bölge IBDV VP4 gen kantitatif PCR ile güçlendirilmiş. Günlük10 kat kopya numarası TBP temizlik gen için normalleştirilmiş ve sahte enfekte örnekleri 2-ΔΔCT yöntemi göre göreli olarak ifade edilen VP4 değiştirin. Gösterilen veriler en az üç Çoğalt deneyler temsilcisi, ve hata çubukları ortalama standart sapması temsil. Bu rakam Dulwich vd izniyle değiştirildi 13.
Discussion
Bu çalışmada biz tavuk birincil bursal hücreleri ex vivo çözünür chCD40L huzurunda başarılı kültürünü tanımlamak ve bu hücreler bir zayıflatılmış strain ve IBDV çok şiddetli bir tür çoğaltma destekleyebilir gösterilmektedir. Bu ex vivo model nasıl in vivo ve in vitro çalışmalar üzerinde farklı avantajları olan bir IBDV enfeksiyon13olarak hücreleri yanıt belirlemek için kullanılabilir.
BF hasat izole bursal hücre bakteriyel kontaminasyon böylece gut delmek değil önemlidir. Buna ek olarak, primer hücre hücre ölümü sınırlamak için en kısa zamanda organ hasat sonrası yalıtmak önemlidir. ChCD40L kullanmaya gerek teknik bir kısıtlamasıdır; Ancak, Soubies vd. tarafından yürütülen çalışma modeli daha fazla sayıda laboratuvarlar tarafından kabul edilmesi için phorbol 12-myristate 13-asetat (bursal hücre canlılığı chCD40L14 yerine uzatmak için PMA) kullanımını etkinleştirmek gösterir. Yukarıda belirtilen iletişim kuralı chCD40L en iyi konsantrasyon ampirik olarak, birincil B hücreleri molekül ve gözlem hücre çoğalması ve canlılığı seri olarak seyreltilmiş konsantrasyonlarda kültür tarafından belirler. İletişim kuralı için bir potansiyel değişiklik chCD40L molekül arındırmak için ve belirli bir konsantrasyon toplu iş toplu iş değişkenlik önlemek için hücre kültür ortamına Ekle için olabilir.
İn vivo çalışmalar o aşağıdaki IBDV enfeksiyon, pro-inflamatuar sitokin yanıtları, tip ı IFN yanıt ve apoptosis BF5,9,10 katılan genlerin ifadesinde bir artış olduğunu göstermiştir . Ancak, enfeksiyon, inflamatuar hücreler ve BF, virüslü B hücre nüfus9' a göre onlar hızlı genlerin farklı efektör T hücrelere bir akını var. Bu, bu nedenle, IBDV ye nasıl enfekte hücreleri cevap yorumlamak zordur. Bu sorunu çözmek için bazı araştırma grupları kültür16,17,18,19,20IBDV ile enfekte hücreleri transkripsiyon yanıt nitelendirmiştir. Bu vitro çalışmalar, iyi tanımlanmış MOIs ve zaman-puan postinfection avantajına sahip. Ancak, vitro çalışmalar genellikle fibroblast hücreleri16,17,20 ya da dendritik hücreler18nitelendirmiştir. Konak hücre-IBDV etkileşimleri içine bazı bilgiler, geçerli inanç B hücreleri enfeksiyon IBDV patogenezi ve alaka veri için bu nedenle, çok önemli olduğunu sağlanması overinterpreted iken. Önce bizim ex vivo bursal hücre kültür modeli, tek bir çalışma IBDV enfeksiyon19B hücre hücresel yanıt karakterize; Ancak, bu çalışmada ALV, yapılmış olabilir sonuçlar sınırlama ile enfeksiyon nedeniyle dönüştü bir ölümsüzleştirdi B hücre kültürünü kullanılmaktadır. Buna ek olarak, ex vivo modeli IBDV enfeksiyon burada açıklanan araştırmacılar vitro çalışmalar, tanımlanmış MOIs ve virüs etkileşimleri ile ilgili ana bilgisayar hücresini eğitim sırasında zaman-puan, gibi avantajları korumak için olanak sağlar. Birincil bursal hücreler kandan BF dokusundan elde edilen, hayır enflamatuar veya T hücreleri mevcut ve biz tarafından göstermiştir gibi akış sitometresi (Standart koşullar kullanarak), aşağıdaki chCD40L stimülasyon, hücre nüfus % 97'si için olumlu B hücre işaretçisi bü-1 (veri gösterilmez). Hücrelerin % 3 bü-1 olduğunu göz önüne alındığında eksi, bu hücreler IBDV ile enfekte olma ve kendi gen ekspresyonu ve katkı için Patogenez keşfetmek belirlemek ilginç olacak.
Biz ex vivo tavuk birincil bursal hücre kültür modeli da konak hücre-virüs etkileşimleri tavuk, ALV veya REV, gibi hastalık diğer B-hücre tropic virüslerin çalışmaya genişletti ve aynı zamanda genişletilmiş diğer kuş türleri (tahmin Örneğin, ördek veya hindi). Birincil bursal hücreleri ex vivo de kültür yeteneği patogenez ve immünosupresyon kuşlar bulaştırmak için gerek kalmadan bu virüslerin neden olduğu yönleri çalışma imkanı sağlar. Vivo çalışmalar önemli morbidite neden, bu araştırmada değişim, arıtma ve hayvanların kullanımı azaltma üzerinde önemli bir etkisi olacaktır.
Özetle, burada açıklanan ex vivo tavuk birincil bursal hücre kültür modeli nasıl kuş B-hücre içinde vivo içinde kullanılan kuşlar sayısını azaltırken tropic virüs onların konak hücreleri ile etkileşim anlayışı genişletmek için potansiyele sahiptir. enfeksiyon çalışmalar. Teknikleri için birden fazla lenfoid organlar, uygulanan birden çok virüs ve büyük olasılıkla, kuş, kuş Viroloji ve İmmünoloji alanları için katkıda bulunabilir çekici bir model yapmak birden çok tür.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar kuluçkalık, yetiştirme ve kuşlar ve Caroline Holt uzmanlık aseptik bursa of Fabricius giderilmesinde itlaf uzmanlıklarını Pirbright Enstitüsü'nde hayvan hizmetleri ekibi teşekkür etmek istiyorum. A.B. Biyoteknoloji finanse edilen ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) üzerinden vermek BBS/E/ı/00001845, cdlerini BBSRC yolu ile öğrencilik BBS/E/ı/00002115 finanse edilen ve A.A. için Ulusal Merkezi üzerinden finanse Değiştirme, arıtma ve azaltma hayvanlar araştırma (NC3Rs) yolu ile içinde NC/R001138/1 verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
| FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56 °C for 1 h |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
| 0.22 µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl22 - MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
| Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
| Insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
| 100 µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
| Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
| Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Hoerr, F. J.
- Schermuly, J., et al. In vitro model for lytic replication, latency, and transformation of an oncogenic alphaherpesvirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7279-7284 (2015).
- Farhanah, M. I., et al. Bursal immunopathology responses of specific-pathogen-free chickens and red jungle fowl infected with very virulent infectious bursal disease virus. Archives of Virology. , (2018).
- Farhanah, M. I., et al. Bursal transcriptome profiling of different inbred chicken lines reveals key differentially expressed genes at 3 days post-infection with very virulent infectious bursal disease virus. Journal of General Virology. 99 (1), 21-35 (2018).
- Guo, X., et al. Differential expression of the Toll-like receptor pathway and related genes of chicken bursa after experimental infection with infectious bursa disease virus. Archives of Virology. 157 (11), 2189-2199 (2012).
- He, X., et al. Differential Regulation of chTLR3 by Infectious Bursal Disease Viruses with Different Virulence. In Vitro and In Vivo. Viral Immunology. 30 (7), 490-499 (2017).
- Ou, C., et al. Transcription profiles of the responses of chicken bursae of Fabricius to IBDV in different timing phases. Virology Journal. 14 (1), 93 (2017).
- Rasoli, M., et al. Differential modulation of immune response and cytokine profiles in the bursae and spleen of chickens infected with very virulent infectious bursal disease virus. BMC Veterinary Research. 11, 75 (2015).
- Ruby, T., et al. Transcriptional profiling reveals a possible role for the timing of the inflammatory response in determining susceptibility to a viral infection. Journal of Virology. 80 (18), 9207-9216 (2006).
- Smith, J., et al. Analysis of the early immune response to infection by infectious bursal disease virus in chickens differing in their resistance to the disease. Journal of Virology. 89 (5), 2469-2482 (2015).
- Tregaskes, C. A., et al. Conservation of biological properties of the CD40 ligand, CD154 in a non-mammalian vertebrate. Developmental & Comparative Immunology. 29 (4), 361-374 (2005).
- Kothlow, S., et al. CD40 ligand supports the long-term maintenance and differentiation of chicken B cells in culture. Developmental & Comparative Immunology. 32 (9), 1015-1026 (2008).
- Dulwich, K. L., et al. Differential gene expression in chicken primary B cells infected ex vivo with attenuated and very virulent strains of infectious bursal disease virus (IBDV). Journal of General Virology. 98 (12), 2918-2930 (2017).
- Soubies, S. M., et al. Propagation and titration of infectious bursal disease virus, including non-cell-culture-adapted strains, using ex vivo-stimulated chicken bursal cells. Avian Pathology. 47 (2), 179-188 (2018).
- Reed, L., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 494-497 (1938).
- Hui, R. K., Leung, F. C. Differential Expression Profile of Chicken Embryo Fibroblast DF-1 Cells Infected with Cell-Adapted Infectious Bursal Disease Virus. PLoS One. 10 (6), e0111771 (2015).
- Li, Y. P., et al. Transcriptional profiles of chicken embryo cell cultures following infection with infectious bursal disease virus. Archives of Virology. 152 (3), 463-478 (2007).
- Lin, J., et al. Genome-wide profiling of chicken dendritic cell response to infectious bursal disease. BMC Genomics. 17 (1), 878 (2016).
- Quan, R., et al. Transcriptional profiles in bursal B-lymphoid DT40 cells infected with very virulent infectious bursal disease virus. Virology Journal. 14 (1), 7 (2017).
- Wong, R. T., et al. Screening of differentially expressed transcripts in infectious bursal disease virus-induced apoptotic chicken embryonic fibroblasts by using cDNA microarrays. Journal of General Virology. 88 (Pt 6), 1785-1796 (2007).
