Summary
Мы представляем методологии для количественного определения содержания крахмала в яичнике Примордия в черешня (Prunus avium L.) во время зимней спячки с помощью системы анализа изображений в сочетании с гистохимические методы.
Abstract
Изменения в крахмал в небольших структур связаны с ключевыми событиями во время нескольких процессов развития растений, включая репродуктивной фазы от опыления для оплодотворения и наступлением плодоношения. Однако вариации в крахмала во время дифференциация цветок не известны полностью, главным образом ввиду трудности количественного содержания крахмала в особенно малые структуры Примордия цветок. Здесь мы описываем метод количественного определения крахмала в яичнике Примордия черешни (Prunus avium L.) с помощью системы анализа изображений прилагается к Микроскоп, который позволяет, касающиеся изменений в содержание крахмала с различными фазами покоя с осени до весны. Для этой цели состояние покоя бутоны определяется путем оценки почка роста побегов, переведен в контролируемых условиях в различные моменты в зимнее время. Для количественной оценки крахмала в яичнике Примордия, бутоны последовательно собираются, фиксированной, встроенные в парафин, секционного и витражи с я2КЛ (калия йодида йод). Подготовка наблюдается под микроскопом и анализируются анализатором изображения, что отличает крахмала от фона. Содержание крахмала значения получаются путем измерения оптической плотности изображения, которое соответствует окрашенных крахмала, учитывая сумму оптической плотности каждого пикселя как оценки содержание крахмала изучал кадра.
Introduction
Умеренный древесных многолетних растений адаптироваться к сезоны, модулируя их роста и развития. В то время как они развиваются весной и летом, они перестают расти в течение осени пойти спящие в зимний1. Хотя состояние покоя позволяет им выжить в низких зимних температур, охлаждения является необходимым условием для надлежащего budburst в весной2. Важные последствия покоя в умеренных фруктов производства и лесного хозяйства привели к разнообразные усилия для определения и прогнозирования периода покоя3. В фруктовых деревьев, эмпирических экспериментов, передачи побеги заставляя условий и статистические прогнозы, основанные на данных цветения являются нынешние подходы к определить дату нарушение покоя, которая позволяет исследователям оценить охлаждение требования для каждого сорта. Однако как определить состояние покоя, основанные на биологических процессов остается неясным3.
Цветение в умеренных фруктовые деревья, такие как черешня (Prunus avium L.), происходит один раз в год и длится около недели. Однако цветы начинают различать и развивать около 10 месяцев назад, во время предыдущих летних4. Цветок Примордия остановить рост в течение осени оставаться спящие внутри почки в зимний период. В этот период каждый сорт необходимо накапливать конкретное требование охлаждения для надлежащего цветения4. Несмотря на отсутствие фенологическими изменениями в почки зимой цветок Примордия физиологически активны во время покоя, и накопление охлаждения температуры был недавно связан с динамика накопления крахмала или уменьшить в рамках клеток зачаток яичника предлагая новый подход для определения покоя5. Однако малый размер и расположение яичников зачаток требуют специальной методологии.
Крахмал является основным хранения углеводов в видов древесных растений6. Таким образом изменения в крахмал были связаны с физиологической активности цветок ткани, которые нужно углеводов для поддержки их развития7,8. Также различные ключевые события в ходе репродуктивного процесса связаны с вариациями в содержание крахмала в разных цветочной структур, таких как пыльников мейоз9, рост пыльцы трубы через стиль или яйцеклетку оплодотворение10. Гистохимические методы позволяют выявлять крахмала в каждой конкретной ткани цветок Примордия во время покоя. Однако трудность остается в количественном определении что крахмала, чтобы после его шаблон накопления/уменьшение времени или сравнения крахмала контента среди тканей, сортов или лет. Это объясняется небольшое количество ткани для аналитических методов11. В качестве альтернативы анализ изображений, связанных с микроскопии12 позволяет количественная оценка крахмала в очень малых образцов тканей растений13.
Подходы, сочетающие анализ микроскопии и изображения были использованы для количественного определения содержания различных компонентов в тканях растений, например, callose14,15пробирок, или крахмала16, измеряя размер области, окрашенные конкретными пятна. Для крахмала, это могут быть легко обнаружены, используя иодид калия йод (I2KI) реакции17. Этот метод является весьма специфический; Я2ки встраивается в рамках слоистые структуры крахмала зерна и образует темно синий или красновато коричневый цвет, в зависимости от амилоза содержание крахмала18. Разделы, окрашенных с я пятно ки2Показать адекватные контраст между крахмала и фон ткани, позволяя недвусмысленное крахмала обнаружения и последующего количественной системы анализа изображений19. Хотя эта краска не является стехиометрическим, накопление йода пропорциональна длина молекулы крахмала, которые могут весьма различаться17. Таким образом размер окрашенные области, выраженный в виде количество пикселей не может точно отражать содержание крахмала, поскольку высокая различия в содержание крахмала можно найти между полями с окрашенных областей аналогичного размера. В качестве альтернативы содержание крахмала может оцениваться путем измерения оптической плотности окрашенных гранул на черно-белых изображений, полученных с микроскопом, как сообщалось в различных тканях абрикосовое8,13 , 19,20авокадо10,и оливковых21.
Здесь мы описываем методологии, которая сочетает в себе экспериментального определения состояния покоя с количественного определения содержания крахмала в зачаток ткани яичника с осени до весны в вишни, предлагая новый инструмент для понимания и прогнозирования покоя, основанный на изучении биологических механизмов связана с покоя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. покоя решимость и растительных материалов коллекции
- Образец бутоны на местах. Покоя исследования долгосрочных экспериментов и требуют взрослых деревьев достаточно большой для сбора бутоны и стреляет всю зиму без ущерба для развития деревьев во время следующей весной. Специальные Орчард управления может потребоваться в зависимости от системы подготовки; Таким образом Обрезка может быть менее серьезными, чем для целей производства фруктов.
- Каждую неделю, с начала осени до начала распускания, собирать и весят 10 бутонов.
- Исправьте бутоны, помещая их в 10-мл стеклянной трубки с крышкой и Замочите образцы в фиксирующие растворе этанола/уксусной кислоты (3:1) для по крайней мере 24 часа при 4 ° C. Затем отбросить фиксатором и добавьте 75% этанола, щедро, обеспечение того, что она охватывает образцы. Образцы могут быть сохранены в этом растворе на 4 ° C до использования.
Примечание: Инфильтрации вакуум может использоваться для удаления пузырьков воздуха внутри бутона и предотвратить их от плавающих. Это облегчает проникновение фиксатором в тканях, но могут повредить структуру тканей. Старайтесь избегать его, если нет необходимости.
- Побеги в поле образец.
- Каждую неделю, с начала осени до начала распускания, принять три побеги 15-30 см в длину и 5 мм в диаметре, содержащие по крайней мере 10 цветочные бутоны. Разместите их на водянистыми флористов пены в камере роста на 22 ± 1 ° C с 12 h света фотопериода.
- После 10 дней в камере роста выбрать и весят 10 бутонов из побегов.
- Оценки роста Бад и определить состояние покоя. Периода отбора проб должен корректироваться с условиями расположения. В условиях фруктовый сад (Сарагоса, Испания, 41 ° 44'30 "N, 0 ° 47'00" W и 220 м над уровнем моря), с 30 ноября до конца февраля или начале марта была проведена выборки побегов.
- Еженедельно оцените ответ бутоны подходит роста условий палаты, с начала осени до budburst весной, сравнивая вес 10 бутонов, взял из поля.
- Если есть никаких различий или эти различия являются менее 30%, считают, что почки не выполнили их охлаждения требования и endodormant22. Если различия более чем на 30%, считают, что почки выполнили их охлаждения требования и ecodormant22.
2. завод подготовка для квантификации крахмала
- Выберите около шести фиксированных почки от каждой выборки Дата (см. шаг 1.1). В зависимости от сорта каждый цветок бутон черешни содержит до пяти Примордия цветок.
- Удалить внешние бутон весы и поместите бутон на часовщик стекло с 75% этанола, чтобы предотвратить его от высыхания.
- Вскрыть бутон и извлекать по крайней мере один цветок зачаток за Бад с помощью щипцов точности и офтальмологических скальпеля под стереоскопическим микроскопом. Первобытная цветок может быть сохранено в 10-мл стеклянной трубки с 75% этанола на 4 ° C, или немедленно приступить к следующему шагу.
- Обезвоживает образцы в серии третичный бутиловый спирт.
- Замените 75% этанола раствор 10 мл 75%, третичный бутиловый спирт (TBA) щедро образцы и проинкубируйте 1,5 ч. Пипетка Пастера может быть полезным для отмены решения.
- Повторите шаг 2.2.1, добавив TBA с ростом концентрации (85%, 95% и 100% v/v; и 3 x с чистой TBA) в сушильной печи при 30 ° C с вытяжной вентиляции, так как чисто TBA crystalizes при комнатной температуре (< 20 ° C) и весьма нестабильной и токсичных. Если та crystalizes с образцом, он бы повредить ткани.
- Внедрите образцы в парафин18.
- Расплава парафина, вводя парафин жемчуг в сушильной печи при 60 ° C с вытяжной за предыдущий день. Парафин жемчуг может быть также растаял на плитой, но убедитесь, что парафин жидкий при 60 ° C и не при более высокой температуре, чтобы избежать повреждения тканей.
- Замените TBA смесь ТБА и парафинового масла (1:1) и проинкубируйте 24 h внутри сушильной печи при температуре 60 ° C. Затем заменить сочетанием TBA и парафина нефти парафином Чистый расплав и инкубировать в течение 6 часов внутри сушильной печи при температуре 60 ° C. Повторить это 2 x и инкубировать последнего изменения для по крайней мере 4-6 d.
- Место каждого образца на небольшой металлический базы плесень на поверхности тепла, встроенные в парафин и темпы внедрения кассеты. Поместите его над холодной поверхностью и удалить блоке после затвердевшим воск.
- Раздел и увлажняет подготовки.
- Подготовить Хаупт клей: растворить 1 g равнина Нокс желатина в 100 мл дистиллированной воды при температуре 30 ° C; Затем добавьте 2 g свободные кристаллов фенола (C6H5OH) и 15 мл глицерина. Распространиться на стеклянную вставку с помощью кисти Хаупт клей и добавить каплю 1% раствора формальдегида.
- Раздел каждый парафин блок на 10 мкм в вращательное микротома и место разделы на слайд стекла покрытые Хаупт на клей.
- Место стекла слайды с разделами на поверхности тепла на 35-40 ° C до полного высыхания; затем переместите слайды стекла в слайд стойку.
- Подготовка решения dewax и регидратации. Место 200 мл Histoclear II в три стекла окрашивание блюда, еще один с Histoclear II:ethanol (1:1, v/v) этанола серии (100%, 70%, 40% v/v) и окончательный промыть дистиллированной воды.
- DEWAX секции с тремя моет, каждый 5 мин, в Histoclear II и Histoclear II:ethanol (1:1, v/v). Установите решетку слайд внутри стекла окрашивание блюда, обеспечивая, что решение полностью покрывает слайды и затем переместить слайд стойку из одного решения к следующему.
- Увлажняет разделах следующей серии 2-мин моет: серия этанола (100%, 70%, 40%, v/v) и окончательный промыть дистиллированной воды. Наконец сухие слайды стекла при комнатной температуре.
- Пятно разделы18.
- Готовить я пятно ки2: Растворите 2 г йодида калия (KI) и 0,2 г йода (я2) в 100 мл дистиллированной воды. Применить капли свежего я2ки над раздел 5 мин и затем сбросить избыток пятно, поглощая с промокательной бумаги. Быстро переходите к следующему шагу.
- Нанесите небольшое падение синтетических монтажа СМИ, место небольшой покровным стеклом на вершине и нажимать. После монтажа СМИ высыхает, наблюдать под микроскопом ярко поле для предварительной оценки завязи крахмала.
Примечание: Этот шаг не является обязательным, хотя получается лучше контраст между крахмала и фон. Если секция должна использоваться с другими пятна после количественной крахмала, поместите Стекло покровное падение пятно и отбросить избыточные, поглощая с промокательную бумагу (см. 2.5.1). Затем, после крахмала количественной оценки, вымыть, я2ки пятно с дистиллированной водой и место препараты на огне поверхности на 35-40 ° C до полного высыхания.
3. Количественная оценка содержание крахмала
- Калибровки оптических условий.
Примечание: Уровни обнаружения используется анализатором изображения для обнаружения окрашенных крахмала напрямую зависит от условий освещения и увеличение микроскопа; Таким образом исправьте эти условия для подготовки оценки. Адаптировать перестройки, предлагаемый здесь доступен микроскоп и условий освещения.- Настройка диафрагмы диафрагмы на 20 X увеличение и регулировки яркости или силы света.
- Убедитесь, что нет фильтров на держатель фильтра и выберите условие ярко поля в микроскопе. Выберите подходящий масштаб (например, 40 X для черешня завязи зачаток).
- Контроль условий приобретения изображений. Настроить параметры камеры с окрашенных подготовки без ткань через изображения | Приобретение | Предварительный просмотр.
- Исправить яркости на 50%, прирост в 1.0 x и гистограммы Индикаторы, гамма значение 1.00 и контраст на 0 - 100, накладки с пределы гистограммы распределения яркости.
- Активируйте функцию передержки/недоэкспозицией и отрегулировать время экспозиции на пределе передержки.
- Примените функция баланса белого для полного изображения для отображения всех компонентов нейтрального цвета изображения без каких-либо цветовой тон и коррекции затенения на полное изображение для создания образа исправлениями и однородной.
- Калибровка системы анализа изображений для получения значений элемента управления уровня серого (0, черный; 255, белый) различных оптических плотностей (OD), которые получаются путем значения коэффициента пропускания (T).
- Получить изображение окрашенных подготовки без ткани, считается управления белый, и измерить серый уровень черно-белое изображение через мера | Серый мера | Калибровки Грей | Ссылка значение = 0 | Мера | Калибровки | ОК. Это соответствует 100% пропускания; Таким образом, оптическая плотность 0, согласно од = 2 - журнал т.
- Получить изображение же подготовки с фильтром 4Н, который уменьшает количество света, 4 x и мера серый уровень черно-белое изображение через меру | Серый мера | Калибровки Грей | Ссылка значение = 0,6 | Мера | Калибровки | ОК. Это соответствует с 25% пропускания; Таким образом, оптическая плотность 0,6, согласно од = 2 - журнал т.
- Получить изображение же подготовки без света, считается черный, и измерить серый уровень черно-белое изображение через меру | Серый мера | Калибровки Грей | Ссылка значение = 1 | Мера | Калибровки | ОК. Это соответствует 0% пропускания; Таким образом, оптическая плотность 1, согласно од = 2 - журнал т.
- Обнаруживает крахмала.
- Получить цветное изображение поля для измерения в формате TIFF с разрешением по крайней мере 300 точек на дюйм (dpi).
- Создайте двоичный образ, соответствующий области витражи. Установить пороги три цвета (значения в диапазоне 0 - 255 для каждого) до тех пор, пока двоичное изображение точно отражает гранулы окрашенных крахмала, наблюдается, через изображения | Обнаруживать | Выберите пороговые значения красного, синего и зеленого | ОК. Сделать неоднократно визуального сравнения в различных препаратов и тканях настраивать уровни окончательный обнаружения. Хранить и использовать эти уровни для всех препаратов.
- Количественно крахмала. Преобразуйте оригинальные цветного изображения в черно-белое изображение с системой анализа изображения. Используйте двоичное изображение как накладывается маска на черно-белое изображение через изображения | Двоичного редактирования. Измерить сумму оптической плотности каждого пикселя под маску через меру | Серый уровень | OK и рассмотреть это значение как содержание крахмала в области измерений.
- Повторите шаги 3.4.1 - 3.4.3 в четырех местах Примордия яичников для получения представительной значения содержания крахмала в завязи цветка Примордия.
- Повторите шаги 3.4.1 - 3.4.3 и шаг 3.4.5 в разных цветов каждого сбора даты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Покоя исследования требуют определения момента, когда охлаждение требования выполнены. Несмотря на отсутствие фенологическими изменениями в зимний период в полевых условиях (рис. 1а) вишневые деревья не восстановить потенциал роста в подходящих условиях, до тех пор, пока они пройти определенный период при низких температурах. Регулярные передачи побегов в контролируемых условиях камеру (рис. 1B) в зимнее время позволило оценки состояния покоя бутоны. Оценки роста бутон цветка было сделано путем измерения увеличение веса БАД. В то время как во время покоя, никаких изменений может наблюдаться после 10 дней подходящих условий (рис. 1 c), после того, как преодолеть состояние покоя, бутоны пополнили и ворвались в камере роста (рис. 1 d). Результаты этого анализа позволили состояние покоя почек должен быть создан. Из-за различных температур, происходящих во время зимы покоя был преодолен на разные даты, в зависимости от года. В то время как в течение первого года изучения, нарушение покоя произошло в январе, второй год представил более мягкие зимы; Таким образом выполнение охлаждение произошло примерно через три недели после, в феврале.
Сладкая вишня несет бутоны шпоры, где верхушечный бутон вегетативные почки и боковые почки бутонов (Рисунок 1 c и 1 D). Недифференцированная почки начинают дифференцироваться в цветок или вегетативные почки в конце лета, и когда они войти покоя в зимнее время, несколько цветок Примордия остаются внутри бутона, защищены многочисленными зелеными весы и охватываемых коричневый внешний весы ( Рисунок 1 c и рисунок 2A). Рассечение бутон цветка показал маленький цветок Примордия внутри (рис. 2A). Каждый цветок бутон содержащихся одного до пяти отдельных цветок Примордия (рис. 2B). Несмотря на небольшой размер каждого цветка зачаток, все части цветка различаются и могут быть выделены: пестика, пыльники, лепестков и чашелистики (рис. 2 c). Использование гистохимические методы (алкоголь: уксусной фиксации [3:1], встраивание парафина, микротом секционирование и окрашивания на основе йода крахмал) допускается распространение крахмала в цветок зачаток тканях наблюдается (2D фигура ).
Крахмала в яичнике зачаток был количественно в каждом разделе. Четыре меры 1337 мкм2, при 40 кратном, представлял Генеральный план крахмала в зачаток завязи черешня (рис. 3A). Гранул крахмала были четко отграничены от фона после того как я2KI, окрашивание (рис. 3B). Системы анализа изображений, крахмал был опознан цветокоррекции, что пороговые значения красного, зеленого и синего до тех пор, пока все гранулы крахмала наблюдается были покрыты двоичный образ, созданный системой, основанной на параметрах определенного цвета (рис. 3 c). Содержание крахмала получены значения были результатом измерения оптической плотности каждого пикселя под маской на черно-белое изображение (рис. 3D).
Количественная оценка крахмала выявлены закономерности крахмала динамических в зимний период (рис. 4). Последовательно количество крахмала в начале зимы представлен значением оптической плотности меньше, чем 400003, а максимальное значение между 120.000 и 140 000 в обоих лет. В то время как в январе во время первого года (рис. 4A) было достигнуто максимальное значение, это произошло в феврале на второй год (рис. 4В). Контрастные эти результаты с лица покоя, максимальное количество крахмала произошли сопутствующе обстоятельств с ужасающей выполнение в обоих годах.
Этот подход требует определения статуса покоя (Рисунок 5A) одновременно с квантификацией крахмала на ткани яичника (Рисунок 5B) для того, чтобы сформулировать изменения в содержание крахмала по отношению к покоя.
Рисунок 1: экспериментальная установка для определения состояния покоя цветочные почки черешни. (A) ветви, в зимний период, показывают спящие почки закрыты и покрыты темно коричневый весы. (B) Эта группа показывает передано в камеру роста побегов. В середине января некоторых сортов, оставались в состоянии спячки с почки по-прежнему закрыт (белая стрелка), в то время как другие были способны расти, показаны пополнили почки (черная стрелка). (C) Эта группа показывает детали стрелять с спящие бутоны, расположенный сбоку и одного вегетативного бутон, расположенного в апикальной позиции в отрог. (D) Эта группа показывает детали стрелять после покоя было преодолеть после 10 дней в рост палата, показаны опухоль почки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: завод подготовка для квантификации крахмала. (A) Эта панель показывает поперечном разрезе бутон цветка, показаны два цветка Примордия (fp) защищены многочисленными весы (sc). (B), три цветка Примордия (fp) собираются в бутон цветка. (C) Эта группа показывает поперечном разрезе зачаток цветок, с завитками продифференцировано: чашелистиков (se), лепестки (pe), пыльники () и пестик (pi). Завязь зачаток отличается на базе пестик (стрелка). (D) A средней секции цветок зачаток была собрана и исправлено в январе, встроенные в парафин, секционного и витражи с я2KI (темно-коричневый) для крахмала. Эта панель показывает зачаток яичников (стрелка). Масштаб бары являются 500 мкм в панели A и B и 200 мкм в панелей C и D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: крахмал количественной оценки в черешня завязи зачаток. (A) Эта группа показывает средней секции завязи зачаток витражи с я2KI, показаны четыре кадра в котором крахмала содержимого была измерена. (B) Эта группа показывает детали зачаток завязи. Гранул крахмала окрашенные в темно-коричневый. (C) Эта панель показывает псевдоцветном изображении в которой крахмал соответствует разные оттенки синего. (D) Эта группа показывает двоичное изображение-маску, охватывающих я2KI-окрашенных крахмала (синий) на черно-белой исходное изображение. Оптическая плотность измеряется только в пикселов исходного изображения, охватываемых маски. Масштаб бары находятся 100 мкм в группе A и 20 мкм в панели B - D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель результаты количественной оценки крахмала в черешня завязи Примордия собранные ежемесячно с осени до весны в течение двух лет различные зимние температурных условий. (A) Эта группа показывает результаты от 2010-2011 годы, которые холодной зимы. Выполнение охлаждения (снежинка) произошло в январе, наряду с максимальным количеством крахмала. (B) Эта группа показывает результаты от лет 2011-2012, который был мягкой зимой. Выполнение охлаждения (снежинка) произошло в феврале, наряду с максимальным количеством крахмала. Значения являются среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: схема экспериментального дизайна, чтобы оценить состояние покоя бутоны и количественной оценки крахмала в яичнике Примордия в вишни. (A) Эта группа показывает процессы определения статуса покоя: подготовка материала растений, процесс и полученные результаты. (B) Эта группа показывает процессы количественной оценки крахмала: гистохимические подготовка бутоны микроскопические наблюдения крахмал, обнаружения анализа изображения крахмала и количественной оценки крахмала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Покоя в древесных многолетних растений представляет четкие последствия в производство фруктов и лесного хозяйства в условиях изменения климата, хотя остается неясным, биологический процесс позади покоя. Покоя исследования можно подойти с различных точек зрения, но исследования, ищет биологического маркера для зимней спячки усилилась за последние годы. Однако большинство попыток найти недвусмысленное индикатор, отображающий, когда бутон нарушил покоя были безуспешными3. По методике, описанной здесь, сочетая гистохимические методы18 с анализа изображения, был очень полезным для изучения взаимосвязи между запасы углеводов конкретной ткани и ее физиологической активности в почки черешни на различных этапах покоя5 и может применяться также для других видов и тканей10,13,20.
Запасы углеводов в виде крахмала играют важную роль как в развитии цветок и репродуктивного процесса7,10,13,20,,2123 и в сезонности умеренных древесных многолетних растений6. Различные исследования по покоя обратили внимание на крахмал в бутоны24. Однако из-за их малого размера, всего несколько почки требуются для использования количественных аналитических методов, и обнаружение количественные различия в частности ткани или клетки ограничивается маскирующий эффект окружающие клетки. Комбинация гистохимические методы с системой анализа изображений предлагает хорошую возможность для изучения изменений в содержание крахмала различных структур внутри бутона.
Этот метод имеет ограничения предотвращения количественного определения точного содержания крахмала в ткани, но позволяет содержание относительной крахмала быть количественно следить за изменения количественных крахмала на времени25 и сравнить крахмала содержание различные ткани13,20, сортов или лет5. Для того, чтобы обеспечить корректное сравнение значения оптической плотности между полями, тканей и почки, калибровка системы (освещенности, окрашивание интенсивности и масштаб) и настройка цвета, которые должны быть точно установлены пороговые значения , хранится и используется для всех препаратов.
Пятнать крахмала и количественной оценки, основанные на калий йод позволяет последующее использование других пятен после стирки секции. Таким образом различные анализы могут быть выполнены без дополнительных препаратов и синтетических монтажа, что средства массовой информации не используется5,20. Аналогичным образом морфометрические измерения26 может быть сделано после же препараты, позволяя модель накопления крахмала в рамке по отношению к росту различных структур5,13. Этот метод может быть адаптирована к другие структуры или видов с регулировкой уровня цвета, которые используют анализатор для обнаружения крахмал, который может позволить изучение других процессов развития, которые включают изменения в содержание крахмала в небольших группах клеток.
Взаимосвязь между покоя выпуска и крахмала накопление в яичнике Примордия обнародовал с использованием этого метода обеспечивает прочную основу для понимания биологической основы покоя и охлаждения требования5. Однако количественная оценка крахмала путем анализа изображений на парафин врезанных разделов может оказаться весьма громоздким и трудоемким для оценки охлаждения требований большое количество сортов. Будущие усилия должны быть сосредоточены на изучении надежных биологических показателей, которые могут легко указывают состояние покоя дерева. Тем временем шаблон крахмала вариации во время покоя может использоваться для дальнейших физиологических и генетических исследований, и сочетание гистохимические методы анализа изображений, описанные здесь, могут быть использованы в других древесных многолетних культур для количественно содержание крахмала в различных тканях применительно к покоя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят с благодарностью Мария Эрреро и Eliseo Ривас за их полезные обсуждения и консультации. Эта работа была поддержана Ministerio де Economía y развитию — Европейский фонд регионального развития, Европейский союз [Грант число BES-2010-037992 е. ф.]; Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [номера грантов RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; и городского управления-де-Арагон — Европейский Социальный фонд, Европейский союз [Grupo Консолидадо A12-17R].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
References
- Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae. Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).
- Rohde, A., Bhalerao, R. P.
- Fadón, E., Rodrigo, J. Unveiling winter dormancy through empirical experiments. Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).
- Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.). Trees - Structure and Function. , In Press (2018).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry. Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).
- Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots. HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiology. , (2016).
- Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca). Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).
- Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana). PLoS One. 8 (10), e78467 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Quantification of starch in plant tissues. Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Rodrigo, J., Herrero, M. Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.). Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).
- Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), (2012).
- Faulkner, C., et al. An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants. Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).
- Kuhn, B. F. Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. "Stevnsbaer.". European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).
- Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGraw-Hill. New York, NY. (1940).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York, NY. (1999).
- Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system. Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana). Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).
- Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering. Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).
- Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy - Physiological terminology and classification for dormancy research. HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques. Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).
- Kaufmann, H., Blanke, M. Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry. Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).
- Herrero, M., Dickinson, H. G. Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses. Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
