Summary
ここのファブリキウス、文化、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスと細胞の感染症やウイルスの複製の数量から鶏一次ファブリキウス嚢細胞の隔離を記述します。
Abstract
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス (IBDV) は、養鶏産業に経済的な重要性のビルナです。ウイルス感染した鳥の罹患率、死亡率、および免疫抑制を引き起こす B 細胞に感染します。本研究では鶏ファブリキウス、文化と, IBDV の細胞の感染症やウイルスの複製の数量から一次ファブリキウス嚢細胞の分離をについて説明します。鶏 CD40 リガンドの添加には、文化と大幅に強化された細胞の細胞増殖 4 倍以上 6 日大幅増加しました。IBDV の 2 系統は、細胞培養適応ひずみ、D78、および非常に悪性のひずみ、UK661、体外培養細胞で複製されます。このモデルは、細胞が IBDV 感染に応答し、IBDV 病因学で用いられる感染した鳥の数の減少を許可する方法を決定する際に使用されます。モデルは、他のウイルスを含むように拡張も可能し、鳥の種に適用することができます。
Introduction
世界家禽産業は拡大の人口に十分な食糧を確保するために不可欠です。ただし、免疫抑制が食料安全保障に脅威で、影響を受ける鳥の福祉、業界に重要な経済課題を表します。鶏の免疫抑制療法の症例の多くは、獲得免疫の T および B リンパ球1の親和性を持っていることを損なうことに責任があると、免疫抑制のウイルス感染によって引き起こされます。B 細胞の大半は、鳥、ファブリキウス (BF) として知られている器官内にあります。B 細胞が溶解 IBDV とマレック病ウイルス (MDV) などを引き起こすものとトリ白血病ウイルス (ALV) や細網内皮症ウイルス (などの変換を引き起こすものなどを含む、いくつかの免疫抑制ウイルスに感染しやすい回転)。
これらの感染症を制御するための優れた戦略を開発するためにニワトリ B 細胞とウイルスの相互作用を特徴付けることが不可欠です。しかし、B 細胞が鳥から削除されると前のヴィヴォ文化2, IBDV がニワトリ B 細胞、または ALV または REV 感染初期のイベントと相互作用の徹底的な分析を行うが難しく、彼ら生きていけない。その結果、多くのホスト細胞ウイルスの相互作用は調査生体内で3,4,5,6,7,8,9をされています。 10。これらの研究が有益彼らは深刻なことができる病気に苦しむ感染した鳥の使用を含みます。
CD40 リガンド11B 細胞増殖を誘導する分子であります。水溶性融合蛋白質の設計遺伝子符号化鶏 CD40L の同定 (chCD40L)、続いて、文化メディアに追加、による鶏主 B 細胞前のヴィヴォ12の増殖。2015 年にこの方法で B 細胞が発見 MDV2 2017 年にレプリケーション、我々 と他の人をサポートする IBDV レプリケーション13,14を研究するモデルとして一次性ファブリキウス嚢細胞 chCD40L で刺激が使えます。ここでは、分離と鶏主のファブリキウス嚢細胞の培養, IBDV と細胞の感染症やウイルスの複製の数量化について述べる。BF のコンテキスト内のメソッドを説明するがこれが異なるリンパ器官から分離および培養細胞へ適用します。
Protocol
動物とすべての手順は、倫理的事前に承認する必要があります。当院ですべてのプロシージャはホーム オフィス設立、個人とプロジェクトのライセンスの下で英国の動物 (科学的なプロシージャ) 法 1986 に従って内部の動物の福祉と倫理レビュー ボード (AWERB) の承認後実行されます。
1. chCD40L の作製
- 水溶性 chCD40L を安定して表現文化 HEK 293-msCD8-CD40L 細胞構築のためロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 培 10% 熱不活化 (hi) x 1 の牛胎児血清 (FCS) 5% を含む大気中で 37 ° C で 1 μ G/ml ピューロマイシン CO2。
注: これらの細胞は、適切な材料移転契約の署名、次パーブライト研究所から入手可能。 - 1:5 の密度と合流でセルを分割します。収集 (水溶性 chCD40L 構成要素を含む) 上清たびにセルを分割、細胞の残骸を削除し、4 ° C で保存に 5 分間、400 × gで遠心分離
- 上澄みの 500 mL を収集すると、液体をプール、フィルター - それを殺菌 0.2 μ m フィルターを通過。
- 製造元の指示に従って 10 K の分子量カットオフと遠心タンパク質コンセントレーターを使用して上清を集中します。各列から集中して上澄みを抽出、それを一緒に、プールおよびフィルター - それを殺菌 0.22 μ m シリンジ フィルターを通してそれを渡すことによって。
- 直列 1 chCD40L 溶液を希釈することにより、実験に使用する最終的な濃度を決定する x Iscove のダルベッコ希釈の存在下で培養一次ファブリキウス嚢細胞培地 (IMDM) (2.4 で説明されているステップ) の変更します。毎日の週までのセルの数と割合の生存率を決定します。
注: 細胞増殖と生存率が十分な低濃度測定で使用する濃度であります。これは 1:20 ~ 1:50 である可能性が高いです。
2. 鶏主のファブリキウス嚢細胞分離用溶液の調製
- Ca で 10 x HBBS の 10 mL を滅菌 H2O 0.47 90 mL に追加することによってカルシウム (Ca) とハンクス平衡塩溶液 (HBBS) × 1 を準備 7.5% NaHCO3μ L。
- 0.2 μ M のフィルターを通してコラゲナーゼ D 原液 8 Mg/ml と ca フィルター滅菌と 1 x HBBS でソリューションを準備します。
注: それは 5 ml を準備し、-20 ° C でそれらを凍結することをお勧め - 1 を準備 x RPMI 培地を添加した 5% こんにちは FCS。4 ° C でメディアを保管します。
- 準備 IMDM の 1 x 500 mL を添加した 8% こんにちは FCS、2% こんにちは鶏血清、50 mM β-メルカプトエタノール、インシュリン ・ トランスフェリン--亜セレン酸ナトリウム、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを 50 μ l 添加します。4 ° C でメディアを保管します。
注: 上記のすべてのソリューションを事前に準備します。 - Ca ストアに 1 x HBBS 氷のソリューションを準備します。
- Ca なし 10 x HBBS 10 mL を滅菌 H2O、7.5% NaHCO3の 0.47 μ L と EDTA 最終濃度 10 mM で 90 mL に追加することによって Ca なし 1 x HBBS を準備します。氷の上には、ソリューションを格納します。
- 1 x コラゲナーゼ D ソリューションを準備するには、18 mL の合計を確認するために Ca と HBBS 13 mL にコラゲナーゼ D ストック溶液 5 mL を追加します。氷の上には、ソリューションを格納します。
注: は、実験の日に 2.5-2.7 の手順に記載されているソリューションを準備します。
3. ファブリキウス (BF) の除去
- 後部ハッチ鶏適切な承認された施設と人道的カリングそれらを 2-3 週齢で。
注: は、カリング研究所承認メソッドを使用します。 -
無菌技術を使用して各鶏から BF を収集します。
注: は、機関の場所でプロトコルを使用します。- 背臥床に死体を置き、皮膚、70% エタノール、水で希釈した溶液で腹部と胸部を覆う羽を滅菌します。
- 滅菌メスやはさみを使用して下腹部の腹側正中切開を行います。
- ファブリキウス、コロン、頭蓋腔に尾側部に接続されているを見つけます。
- 滅菌鉗子、はさみ、ファブリキウス コロンから無料のカットを使用します。腸を刺さないように注意してください。
- 冷 PBS でオルガンを置き、氷の上研究室にそれを転送します。
注: 初代培養細胞は、臓器収穫後できるだけ早く隔離されなければなりません。
4. 鶏一次ファブリキウス嚢細胞の分離
- BF の少なくとも 3 を洗って微生物学的安全キャビネットでの作業 30 mL の冷 PBS で x。
- シャーレ (直径 21 mm 高さ 92 mm) に組織を移し、1 x D コラゲナーゼ溶液 5 mL を加えなさい。
- 使用滅菌ハサミやメスの刃は、直径 5 mm 以下の BF を切る。
- 37 ° C で 30 分間周期の穏やかな攪拌で組織を孵化させなさい。
注: 組織を消化するコラゲナーゼの解決が開始されます。 - 組織の崩壊を促進する混合物を吸引繰り返し滅菌パスツール ピペットを使用する。必要な場合は、組織を小さな断片に切断します。
- 組織に 1 x コラゲナーゼ D ソリューションの別の 5 mL を追加し、別の 30 分の周期の穏やかな攪拌と 37 ° C でインキュベートします。
- 組織は完全に消化されるまでは、4.6 および 4.7 の手順を繰り返します。
注: さらに溶解しない小顆粒があります。 - 100 μ m の細胞のストレーナーを Ca なし 1 x HBBS 20 mL に細胞懸濁液を通過します。
- 400 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心します。
- 上澄みを廃棄し、1 の 10 mL にペレットを再懸濁します 5% の FCS と x RPMI。
- か 5 mL polysucrose、ナトリウム diatrizoate を含む密度勾配メディアの上に細胞懸濁液 10 mL をオーバーレイ、アンダーレイの 10 mL の細胞懸濁液の下に密度勾配メディアの 5 mL。2 つの明確なインターフェイスがあることを確認します。
- 遠心分離機の 4 ° C で 20 分間 900 x gでオーバーレイ下げるか、遠心分離機の区切りを削除します。
注: セルは、セル メディアと密度勾配メディア間のインターフェイスでバンドを結成する必要があります。 - 滅菌パスツール ピペットを使用すると、セルを削除し、冷 PBS で配置します。洗浄セル 3 x 400 x gで 5 分でそれらを遠心分離して冷 PBS でそれらを再します。
5. 鶏主ファブリキウス嚢細胞の培養
- 400 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心し、完全 IMDM × 1 でそれらを再懸濁します。
- 細胞懸濁液の因数を取り出してトリパン ブルー色素ソリューションに追加トリパン ブルー色素を除外する実行可能なセルの数をカウントします。細胞および実行可能性の割合の数を決定します。
- 400 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心し、1:20 と補われる完全な IMDM でそれを再懸濁します 1 x 10 の7セル/ml の密度で鶏 CD40L の希薄化。1:10 に 1:50 の範囲にある可能性が高い、最適な希釈を決定する chCD40L を含む集中して上清を滴定しなさい。
- 48-72 宏 U 底 96 ウェル プレート平底プレートすることが望ましいためいずれかの 96 ウェルまたは 24 板 37 ° C での細胞を培養します。
注: 40 ° C で細胞を培養もできます。
6. 鶏 IBDV と一次性ファブリキウス嚢細胞の感染症
- 48-72 時間後の分離、ウイルス、渦、サンプルの因数を解凍し、氷の上保存します。
- 一次性ファブリキウス嚢細胞を再懸濁します、細胞懸濁液の分注 10 μ L を取る、トリパン ブルー溶液 10 μ L を追加、細胞および実行可能性の割合の数を決定します。
- 1 感染症ウイルスと渦に (MOI) の適切な多重度を完全な IMDM x ウイルスを希釈します。
- 400 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心します。
- 上澄みを除去し、ウイルスの接種材料の細胞を再懸濁します。
- 定期的な撹拌で 1 h の 37 ° C の細胞懸濁液を孵化させなさい。
- 400 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心分離ウイルスの接種材料を削除し、完全な IMDM メディア x 1 のセルを洗浄します。
- 400 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心、上清を除去、完全な IMDM 培地 1 mL あたり 1 x 10 の7セルの密度で鶏 CD40L の細胞を再懸濁します。
- 37 ° C でいずれかの 96-24 ウェル プレートでの細胞を培養します。
注: 40 ° C で細胞を培養もできます。
7. 鶏主のファブリキウス嚢細胞で IBDV レプリケーションの定量化
- 目的の時点の感染後に細胞を再懸濁します、適切なチューブに移して、5 分 400 × gで遠心分離機のそれらおよびプラクの試金またはリード Muench に従って、TCID50アッセイによって滴定ウイルス上清を収穫法15。
- 1 mL の PBS のセルを洗浄し IBDV に抗体で免疫染色のいずれかにそれらを準備または (製造元の指示に従って) 適切なキットを使用して RNA を抽出し、逆のトランスクリプションの量的なポリメラーゼ チェーンを実行反応 (RT qPCR) を使用して (前方、GAGGTGGCCGACCTCAACT; IBDV 遺伝子特定のプライマー逆に、GCCCGGATTATGTCTTTGAAG)。モック感染培養細胞は、コントロールとして使用する必要があります。
Representative Results
鶏主のファブリキウス嚢細胞は鶏 CD40L の存在下で培養することができます。
鶏主のファブリキウス嚢細胞可溶性 chCD40L の存在下で培養、細胞数が急増 9.02 x 10 から 3.63 × 105 6欠席したときとは異なり、6 日間の期間にわたって mL あたり (p < 0.05) (図 1 a)。細胞生存率も向上、たとえば 25% 48 %chcd40l 存在下での chCD40L の不在で 3 日目後文化から (p < 0.05)13(図 1 b)。
両方の細胞培養の適応のレプリケーションと, IBDV の非常に病原性菌株鶏主のファブリキウス嚢細胞をサポートします。
18 h が固定されたモック感染し、感染した細胞培養接種, IBDV VP2 と Alexa Fluor 488 に共役、DAPI で counterstained 二次抗体に対する抗体で標識。感染した細胞は、核の細胞質内, IBDV の存在と一致 (図 2 a) の周り緑の蛍光性の証拠を持っていた。これは, IBDV の 2 系統の明らか、細胞培養の適応ひずみ、D78、および非常に悪性のひずみ、UK661 (図 2 a)。5、18、24、48 h の感染後、RNA は感染した文化から抽出され、VP4 IBDV 遺伝子の節約された地域に固有のプライマーと Rt-qpcr を受けます。VP4 の式は最初の家は維持遺伝子 TBP に正規化され、フォールドの変更を ΔΔCt 分析のモック サンプルを基準として表されます。IBDV VP4 式 D78 の 48 h 感染後でコピーは 16,603 と 38,632 UK661 で 48 h 感染後に増加しました。一緒に取られて、これらのデータを示す鶏主のファブリキウス嚢細胞は細胞文化適応および非常に劇毒性 IBDV 系統13のレプリケーションをサポートできます。
図 1: 鶏主のファブリキウス嚢細胞は鶏 CD40L の存在下で培養することができます。ChCD40L の有無で鶏主のファブリキウス嚢細胞培養 (黒バーとバーは白、それぞれ)。(A) 実行可能なセルの割合が示された時点の感染後に決定された生きた細胞と (B) の数。表示されるデータは、少なくとも 3 つの複製実験の代表、誤差、平均値の標準偏差を表す、統計的有意性を求めた一スチューデントのtを使用して-それぞれの時点でテスト * p <0.05。 この図は、ダリッジ ・らからの許可と変更されています。13。
図 2: 鶏主のファブリキウス嚢細胞は両方の培養と適応のレプリケーションと, IBDV の非常に劇毒性の緊張をサポートできます。(A) 鶏主のファブリキウス嚢細胞はモック感染されたり、D78 または UK661 のいずれかに感染していると各文化からのサンプルの修正、ラベルおよびイメージ: IBDV VP2、緑;核、青。スケール バー = 7 μ m。 (B) RNA は逆転写され、示された時点の感染後に抽出された、VP4 IBDV 遺伝子の節約された地域を定量的 PCR で増幅されました。VP4 コピー数は TBP ハウスキーピング遺伝子に正規化され、2-ΔΔCT方法に従ってサンプルをモック感染に関連して表現の変更ログ10フォールド。表示されるデータは、少なくとも 3 つの複製実験の代表と誤差は平均値の標準偏差を表します。この図は、ダリッジ ・らからの許可と変更されています。13。
Discussion
本研究では鶏主のファブリキウス嚢細胞体外可溶性 chCD40L 存在下での培養に成功と、これらの細胞は、弱毒株と非常に病原性 IBDV のレプリケーションをサポートできることを示す.この前のヴィヴォモデルは、体内と体外の研究上の明確な利点を持って、IBDV 感染13への細胞の応答方法を決定する使用できます。
BF を収穫するとき、孤立性ファブリキウス嚢細胞の細菌汚染を避けるために腸はパンクしないことが重要です。また、細胞死を抑える器官収穫後できるだけ早く一次電池を切り分けることが重要です。ChCD40L を使用する必要は、テクニックの制限しかし、Soubiesらによって実施された作業はホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート代わりに chCD40L14ファブリキウス嚢細胞生存率を延長する (PMA) の使用が研究所の大きい数によって採用されるモデルを有効にすることを示しています。上記プロトコルは、分子と観察細胞増殖と生存率の希釈した濃度でプライマリの B 細胞を培養によって経験的に、chCD40L の最適濃度を決定します。プロトコルに潜在的な変更の 1 つは、chCD40L 分子を浄化してバッチ間の変動を避けるために細胞培養媒体に特定濃度を追加する可能性があります。
生体内での研究はその次の IBDV 感染を示しているプロ炎症性サイトカイン、I 型 IFN の応答、および BF5,報9,10 でアポトーシスに関与する遺伝子の発現の増加があります。.しかし、感染、炎症性細胞と感染 B 細胞人口9と比較して遺伝子表現の異なる BF にエフェクター T 細胞の流入があります。したがって、IBDV 感染方法細胞応答を解釈することは困難です。これに対処するためいくつかの研究グループが文化16,17,18,19,20IBDV 感染細胞の転写応答を特徴とします。これらの in vitro研究明確に定義されたモアと感染後の時間ポイントの利点があります。ただし、生体外で研究は通常線維芽細胞細胞16,17,20または樹状細胞18で特徴づけられています。一方、ホスト細胞 IBDV 相互作用にいくつかの洞察力は、現在の信念は B 細胞の感染は, IBDV の病態と、したがって、データの関連性に重要な提供を overinterpreted ことはできません。当社前のヴィヴォファブリキウス嚢細胞培養モデル、前に 1 つだけ研究いた IBDV 感染19; B 細胞の細胞応答を特徴とただし、この研究には、ALV、作ることができる結論が制限される感染のため変換された B 細胞の不死化線が利用されています。対照的に、ここで説明した IBDV 感染の前のヴィヴォモデルでの in vitro研究では、定義されたモア タイム ポイント、その関連する宿主細胞とウイルスの相互作用を勉強しながらなどの利点を保持する研究者できます。一次性ファブリキウス嚢細胞は BF ササゲ葉から得られた、ない炎症性があるまたはによって T 細胞が存在して我々 を示しているフローサイトメトリー (標準的な条件を使用して) を次の chCD40L 刺激、セル人口の 97% が陽性B 細胞マーカー Bu 1 (データは示されていない)。3% の細胞が Bu 1 否定的な興味深いものになるこれらの細胞 IBDV 感染し、発症機序、遺伝子発現と貢献を探索するかどうかを決定します。
Ex vivo鶏主のファブリキウス嚢細胞培養モデルが ALV など回転、鶏に感染する他の B 細胞の熱帯ウイルス ホスト細胞ウイルスの相互作用を調査する拡張も可能、その他鳥類 (の拡張もできると見込んでください。例えばアヒル、七面鳥)。また前のヴィヴォ一次ファブリキウス嚢細胞培養する能力は、病因と鳥に感染することがなくこれらのウイルスによって引き起こされる免疫の面を調査する可能性を開きます。生体内での研究は、重大な合併症を引き起こすとこれは研究で交換、精製、および動物の使用量の削減に大きな影響を与えます。
要約すると、前のヴィヴォ鶏主ファブリキウス嚢細胞培養モデルここで説明したどのように鳥 B 細胞の生体内で使用される鳥の数を削減しながら宿主細胞と対話する熱帯ウイルスの理解を深める可能性があります。感染症の研究。複数のリンパ器官に応用することができます複数のウイルスや、潜在的に、複数種の鳥、鳥のウイルス学、免疫学の分野に貢献できる魅力的なモデルとなっています。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、孵化、飼育、無菌のファブリシウスの取り外しの鳥とキャロライン ・ ホルトの専門知識をカリングの専門知識パーブライト研究所の動物サービス チームに感謝したいと思います。バイオ テクノロジーを通して資金を供給される a. b. し、生物科学研究会議 (BBSRC)経由で与えます掲示板/E/私/00001845、中啓資金就労を介してBBSRC 掲示板/E/私/00002115、編入は国立センターを通じて資金を提供、交換、洗練 & 動物低減研究 (NC3Rs)経由でNC/R001138/1 を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
| FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56 °C for 1 h |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
| 0.22 µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) - CaCl22 - MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
| Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
| Insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
| 100 µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
| Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
| Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
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