Summary
여기는 닭고기 기본 bursal 셀 부르사의 파, 문화와 bursal 전염병 바이러스와 세포의 감염 및 바이러스 성 복제의 정량화에서의 격리에 설명합니다.
Abstract
Bursal 전염병 바이러스 (IBDV)가 금 산업에 경제 중요성의 birnavirus 이다. 바이러스 감염 된 조류에서 질병 률, 사망률, 그리고 면역 억제를 일으키는 원인이 되는 B 세포를 감염. 이 연구에서 우리는 부르사의 파, 문화 그리고 IBDV, 포함 된 셀의 감염 및 바이러스 성 복제의 정량화에서 치킨 기본 bursal 셀의 설명합니다. 치킨 CD40 ligand의 추가 크게 세포 증식 대금 6 일 문화와 크게 향상 된 세포 생존 능력의 증가. IBDV의 2 개의 긴장, 셀 문화 적응, D78, 긴장과 매우 악성 긴장, UK661, ex vivo 세포 배양에서 잘 복제. 이 모델 셀 IBDV 감염에 대응 하 고 IBDV 병 인 연구에 사용 하는 감염 된 조류의 수에 있는 감소를 허용 하는 어떻게 결정 하는 데 사용 될 것입니다. 모델도 다른 바이러스를 포함 하도록 확장 될 수 있다 고 새의 다른 종에 적용 될 수 있었다.
Introduction
글로벌 가금류 업계는 확장 인간 인구에 대 한 충분 한 음식을 확보 필수적 이다. 그러나, 면역 억제 식량 안보 위협 및 영향을 받는 새 복지 이며 업계 주요 경제 도전을 나타냅니다. 대부분의 경우 닭 면역 억제의 가장 혼란 후천성 면역 T와 B 림프 톨1차 있는 굴곡 운동 하는 데 대 한 책임으로 면역 바이러스 감염에 의해 발생 합니다. 조류, B 세포의 대부분은 부르사의 파 (BF)로 알려진 기관 내에 있습니다. B 세포는 IBDV와 마렉의 질병 바이러스 (MDV), 세포의 용 해를 일으키는 원인이 되 고 조류 leukosis 바이러스 (ALV)와 reticuloendotheliosis 바이러스 (와 같은 변환 시키는 그를 포함 하 여 여러 가지 면역 바이러스 감염에 취약 회전)
이러한 감염을 제어 하기 위한 더 나은 전략을 개발 하기 위하여 닭 B 세포와 바이러스의 상호 작용의 특성을 필수적 이다. 그러나, B 세포는 조류에서 제거 되, 그들은 하지 비보 전 문화2, 치킨 B 세포, 또는 다음 ALV 또는 계 감염 초기 이벤트와 IBDV의 상호 작용의 철저 한 분석을 수행 하기 어려운 만들기에서 잘 살아남을지 않습니다. 따라서, 많은 호스트 세포 바이러스 상호 작용 공부 vivo에서3,,45,6,7,8,9, 되었습니다. 10. 이러한 연구를 유익 하지 않더라도, 그들은 심각한 될 수 있는 질병 으로부터 고통 받는 감염 된 조류의 사용을 포함 한다.
CD40 ligand 유도 B 세포 확산11분자 이다. (ChCD40L) 유전자 인코딩 치킨 CD40L의 식별, 다음 성 융해 단백질 설계 되었습니다, 문화 미디어에 추가 될 때 닭 기본 B 세포 vivo ex12의 확산을 유도. 2015, B 셀이이 패션에 교양 2017에 MDV2 의 복제, 우리와 다른 사람을 지원 하기 위해 chCD40L을 자극된 기본 bursal 셀 IBDV 복제13,14공부 모델으로 사용 될 수 하는 것을 발견 발견 했다. 여기, 우리가 격리와 치킨 기본 bursal 셀의 문화, IBDV, 포함 된 셀의 감염과 바이러스 성 복제의 정량화 설명합니다. BF의 컨텍스트에서 메서드를 설명 하 고, 비록이 다른 림프 기관에서 격리와 문화 셀에 적용 될 수 있습니다.
Protocol
동물 들과 함께 모든 절차 승인 되어야 합니다 윤리적으로 사전에. 우리의 기관에 모든 절차는 내부 동물 복지 및 윤리 검토 위원회 (AWERB)의 승인 후 홈 오피스 설립, 개인 및 프로젝트 라이선스에서 영국 동물 (과학적인 절차) 행위 1986에 따라 수행 됩니다.
1입니다. chCD40L의 준비
- 안정적으로 수용 성 chCD40L을 표현 하는 문화 HEK 293-msCD8-CD40L 셀 송아지 태아 혈 청 (FCS) 및 5%를 포함 하는 분위기에서 37 ° C에서 1 µ g/mL puromycin 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체 10% 열 비활성화 보완 (안녕하세요) x 1에 생성 CO 2.
참고: 이러한 셀 다음 적절 한 자료 전송 계약에 서명 하는 Pirbright 연구소에서 사용할 수 있습니다. - 1:5 밀도 confluent 때 셀을 분할 합니다. 수집 (수용 성 chCD40L 구문이 포함) 상쾌한 때마다 셀 분할 세포질 파편을 제거 하 고 4 ° c.에 그것을 저장 하는 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심
- 상쾌한의 500 mL를 수집 하는 때 액체 수영장 하 고 필터-소독 그것 0.2 µ m 필터를 통해.
- 제조업체의 지침에 따라 10 K의 분자 무게 컷오프와 원심 단백질 집중 장치를 사용 하 여 상쾌한 집중. 각 열에서 집중된 상쾌한을 추출 하 고, 함께 수영장 필터-소독 그것 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 그것을 전달 하 여.
- 직렬 1에서 chCD40L 솔루션을 희석 하 여 실험에 사용 될 최종 농도 결정 x Iscove의 Dulbecco의 매체 (IMDM) (에서 설명한 단계 2.4)와 희석 존재 자란 기본 bursal 셀 수정. 최대 1 주일 동안 매일 세포의 수와 백분율 생존 능력을 결정 합니다.
참고: 세포 증식과 생존 능력은 적절 한 최저 농도 분석 결과에 사용 하 여 농도가 이다. 이 1시 20분, 1시 50분 사이 있을 것입니다.
2. 치킨 기본 Bursal 셀 격리 솔루션의 준비
- 살 균 H2O의 0.47 90 mL에 Ca와 10 x HBBS의 10 mL를 추가 하 여 칼슘 (Ca) 행 크 스 균형된 소금 솔루션 (HBBS) x 1을 준비 7.5% NaHCO3의 µ L.
- 0.2 µ M 필터를 통해 Ca. 필터를 소독을 1 x HBBS에서 8 mg/mL에서 콜라 D 재고 솔루션 솔루션을 준비 합니다.
참고: 그것은 5 mL aliquots를 준비 하 고-20 ° c.에서 그들을 멈추게 하는 것이 좋습니다. - 1 준비 x RPMI 매체 보충 5% 안녕하세요 FCS. 4 ° c.에 미디어를 저장
- 준비 1 x 500 mL IMDM의 보충 8% 안녕하세요 FCS, 2% 안녕하세요 닭 혈 청, β-mercaptoethanol 50 m m, 50 µ L 인슐린-처리가-나트륨-selenite, 및 1% 페니실린/스. 4 ° c.에 미디어를 저장
참고: 위에서 언급 한 모든 솔루션을 사전에 준비 합니다. - 1 x HBBS Ca. 저장소와 얼음에 솔루션을 준비 합니다.
- 살 균 H2O, 7.5% NaHCO3, 0.47 µ L EDTA 10 m m의 최종 농도에 90 mL에 Ca 없이 10 x HBBS의 10 mL를 추가 하 여 Ca 없이 1 x HBBS를 준비 합니다. 얼음에 솔루션을 저장 합니다.
- 18 mL의 총 수 있도록 Ca와 HBBS의 13 ml 콜라 D 재고 솔루션의 5 mL을 추가 하 여 1 x 콜라 D 솔루션을 준비 합니다. 얼음에 솔루션을 저장 합니다.
참고: 실험의 하루에 2.5-2.7 단계에서 언급 한 솔루션을 준비 합니다.
3. 부르사의 파 (BF)의 제거
- 후면 및 해치 닭 적절 한, 승인 된 시설에 고통 없이 나이의 2-3 주에 따.
참고: 학살에 대 한 연구소 승인 메서드를 사용 합니다. -
무 균 기술을 사용 하 여 각 치킨에서 BF를 수집 합니다.
참고: 프로토콜을 사용 하 여 기관에 장소에.- 등 recumbency에 시체를 놓고 소독 피부 및 깃털 70% 에탄올, 물에 희석의 솔루션으로는 복 부와 흉부를 오버레이 합니다.
- 멸 균된 메스 또는 위를 사용 하 여 더 낮은 복 부에 복 부 정중 선 절 개를 확인 합니다.
- 두개골은 cloaca 콜론의 꼬리 부분에 연결 된 부르사의 파를 찾습니다.
- 소독된 집게와가 위, 콜론에서 부르사의 파를 잘라 사용 합니다. 용기를 puncturing 하지 않도록 주의 하십시오.
- 차가운 PBS에 장기를 놓고 얼음에 실험실으로 전송 합니다.
참고: 기본 셀 장기 수확 후 즉시 격리 해야 합니다.
4입니다. 닭 기본 Bursal 셀의 격리
- BF 적어도 3 세척 미생물 안전 캐비닛에서 일하고 차가운 PBS의 30 mL에 x.
- 조직 배양 접시 (지름, 높이 21 m m 92 mm)을 전송 하 고 1 x 콜라 D 솔루션의 5 mL를 추가 합니다.
- 살 균가 위 또는 BF 직경에서 5 m m 미만의 조각으로 잘라 메스 블레이드를 사용 합니다.
- 30 분에 대 한 정기적인 부드러운 동요와 37 ° C에서 조직 품 어.
참고: 콜라 솔루션 조직 소화 시작 됩니다. - 조직의 해체를 장려 하기 위해 혼합물을 발음 반복 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여. 필요한 경우 조직을 작은 조각으로 잘라.
- 조직에 1 x 콜라 D 솔루션의 또 다른 5 mL을 추가 하 고 또 다른 30 분에 대 한 정기적인 부드러운 동요와 37 ° C에서 품 어.
- 조직을 완전히 소화 될 때까지 4.6-4.7 단계를 반복 합니다.
참고: 있을 것입니다 더 이상 분해 되지 않는 작은 알갱이. - 세포 현 탁 액을 Ca 없이 1 x HBBS의 20 mL로 100 µ m 셀 여과기에 통과.
- 셀 서 스 펜 션 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심
- 삭제는 상쾌한 고 1의 10 mL에 펠 릿을 resuspend x RPMI 5 %fcs.
- Polysucrose와 나트륨 diatrizoate를 포함 하는 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL 위에 세포 현 탁 액 10 mL를 오버레이 또는 10 mL 세포 현 탁 액 아래 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL 언더레이. 거기 2 사이 명확한 인터페이스 인지 확인 합니다.
- 900 x g 4 ° c.에 20 분에 오버레이 원심 낮은 또는 원심 브레이크를 제거 합니다.
참고: 셀 셀 미디어와 밀도 그라데이션 미디어 간의 인터페이스에 밴드를 형성 한다. - 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 셀을 제거 하 고 차가운 PBS에 넣어. 3 세포를 씻어 x 400 x g 5 분에 centrifuging와 차가운 PBS에 그들을 resuspending.
5입니다. 닭 기본 Bursal 세포의 문화
- 400 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 하 고 완전 한 IMDM x 1에서 그들을 resuspend.
- 세포 현 탁 액의 약 수를 받아, Trypan 블루 솔루션에 추가 하 고 Trypan 블루 제외 가능한 셀의 수를 계산. 백분율 생존 세포의 수를 결정 합니다.
- 400 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심과 1시 20분으로 보완 하는 완전 한 IMDM에 resuspend 1 x 107 셀/mL의 조밀도에 치킨 CD40L의 희석. 결정은 범위 1시 10분 ~ 1시 50분에 최적의 희석 chCD40L를 포함 하는 집중된 상쾌한 적정
- 48-72 h. U 바닥 96 잘 접시 바닥 접시 보다는 37 ° C에 96-24 잘 접시 중에 셀 문화.
참고: 셀 40 ° C에서 경작 될 수 있다 또한
6. 닭 기본 Bursal 셀 IBDV의 감염
- 48-72 h 후 절연, 바이러스, 소용돌이 샘플의 약 수를 녹여 하 고 얼음에 저장 합니다.
- Resuspend 기본 bursal 셀 10 µ L 셀 서 스 펜 션의 aliquot 걸릴, Trypan 블루 솔루션의 10 µ L을 추가 하 고 셀 및 백분율 가능성의 수를 결정.
- 바이러스 감염 (MOI) 수 있도록 바이러스 inoculum 소용돌이의 적절 한 다중성을 완전 한 IMDM x 1에 희석.
- 셀 서 스 펜 션 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심
- 상쾌한을 제거 하 고 바이러스 inoculum 셀 resuspend.
- 정기적인 동요와 1 시간 동안 37 ° C에 세포 현 탁 액을 품 어.
- 400 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심, 바이러스 inoculum을 제거 하 고 완전 한 IMDM 미디어 x 1에 있는 셀을 씻어.
- 400 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심, 상쾌한, 제거 하 고 닭고기 CD40L mL 당 1 x 107 세포의 밀도와 보완 하는 완전 한 IMDM 미디어 셀 resuspend.
- 37 ° c.에 96-또는 24-잘 접시 중에 셀 문화
참고: 셀 40 ° C에서 경작 될 수 있다 또한
7. 닭 기본 Bursal 셀에 IBDV 복제의 정량화
- 원하는 시간 포인트 바람직합니다에 셀 resuspend, 적절 한 튜브에 그들을 전송, 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 고 수확 바이러스 적정에 대 한 상쾌한 패 분석 결과 또는 리드 Muench 당 TCID50 분석 결과 방법15.
- PBS의 1 mL에 세포를 씻어와 IBDV, 특정 항 체와 immunostaining에 대 한 준비 또는 RNA (제조업체의 지침에 따라) 적절 한 키트를 사용 하 여 추출 및 수행 반전 녹음 방송 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량) 사용 하 여 뇌관 (앞으로, GAGGTGGCCGACCTCAACT; IBDV 유전자에 대 한 특정 리버스, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG)입니다. 모의 감염 된 세포 배양 컨트롤으로 사용 되어야 한다.
Representative Results
치킨 기본 Bursal 셀 치킨 CD40L 존재 경작 수 있습니다.
치킨 기본 bursal 셀 수용 성 chCD40L 존재 경작 했다, 세포 수 증가 사중 9.02 x 10에서5 3.63 x 106 그것이 결 석과 달리 6 일의 기간 동안 mL 당 (p < 0.05) ( 그림 1A). 세포 생존 능력 또한 크게 개선 되었습니다, 예를 들어 chCD40L chCD40L의 48%의 부재에 3 일 후 문화에 25%에서 (p < 0.05) (그림 1B)13.
치킨 기본 Bursal 셀 두 셀 문화 적응의 복제 및 IBDV의 매우 악성 긴장을 지원할 수 있습니다.
모의 감염 및 감염 된 세포 배양 18 h 고정 했다 postinfection, IBDV VP2와 알 렉 사 Fluor 488, 활용 및 DAPI와 counterstained 이차 항 체에 대 한 단일 클론 항 체로 분류. 감염 된 세포의 핵 (그림 2A), 세포질에서 IBDV의 존재와 주위 녹색 형광 증거를 했다. 이것은 IBDV의 두 변종에 대 한 분명, 셀 문화 적응, D78, 긴장과 매우 악성 긴장, UK661 (그림 2A). 5, 18, 24, 및 48 h 바람직합니다, RNA 감염 된 문화에서 추출 하 고 IBDV VP4 유전자의 보존된 지역에 특정 한 뇌관으로 실시간 정량 Pcr을 복종 되었다. VP4 표현 먼저 집 유지 유전자 TBP 정규화 이었고 ΔΔCt 분석에서 모의 샘플을 기준으로 배 변경으로 표현. IBDV VP4 식 D78와 48 h 바람직합니다에 16,603 사본 및 38,632 사본을 UK661로 48 h 바람직합니다에 증가. 함께 찍은, 이러한 데이터는 닭 기본 bursal 셀 셀 문화 적응 및 매우 악성 IBDV 긴장13의 복제를 지원 수 보여 줍니다.
그림 1: 치킨 기본 bursal 셀 치킨 CD40L 존재 양식 수 있습니다. 치킨 기본 bursal 셀 chCD40L의 유무에 교양 있었다 (검은 바와 흰색 막대, 각각). (A) 수 라이브 셀와 (B) 실행 가능한 세포의 백분율 표시 시간-포인트 바람직합니다에 결정 되었다. 표시 되는 데이터는 3 개 이상 복제 실험의 대표, 오차 막대의 평균, 표준 편차 나타내고 통계적 의미 쌍된 학생의 t를 사용 하 여 결정 했다-각 시간 지점에서 테스트 * p < 0.05.이 그림 Dulwich 외 허가 수정 되었습니다. 13.
그림 2: 닭 기본 bursal 셀 모두 셀 문화 적응의 복제 및 IBDV의 매우 악성 긴장을 지원할 수 있습니다. (A) 닭 기본 bursal 셀 모의 감염 또는 D78 또는 UK661에 감염 되었고 각 문화에서 샘플 고정, 표시 이미지: IBDV VP2, 녹색; 핵, 파란색입니다. 눈금 막대 = 7 µ m. (B) RNA는 리버스 복사할 지정된 시간-포인트 바람직합니다에 추출 하 고 IBDV VP4 유전자의 보존된 지역의 양이 많은 PCR에 의해 증폭 되었다. 로그10 배 변화 VP4 복사 번호 TBP 하우스키핑 유전자를 정상화 하 고 2-ΔΔCT 방법에 따라 모의 감염 샘플을 기준으로 표현 했다. 표시 되는 데이터는 3 개 이상 복제 실험의 대표 하 고 오차 막대의 평균 표준 편차를 나타냅니다. 이 수치는 Dulwich 외 허가 수정 되었습니다. 13.
Discussion
이 연구에서 우리 닭 기본 bursal 셀 비보 전 수용 성 chCD40L 존재의 성공적인 문화를 설명 하 고 이러한 셀 감쇠 긴장과 IBDV의 매우 악성 긴장의 복제를 지원할 수 있습니다 입증. 이 비보 전 모델 세포는 IBDV 감염13, vivo에서 그리고 생체 외에서 연구에 비해 뚜렷한 장점이 있는에 대처 하는 방법을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.
BF, 수확 때 하지 펑크 격리 bursal 셀의 세균 오염을 피하기 위하여 용기에 중요 하다. 또한, 그것은 세포 죽음을 제한 하려면 장기 수확 후 최대한 빨리 1 차 셀을 분리 하는 것이 중요입니다. ChCD40L를 사용 하는 필요는 제한 기술; 그러나, Soubies 그 외 여러분 에 의해 실시 하는 작업 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) chCD40L14 대신 bursal 세포 생존을 머리말을 붙이는 사용 실험실의 큰 숫자로 채택 모델을 활성화 수 있습니다 보여줍니다. 위에서 설명한 프로토콜 순차적으로 희석된 농도 분자 관찰 세포 증식과 생존에 기본 B 세포를 배양 하 여 경험적으로, chCD40L의 최적 농도를 결정 합니다. 한 잠재적인 수정 프로토콜에 chCD40L 분자를 정화 하 고 배치 배치 변화를 피하기 위해 세포 배양에 특정 농도 추가 될 수 있습니다.
Vivo에서 연구 결과 나타났습니다 그 다음 IBDV 감염, 프로-염증 성 cytokine 응답, 유형 I IFN 응답 및 BF5,9,10 apoptosis에서 포함 된 유전자의 표정 증가 . 그러나, 감염, 다음과 같은 염증 성 세포와 감염 된 B 세포 인구9에 비해 유전자 표현에 다는 BF로 이펙터 T 세포의 유입이입니다. 그것은, 따라서, IBDV에 어떻게 감염된 세포 응답 해석 어렵다입니다. 이 해결 하기 위해 일부 연구 그룹 셀 문화16,17,,1819,20IBDV 감염의 transcriptional 응답을 특징 있다. 이러한 생체 외에서 연구 분명 MOIs 및 시간 포인트 바람직합니다의 이점이 있다. 그러나, 생체 외에서 연구는 일반적으로 섬유 아 세포 세포16,,1720 또는 수지상 세포18특징 되었습니다. 동안 호스트 셀-IBDV 상호 작용에 몇 가지 통찰력, 현재 믿음 이다 B 세포의 감염 IBDV의 병 인 및, 따라서, 데이터의 관련성에 중요 한 제공 overinterpreted 수 없습니다. 우리의 비보 전 bursal 셀 문화 모델, 이전 한 연구 IBDV 감염19; B 세포의 세포질 응답 특징 했다 그러나,이 연구에 활용 B 세포를 불멸 하 게 라인을 만들 수 있는 결론을 제한 하는 ALV와 감염에의 한 변형 되었다. 대조적으로, 여기서 설명 하는 IBDV 감염의 비보 전 모델에는 연구원을 생체 외에서 학문, 정의 MOIs의 관련 호스트 세포와 바이러스의 상호 작용을 공부 하는 동안 시간 포인트 등의 장점을 유지 하 수 있습니다. Flow cytometry (표준 상태를 사용 하 여), 다음 chCD40L 자극, 세포 인구의 97%에 대 한 긍정적인 기본 bursal 세포 감염된 BF 조직에서 얻을 수 있습니다, 그리고 거기 아무 염증 성 또는 T 세포, 그리고 우리는 의해 증명 B 셀 표식 부-1 (데이터 표시 되지 않음)입니다. 감안할 때 그 세포의 3%는 부 1 부정적, 그것은 재미 있을 것입니다 이러한 셀 IBDV에 감염 되는 병 인에 그들의 유전자 발현 및 기여를 탐험 있는지 확인.
우리 기대 하 고 ex vivo 닭 기본 bursal 셀 문화 모델도 다른 B 세포 트로픽 바이러스 감염 ALV 등 계, 닭의 호스트 세포 바이러스 상호 작용 연구를 확장 될 수 있습니다. 및 다른 조류 종 (또한 확장 될 수 있습니다. 예를 들어, 오리 또는 칠면조). 또한 기본 bursal 셀 비보 전 문화 능력 pathogenesis 및 조류를 감염 하는 필요 없이이 바이러스로 인 한 면역 억제의 측면을 공부 하는 가능성을 엽니다. Vivo에서 학문 중요 한 병 적 원인,이 연구에서 교체, 수정, 및 동물의 사용의 감소에 상당한 영향을 가질 것 이다.
요약 하자면, 비보 전 닭 기본 bursal 셀 문화 모델 여기에 설명 된 어떻게 조류 B 셀에 트로픽 바이러스에 vivo 에서 사용 하는 새의 수를 감소 시키고 있는 동안 자신의 호스트 세포 상호 작용의 이해를 확장 가능성이 있다 감염 연구입니다. 기술을 여러 림프 기관에 적용할 수 있는 여러 바이러스, 그리고 잠재적으로, 여러 종의 조류, 조류 바이러스학 및 면역학 분야에 기여할 수 있는 매력적인 모델 만들기.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 그들의 전문성 해칭, 양육, 및 aseptically 제거 부르사의 파에 조류와 캐롤라인 홀 트의 전문성을 학살에 대 한 Pirbright 연구소에서 동물 서비스 팀을 감사 하 고 싶습니다. A.B. 생명 공학 통해 자금과 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC) 통해 부여 게시판/E/I/00001845, K.D. 재학 통해 BBSRC 게시판/E/I/00002115을 통해 자금과 A.A.에 대 한 국립 센터를 통해 투자는 대체, 수정 & 연구 (NC3Rs) 를 통해 서 동물의 감소 NC/R001138/1을 부여합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
| FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56 °C for 1 h |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
| 0.22 µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl22 - MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
| Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
| Insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
| 100 µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
| Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
| Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
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