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Developmental Biology

सर्दियों निद्रा के दौरान मीठी चेरी के अंडाशय Primordia में स्टार्च Quantify करने के लिए Histochemical धुंधला और छवि विश्लेषण का मेल

Published: March 20, 2019 doi: 10.3791/58524
Automatic Translation
1, 1
1Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón

Summary

हम एक पद्धति प्रस्तुत करने के लिए एक छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके सर्दियों निद्रा के दौरान अंडाशय primordia में मीठी चेरी (prunus एवियम एल) में स्टार्च सामग्री की मात्रा ऊतक-रसायन तकनीकों के साथ संयुक्त ।

Abstract

छोटे ढांचों में स्टार्च में परिवर्तन कई पादप विकासात्मक प्रक्रियाओं के दौरान प्रमुख घटनाओं से संबद्ध होते हैं, जिनमें परागण से निषेचन और फलने की शुरुआत के जनन चरण शामिल होते हैं । हालांकि, फूल भेदभाव के दौरान स्टार्च में बदलाव पूरी तरह से ज्ञात नहीं कर रहे हैं, मुख्य रूप से फूल primordia के विशेष रूप से छोटे संरचनाओं में स्टार्च सामग्री बढ़ाता की कठिनाई के कारण । यहां, हम मीठी चेरी (Prunus एवियम एल) के अंडाशय primordia में स्टार्च के परिमाणन के लिए एक विधि का वर्णन एक छवि विश्लेषण माइक्रोस्कोप से जुड़ी प्रणाली है, जो विभिंन चरणों के साथ स्टार्च सामग्री में परिवर्तन से संबंधित की अनुमति देता है का उपयोग करके निद्रा की शरद ऋतु से वसंत तक. इस प्रयोजन के लिए, फूल कलियों की निद्रा की स्थिति सर्दियों के समय में अलग क्षणों में नियंत्रित स्थितियों को हस्तांतरित गोली मारता है की कली वृद्धि का मूल्यांकन द्वारा निर्धारित किया जाता है । अंडाशय प्रिमोर्डिया में स्टार्च के परिमाणन के लिए, फूल कलियों को क्रमिक रूप से एकत्र, स्थिर, पैराफिन मोम में अंतःस्थापित किया जाता है, खोदी गई और मैं2Kl (पोटेशियम आयोडाइड-आयोडीन) के साथ दाग । तैयारी माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जाता है और एक छवि विश्लेषक है कि स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि से स्टार्च भेद द्वारा विश्लेषण किया । स्टार्च सामग्री मूल्यों छवि है कि सना हुआ स्टार्च के अनुरूप के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं, एक फ्रेम के स्टार्च सामग्री का अनुमान के रूप में प्रत्येक पिक्सेल के ऑप्टिकल घनत्व के योग पर विचार अध्ययन किया ।

Introduction

कटिशीतक वुडी perennials उनके विकास और विकास नियमन द्वारा मौसम के लिए अनुकूल । जब वे वसंत और गर्मियों के दौरान विकसित, वे शरद ऋतु के दौरान बढ़ बंद करने के लिए सर्दियों में निष्क्रिय जाना1। हालांकि निद्रा उंहें कम सर्दियों के तापमान पर जीवित रहने के लिए अनुमति देता है, सर्द2वसंत में एक उचित budburst के लिए एक शर्त है । समशीतक फल उत्पादन और वानिकी में निद्रा के महत्वपूर्ण निहितार्थ के कारण निद्रा काल३का निर्धारण और पूर्वानुमान लगाने के विविध प्रयास किए गए हैं. फलों के पेड़ प्रजातियों में, अनुभविक प्रयोगों शर्तों और सांख्यिकी फूल के आंकड़ों के आधार पर भविष्यवाणियों को मजबूर करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण है निद्रा के टूटने की तारीख निर्धारित करने के लिए, जो शोधकर्ताओं का अनुमान करने की अनुमति देता है प्रत्येक फसल के लिए चिलिंग आवश्यकताओं । हालांकि, कैसे जैविक प्रक्रियाओं पर आधारित निद्रा स्थिति का निर्धारण करने के लिए स्पष्ट नहीं है3।

मीठी चेरी (Prunus एवियम एल) के रूप में समशीतक फलों के पेड़, में फूल, एक साल में एक बार होता है और एक पखवाड़े के बारे में रहता है । हालांकि, फूल अंतर और के बारे में 10 महीने पहले विकसित करने के लिए शुरू, पिछले4गर्मियों के दौरान । सर्दियों के दौरान कलियों के अंदर निष्क्रिय रहने के लिए शरद ऋतु के दौरान फूल primordia बढ़ बंद करो । इस अवधि में, प्रत्येक फसल के लिए उचित फूल4के लिए एक विशेष चिलिंग आवश्यकता जमा करने की जरूरत है । सर्दियों के दौरान कलियों में phenological परिवर्तन की कमी के बावजूद, फूल primordia फिजियोलॉजिकल निद्रा के दौरान सक्रिय हैं, और सर्द तापमान का संचय हाल ही में स्टार्च संचय या कमी के गतिशील के साथ जुड़ा हुआ है अंडाशय के कक्षों के भीतर, एक नया दृष्टिकोण की पेशकश निद्रा संकल्प के लिए5। हालांकि, छोटे आकार और अंडाशय के स्थान के लिए एक विशेष पद्धति की आवश्यकता होती है ।

स्टार्च वुडी पादप प्रजाति6में प्रमुख भंडारण कार्बोहाइड्रेट है । इस प्रकार, स्टार्च में परिवर्तन फूल ऊतकों, जो अपने7,8के विकास का समर्थन करने के लिए कार्बोहाइड्रेट की जरूरत की शारीरिक गतिविधि से संबंधित किया गया है । प्रजनन प्रक्रिया के दौरान विभिन्न प्रमुख घटनाओं भी विभिन्न पुष्प संरचनाओं में स्टार्च सामग्री में विविधताओं से संबंधित हैं, जैसे कि एंथर माइयोसिस9, शैली या बीजांड निषेचन10के माध्यम से पराग ट्यूबों के विकास. ऊतक-रासायनिक तकनीक निद्रा के दौरान पुष्प प्रिमोर्डिया के प्रत्येक विशेष ऊतक में स्टार्च का पता लगाने की अनुमति देते हैं । तथापि, कठिनाई यह है कि स्टार्च समय के साथ संचय/कमी के अपने पैटर्न का पालन करने की अनुमति देने के लिए या ऊतकों के बीच स्टार्च सामग्री की तुलना, cultivars, या वर्षों में रहता है । इस विश्लेषणात्मक तकनीक11के लिए उपलब्ध ऊतक की थोड़ी राशि के कारण है । एक विकल्प के रूप में, छवि माइक्रोस्कोपी से जुड़े विश्लेषण12 संयंत्र ऊतक के बहुत छोटे नमूनों में स्टार्च की मात्रा परिमाणन की अनुमति देता है13.

माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण के संयोजन के दृष्टिकोण संयंत्र के ऊतकों में विभिन्न घटकों की सामग्री को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जैसे callose14, माइक्रोट्यूब15, या स्टार्च16, विशिष्ट द्वारा रंगे क्षेत्र के आकार का माप करके दाग. स्टार्च के लिए, यह आसानी से पोटेशियम आयोडाइड-आयोडीन (I2KI) प्रतिक्रिया17का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है । यह विधि अत्यंत विशिष्ट है; मैं स्टार्च अनाज के स्तरीय संरचना के भीतर2KI intercalates और एक गहरे नीले या लाल-भूरे रंग के रूपों, स्टार्च18के ऐमिलोस सामग्री पर निर्भर करता है । मैं के साथ दाग वर्गों2की दाग स्टार्च और पृष्ठभूमि ऊतक के बीच पर्याप्त विपरीत दिखाने के लिए, एक स्पष्ट स्टार्च का पता लगाने और छवि विश्लेषण प्रणाली19द्वारा बाद परिमाणन की अनुमति । यद्यपि यह डाई रससमीकरणमितीय नहीं है, आयोडीन का संचय स्टार्च अणु की लंबाई के समानुपाती होता है, जो कि अत्यधिक17भिन्न हो सकता है । इस प्रकार, दाग पिक्सेल की संख्या के रूप में व्यक्त क्षेत्र के आकार सही स्टार्च की सामग्री को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है, स्टार्च सामग्री में उच्च अंतर के बाद से इसी तरह के आकार के दाग क्षेत्रों के साथ खेतों के बीच पाया जा सकता है । एक विकल्प के रूप में, स्टार्च सामग्री काले और सफेद खुर्दबीन से प्राप्त छवियों पर दाग granules के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, के रूप में यह खुबानी8,13 में विभिंन ऊतकों में सूचित किया गया है , 19, avocado10,20, और जैतून21।

यहां, हम एक पद्धति है कि शरद ऋतु से, मीठी चेरी में वसंत के लिए अंडाशय आदिम ऊतक में स्टार्च सामग्री की मात्रा के साथ निद्रा स्थिति के प्रयोगात्मक संकल्प को जोड़ती है का वर्णन, समझ और भविष्यवाणी के लिए एक नया उपकरण की पेशकश निद्रा से जुड़े जैविक तंत्रों के अध्ययन के आधार पर निद्रा का.

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Protocol

1. निद्रा निर्धारण और पौध सामग्री संग्रह

  1. खेत में फूल की कलियों का सैंपल लिया । निद्रा अध्ययन दीर्घकालिक प्रयोग होते हैं और अगले वसंत के दौरान वृक्षों के विकास से समझौता किए बिना सभी सर्दियों में कलियों को एकत्र करने के लिए वयस्क वृक्षों को काफी बड़ा होना चाहिए । प्रशिक्षण प्रणाली के आधार पर विशेष बाग प्रबंधन की आवश्यकता हो सकती है; इस प्रकार, pruning फल उत्पादन प्रयोजनों के लिए की तुलना में कम गंभीर हो सकता है ।
    1. प्रत्येक सप्ताह, शरद ऋतु की शुरुआत से कली तोड़ने की शुरुआत तक, इकट्ठा करने और 10 फूल कलियों वजन ।
    2. एक कैप के साथ 10 मिलीलीटर ग्लास ट्यूब में रखकर फूल कलियों को ठीक करें और नमूने को इथेनॉल/एसिटिक एसिड (3:1) के एक फिक्सेटिव समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस से कम 24 ज के लिए भिगो दें । फिर, लगानेवाला त्याग और ७५% इथेनॉल जोड़ने के लिए, उदारता से यह सुनिश्चित करना है कि यह नमूनों को शामिल किया गया । नमूने का उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर इस समाधान में संरक्षित किया जा सकता है ।
      नोट: वैक्यूम घुसपैठ कली के अंदर हवा के बुलबुले हटाने और उन्हें तैरते से रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह ऊतकों में फिक्टिव के प्रवेश की सुविधा है, लेकिन ऊतकों की संरचना को नुकसान पहुंचा सकता है । यदि आवश्यक न हो तो इससे बचने का प्रयास करें ।
  2. सैंपल को फील्ड में शूट कर रहे हैं ।
    1. प्रत्येक सप्ताह, शरद ऋतु की शुरुआत से कली तोड़ने की शुरुआत तक, लंबाई में 15-30 सेमी की तीन गोली मार और व्यास में 5 मिमी, कम से 10 फूल कलियों प्रत्येक युक्त ले लो । उंहें एक विकास कक्ष में पानी से लथपथ फूलवाला फोम पर प्लेस 22 ± 1 ° c में एक 12 एच प्रकाश photoperiod के साथ ।
    2. विकास कक्ष में 10 दिनों के बाद, उठाओ और शूट से 10 फूल कलियों वजन ।
  3. बड वृद्धि का मूल्यांकन और निद्रा स्थिति का निर्धारण. प्रतिचयन अवधि को स्थान की शर्तों में समायोजित करना होगा । बाग की स्थितियों में (ज़रागोज़ा, स्पेन, 41 ° 44 ' 30 "N, 0 ° 47 ' 00" W, और २२० m समुद्र तल से ऊपर), शूटिंग की सैंपलिंग 30 नवंबर से फरवरी के अंत तक या मार्च की शुरुआत तक की जाती थी ।
    1. साप्ताहिक चैंबर के उपयुक्त विकास की स्थिति के लिए फूल कलियों की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन, शरद ऋतु की शुरुआत से बसंत में budburst तक, क्षेत्र से उठाया 10 कलियों के वजन की तुलना करके ।
    2. यदि कोई मतभेद नहीं है या उन मतभेदों को 30% से कम कर रहे हैं, विचार है कि कलियों उनकी चिलिंग आवश्यकताओं को पूरा नहीं किया है और endoसुप्त22हैं । यदि मतभेद 30% से अधिक हैं, तो गौर करें कि कलियों ने उनकी चिलिंग आवश्यकताओं को पूरा किया है और22इकोडोरमैंट हैं ।

2. स्टार्च परिमाणन के लिए पौध सामग्री तैयार करना

  1. प्रत्येक नमूना दिनांक से लगभग छः निश्चित कलियों का चयन करें (चरण १.१ देखें). किस्मों के आधार पर, प्रत्येक मीठी चेरी फूल कली पांच फूल primordia को शामिल है ।
    1. बाह्य कली तराजू निकालें और ७५% इथेनॉल के साथ एक घड़ीसाज़ कांच पर कली जगह बाहर सुखाने से रोकने के लिए ।
    2. कली काटना और एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत परिशुद्धता संदंश और एक नेत्रविज्ञान स्केलपेल की मदद से कली प्रति कम एक फूल आद्यक निकालें । फ्लॉवर प्रिमोर्डियम 4 डिग्री सेल्सियस पर ७५% इथेनॉल के साथ एक 10 मिलीलीटर ग्लास ट्यूब में संरक्षित किया जा सकता है, या अगले कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ना ।
  2. एक तृतीयक ब्यूटिल अल्कोहल श्रृंखला में नमूनों को डिहाइड्रेट करना ।
    1. ७५% इथेनॉल समाधान की जगह 10 मिलीलीटर के ७५% तृतीयक ब्यूटिल अल्कोहल (टीबीए) के नमूनों को उदारता से कवर करने के लिए और उन्हें १.५ एच के लिए सेते हैं । एक पाश्चर पिपेट समाधान को त्यागने के लिए उपयोगी हो सकता है ।
    2. 2.2.1 कदम दोहराएं, बढ़ती सांद्रता के साथ TBA जोड़ने (८५%, ९५%, और १००%, v/v; और शुद्ध TBA के साथ 3x) एक सुखाने स्टोव में 30 ° c पर हवा निष्कर्षण के साथ, के बाद से शुद्ध TBA क्रिस्टलाइज कमरे के तापमान (< 20 डिग्री सेल्सियस) पर और बहुत अस्थिर और विषाक्त है । यदि TBA नमूना के साथ crystalizes, यह ऊतकों को नुकसान होगा ।
  3. पैराफिन18में नमूनों एंबेड ।
    1. पिछले दिन हवा निष्कर्षण के साथ ६० डिग्री सेल्सियस पर सुखाने स्टोव में पैराफिन मोती शुरू करने से पैराफिन पिघल । पैराफिन मोती भी एक hotplate पर पिघला किया जा सकता है, लेकिन यह सुनिश्चित करें कि तरल पैराफिन ६० डिग्री सेल्सियस पर है और नहीं एक उच्च तापमान पर, ऊतक क्षति से बचने के लिए ।
    2. टीबीए और पैराफिन तेल (1:1) के मिश्रण के साथ TBA बदलें और ६० डिग्री सेल्सियस पर एक सुखाने स्टोव के अंदर 24 ज के लिए सेते । फिर, TBA और पैराफिन तेल के मिश्रण के साथ शुद्ध पिघल पैराफिन और ६० डिग्री सेल्सियस पर एक सुखाने स्टोव के अंदर कम से 6 एच के लिए सेते की जगह । यह 2x दोहराएं और कम से कम 4-6 डी के लिए पिछले परिवर्तन सेते ।
    3. एक गर्मी की सतह पर एक छोटे से धातु के आधार मोल्ड पर प्रत्येक नमूना प्लेस, पैराफिन मोम में एंबेडेड है, और गति embedding कैसेट । यह एक ठंडी सतह पर रखें और एक बार मोम जम जाता है ब्लॉक हटा दें ।
  4. सेक्शन और रिहाइड्रेट की तैयारियां कर रहे हैं ।
    1. तैयार Haupt है चिपकने वाला: 30 डिग्री सेल्सियस पर आसुत पानी की १०० मिलीलीटर में सादे Knox जिलेटिन की 1 जी भंग; फिर, phenol ढीला क्रिस्टल के 2 जी जोड़ने (सी6एच5ओह) और ग्लिस्टल के 15 मिलीलीटर. एक ब्रश के साथ एक गिलास स्लाइड पर Haupt चिपकने वाला फैला है और एक 1% formaldehyde समाधान की एक बूंद जोड़ें ।
    2. खंड एक घूर्णी माइक्रोटोम में 10 μm पर एक पैराफिन ब्लॉक और ग्लास स्लाइड Haupt चिपकने वाला के साथ कवर पर वर्गों जगह है ।
    3. ३५ पर एक गर्मी की सतह पर वर्गों के साथ ग्लास स्लाइड प्लेस-४० ° c सूखी तक; फिर, शीशे की स्लाइड् स को स्लाइड रैक पर ले जाएं ।
    4. डीवैक्स और पुनर्जलपूरण समाधान तैयार करें । (1:1, v/v), एक इथेनॉल श्रृंखला (१००%, ७०%, ४०%, v/v), और एक अंतिम आसुत-पानी धोने-तीन गिलास धुंधला व्यंजन में Histoclear द्वितीय के २०० मिलीलीटर प्लेस, Histoclear द्वितीय के साथ एक और एक ।
    5. Dewax तीन washes, प्रत्येक 5 मिनट के साथ वर्गों, Histoclear द्वितीय में और Histoclear द्वितीय में: इथेनॉल (1:1, v/ कांच धुंधला व्यंजन के अंदर स्लाइड रैक प्लेस, यह सुनिश्चित करना है कि समाधान पूरी तरह से स्लाइड कवर, और फिर, स्लाइड रैक एक समाधान से अगले करने के लिए ले जाएं ।
    6. 2 की निम्नलिखित श्रृंखला द्वारा वर्गों Rehydrate-ंयूनतम washes: एक इथेनॉल श्रृंखला (१००%, ७०%, ४०%, v/वी) और एक अंतिम आसुत पानी धोने । अंत में, कमरे के तापमान पर कांच स्लाइड सूखी ।
  5. 18वर्गों दाग ।
    1. तैयार मैं2ki दाग: पोटेशियम आयोडाइड के 2 जी को भंग (ki) और आयोडीन की ०.२ जी (मैं2) आसुत पानी की १०० मिलीलीटर में । 5 मिनट के लिए खंड (ओं) पर ताजा मैं2KI की एक बूंद लागू करें और, तो, यह एक सोख्ता कागज के साथ अवशोषित द्वारा दाग के अतिरिक्त त्याग । जल्दी से अगले कदम के लिए आगे बढ़ना ।
    2. एक सिंथेटिक बढ़ते मीडिया की एक छोटी सी बूंद लागू करें, शीर्ष पर एक छोटे से कवर गिलास जगह है, और कठिन दबाएं । एक बार बढ़ते मीडिया dries, अंडाशय स्टार्च के प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण ।
      नोट: यह चरण अनिवार्य नहीं है, हालांकि स्टार्च और पृष्ठभूमि के बीच एक बेहतर कंट्रास्ट प्राप्त किया जाता है । यदि खंड स्टार्च मात्रा के बाद अंय दाग के साथ पुन: उपयोग किया जाना है, दाग की बूंद पर कवर गिलास जगह और यह एक सोख्ता कागज के साथ अवशोषित द्वारा अतिरिक्त त्याग (2.5.1 देखें) । फिर, स्टार्च मात्रा के बाद, मैं आसुत पानी के साथ मैं2KI दाग बाहर धोने और सूखी जब तक ३५-४० डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी की सतह पर तैयारी जगह ।

3. स्टार्च सामग्री का परिमाणन

  1. ऑप्टिकल शर्तों कैलिब्रेट ।
    नोट: दाग स्टार्च का पता लगाने के लिए छवि विश्लेषक द्वारा इस्तेमाल किया गया पता लगाने के स्तर सीधे प्रकाश की स्थिति और माइक्रोस्कोप के आवर्धन पर निर्भर हैं; इस प्रकार, मूल्यांकन सभी तैयारी के लिए इन शर्तों को ठीक । अनुकूलन उपलब्ध माइक्रोस्कोप और प्रकाश की स्थिति के लिए यहां प्रस्तावित समायोजन ।
    1. 20X आवर्धन और चमक नियंत्रण या प्रकाश तीव्रता पर एपर्चर डायाफ्राम समायोजित करें ।
    2. सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर होल्डर पर कोई फ़िल्टर नहीं हैं, और सूक्ष्मदर्शी में एक उज्ज्वल क्षेत्र की स्थिति का चयन करें । एक उपयुक्त आवर्धन (जैसे, मीठा चेरी अंडाशय primordium के लिए 40x) का चयन करें ।
  2. छवि अधिग्रहण की स्थिति को नियंत्रित । छवि के माध्यम से ऊतक के बिना एक दाग तैयारी के साथ कैमरा सेटिंग्स को समायोजित करें । अर्जन | पूर्व देखें।
    1. चमक ५०% पर फिक्स, 1.0 x पर लाभ, और हिस्टोग्राम संकेतकों १.०० पर गामा मूल्य और 0-100 में इसके विपरीत, चमक वितरण हिस्टोग्राम की सीमा के साथ अस्तर ।
    2. अति उद्भासन/अंडरएक्सपोजर फंक्शन को सक्रिय करें और ओवरएक्सपोजर की सीमा पर एक्सपोज़र समय को एडजस्ट करें ।
    3. किसी भी रंग टोन के बिना छवि के सभी तटस्थ रंग का घटक और एक सही और सजातीय छवि बनाने के लिए पूरी छवि के लिए छायांकन सुधार प्रदर्शित करने के लिए पूरी छवि के लिए सफेद संतुलन समारोह लागू करें ।
  3. विभिन्न ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) के धूसर स्तर (0, black; २५५, सफ़ेद) के नियंत्रण मानों को प्राप्त करने के लिए छवि विश्लेषण प्रणाली को जांचना जो कि संप्रेषण (T) मानों द्वारा प्राप्त किया जाता है.
    1. ऊतक के बिना एक दाग तैयारी की एक छवि प्राप्त, नियंत्रण सफेद माना जाता है, और उपाय के माध्यम से काले और सफेद छवि के ग्रे स्तर उपाय । ग्रे उपाय । जांचना ग्रे । संदर्भ मान = 0 । उपाय | जांचना । ठीकहै । यह एक १००% संप्रेषण के साथ मेल खाती है; इस प्रकार, एक ऑप्टिकल घनत्व 0, आयुध डिपो के अनुसार = 2-लॉग टी ।
    2. एक 4N फिल्टर है, जो प्रकाश 4n की मात्रा कम कर देता है, और उपाय के माध्यम से काले और सफेद छवि के ग्रे स्तर को मापने के साथ एक ही तैयारी की एक छवि प्राप्त करें । ग्रे उपाय । जांचना ग्रे । संदर्भ मान = ०.६ । उपाय | जांचना । ठीकहै । यह एक 25% संप्रेषण के साथ मेल खाती है; इस प्रकार, एक ऑप्टिकल घनत्व ०.६, आयुध डिपो के अनुसार = 2-लॉग टी ।
    3. प्रकाश के बिना एक ही तैयारी की एक छवि प्राप्त, काले माना जाता है, और उपाय के माध्यम से काले और सफेद छवि के ग्रे स्तर को मापने । ग्रे उपाय । जांचना ग्रे । संदर्भ मान = 1 । उपाय | जांचना । ठीकहै । यह एक 0% संप्रेषण के साथ मेल खाती है; इस प्रकार, 1 का एक ऑप्टिकल घनत्व, आयुध डिपो के अनुसार = 2-लॉग टी ।
  4. स्टार्च का पता लगाएं ।
    1. एक रिज़ॉल्यूशन के साथ TIFF स्वरूप में मापने के लिए फ़ील्ड का एक रंग छवि प्राप्त करें कम ३०० डॉट्स प्रति इंच (dpi) ।
    2. दाग क्षेत्र के संगत एक बाइनरी छवि बनाएं । तीन रंग थ्रेसहोल्ड सेट करें (प्रत्येक के लिए 0-255 के बीच मान) जब तक द्विआधारी छवि बिल्कुल दाग स्टार्च granules को दर्शाता है, छवि के माध्यम से मनाया । पता लगाएं । लाल, नीले और हरे रंग की थ्रेसहोल्ड का चयन करें । ठीकहै । अंतिम पता लगाने के स्तर को ट्यून करने के लिए विभिन्न तैयारी और ऊतकों में बारंबार दृश्य तुलना करें । स्टोर और सभी तैयारी के लिए इन स्तरों का उपयोग करें ।
    3. स्टार्च Quantify. छवि विश्लेषण प्रणाली के साथ एक काले और सफेद छवि में मूल रंग छवि कंवर्ट । छवि के माध्यम से काले और सफेद छवि पर एक अध्यारोपित मुखौटा के रूप में द्विआधारी छवि का प्रयोग करें । बाइनरी संपादन। उपाय के माध्यम से मुखौटा के तहत हर पिक्सेल के ऑप्टिकल घनत्व का योग उपाय । धूसर स्तर । ठीक है और मापा क्षेत्र में स्टार्च सामग्री के रूप में इस मूल्य पर विचार करें ।
    4. चरणों को दोहराएं 3.4.1-3.4.3 अंडाशय के चार स्थानों में से एक का प्रतिनिधित्व मूल्य प्राप्त करने के लिए primordia फूल primordia के अंडाशय में स्टार्च सामग्री ।
    5. चरणों को दोहराएं 3.4.1-3.4.3 और प्रत्येक संग्रह की तारीख के विभिंन फूलों में कदम 3.4.5 ।

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Representative Results

निद्रा अध्ययनों से उस क्षण के निर्धारण की आवश्यकता होती है, जब चिलिंग आवश्यकताएँ पूरी हो जाती हैं. क्षेत्र की परिस्थितियों के तहत सर्दियों के दौरान phenological परिवर्तन की कमी के बावजूद (चित्र 1ए), चेरी के पेड़ उचित परिस्थितियों में वृद्धि की क्षमता की वसूली नहीं जब तक वे कम तापमान के तहत एक निश्चित अवधि के पास । सर्दियों के समय के दौरान एक नियंत्रित स्थितियों चैंबर (चित्र 1b) को गोली मारता है की नियमित स्थानांतरण फूल कलियों की निद्रा स्थिति के मूल्यांकन की अनुमति दी । फूल कली वृद्धि का मूल्यांकन बड भार में वृद्धि को मापने के द्वारा किया गया. जबकि, निद्रा के दौरान, कोई परिवर्तन उपयुक्त परिस्थितियों के 10 दिनों के बाद देखा जा सकता है (चित्र 1C), एक बार निद्रा पर काबू पाने के बाद, कलियों ने विकास कक्ष में फूटे और फट गए (चित्र 1c) । इस विश्लेषण के परिणामों ने कलियों की निद्रा स्थिति को स्थापित करने की अनुमति दे दी. सर्दियों के दौरान होने वाले अलग तापमान के कारण, वर्ष के आधार पर विभिन्न तिथियों पर निद्रा पर काबू पाया गया । जबकि, अध्ययन के पहले वर्ष के दौरान, निद्रा के टूटने जनवरी में हुई, दूसरे वर्ष एक मामूली सर्दी प्रस्तुत; इस प्रकार, चिलिंग पूर्ति के बारे में तीन सप्ताह के बाद, फरवरी में हुई ।

मीठी चेरी spurs में फूल कलियों भालू, जहां शीर्ष कली एक वनस्पति कली है और पार्श्व कलियों फूल कलियों (चित्रा 1 सी और 1 डी) हैं । Undifferentiated कलियों के लिए गर्मियों के अंत में फूल या वनस्पति कलियों में अंतर शुरू कर दिया, और जब वे सर्दियों के समय में निद्रा में प्रवेश, कई फूल primordia कली के अंदर रहना, कई हरे तराजू द्वारा संरक्षित है और भूरे रंग के बाहरी तराजू द्वारा कवर ( चित्रा 1 सी और चित्रा 2a) । फूल कली के विच्छेदन के अंदर छोटे से फूल primordia दिखाया (चित्रा 2A) । प्रत्येक फूल की कली में एक से पांच व्यक्ति पुष्प प्रिमोर्डिया (चित्र 2B) निहित होते हैं । एक फूल के छोटे आकार के बावजूद, एक फूल के सभी भागों विभेदित कर रहे है और प्रतिष्ठित किया जा सकता है: पिस्टिल, anthers, पंखुड़ियों, और sepals (चित्र 2c) । ऊतक-रसायन तकनीकों का उपयोग (शराब: acetic [3:1] निर्धारण, पैराफिन मोम embedding, माइक्रोटोम sectioning, और आयोडीन आधारित स्टार्च धुंधला) फूल आद्यक ऊतकों के भीतर स्टार्च के वितरण की अनुमति के लिए मनाया जा (चित्रा 2 डी ).

प्रत्येक खंड में डिम्बग्रंथि में स्टार्च का परिमाण निर्धारित किया गया था । १३३७ μm2के चार उपाय, 40x आवर्धन पर, मीठी चेरी अंडाशय आद्यक (चित्रा 3a) में स्टार्च के सामान्य लेआउट का प्रतिनिधित्व किया । स्टार्च granules स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि से प्रतिष्ठित थे के बाद मैं2की धुंधला (चित्रा 3b) । स्टार्च छवि विश्लेषण प्रणाली द्वारा पहचाना गया था, लाल, हरे रंग की दहलीज का समायोजन करके, और नीले जब तक सभी स्टार्च granules परिभाषित रंग मापदंडों पर आधारित प्रणाली द्वारा बनाई गई द्विआधारी छवि द्वारा कवर किया गया (चित्रा 3c) । प्राप्त स्टार्च सामग्री के मूल्यों को काले और सफेद छवि (चित्रा 3 डी) पर मुखौटा के तहत हर पिक्सेल के ऑप्टिकल घनत्व के उपाय का परिणाम थे ।

स्टार्च का परिमाणन सर्दियों के दौरान स्टार्च गतिशील के एक सुसंगत पैटर्न से पता चला (चित्रा 4). लगातार, जल्दी सर्दियों में स्टार्च की मात्रा ४०,०००3से कम की एक ऑप्टिकल घनत्व मूल्य प्रस्तुत किया, जबकि अधिकतम राशि दोनों वर्षों में १२०,००० और १४०,००० के बीच एक मूल्य तक पहुंच गया । जबकि जनवरी में अधिकतम मूल्य प्रथम वर्ष के दौरान (चित्र 4a) तक पहुँच गया था, यह दूसरे वर्ष में फरवरी में हुआ (चित्रा 4b). निद्रा के रंग के साथ इन परिणामों के आकांक्षाएं, स्टार्च की अधिकतम राशि दोनों वर्षों में सर्द पूर्ति के साथ concomitantly हुआ ।

यह दृष्टिकोण निद्रा स्थिति के निर्धारण की आवश्यकता है (चित्रा 5A) अंडाशय ऊतक (चित्रा 5a) पर स्टार्च मात्रा के साथ concomitantly निद्रा के संबंध में स्टार्च सामग्री में परिवर्तन फ्रेम करने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 1: मीठा चेरी के फूल कलियों की निद्रा स्थिति के निर्धारण के लिए प्रयोगात्मक सेट अप । (क) सर्दियों के दौरान शाखाएं बंद और गहरे भूरे रंग के तराजू से ढकी हुई सुप्त कलियों को दर्शाती हैं । (ख) यह पैनल विकास कक्ष को हस्तांतरित की गई गोली दिखाता है । मध्य जनवरी में, कुछ किस्मों कलियों अभी भी बंद (सफेद तीर) के साथ निष्क्रिय रहे, जबकि अंय विकसित करने में सक्षम थे, बढ़कर कलियों (काले तीर) दिखा । (ग) इस पैनल में एक गोली का विवरण दर्शाया गया है जिसमें प्रसुप्त फूल कलियों के साथ लैटरली और एक एकल वनस्पति कली है जो स्पर में स्थित है । (घ) यह पैनल एक गोली का विवरण दिखाता है एक बार निद्रा बढ़ चैंबर में 10 दिनों के बाद दूर था, कली सूजन दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: स्टार्च मात्रा के लिए संयंत्र सामग्री की तैयारी । (ं) यह फलक एक फूल की कली का एक अनुप्रस्थ काट दर्शाता है, जो अनेक तराजू (sc) द्वारा रक्षित दो पुष्प प्रिमोर्डिया (fp) दर्शाता है । (इ) फूल की कली में तीन पुष्प प्रिमोर्डिया (एफपी) इकट्ठा होते हैं । (ग) यह पैनल एक फूल के आड़ा खंड को दर्शाता है, जिसमें सभी विभेदित: sepals (एसई), पंखुड़ी (पीई), एन्थर (ए) और पिस्टिल (पीआई) हैं । अंडाशय का आमूल (एरो) स्त्रीकेसर के आधार पर प्रतिष्ठित होता है । (घ) एक फूल के मध्य भाग में एक प्रिमोर्डियम एकत्र किया गया था और जनवरी में निर्धारित, पैराफिन मोम में एंबेडेड, खोदी, और मैं के साथ दाग2KI (गहरे भूरे रंग) के लिए स्टार्च । यह पैनल अंडाशय प्रिमोर्डियम (एरो) को दर्शाता है । स्केल्स सी और डीमें पैनलों A और B और २०० μm में स्केल पट्टियां ५०० μm हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: मीठी चेरी अंडाशय में स्टार्च परिमाणन । (क) इस पैनल में एक डिम्बग्रंथि प्रिमोर्डियम के मध्य खंड को दर्शाया गया है जिसमें मैं2की, चार तख्तों को दर्शाया गया था जिसमें स्टार्च सामग्री मापी गई थी । (इ) इस पैनल में अंडाशय के प्रिमोर्डियम का विवरण दर्शाया गया है । स्टार्च granules गहरे भूरे रंग में दाग रहे हैं । (ग) यह पैनल एक छद्म रंग की छवि को दर्शाता है जिसमें स्टार्च नीले के विभिन्न रंगों से मेल खाती है । (घ) यह पैनल काले और सफेद मूल छवि पर एक द्विआधारी छवि मास्क को कवर करता है जिसमें2की-सना स्टार्च (नीला) होता है । ऑप्टिकल घनत्व केवल मुखौटा द्वारा कवर मूल छवि के पिक्सल में मापा जाता है । स्केल बार्स पैनल A में १०० μm और पैनलों B - Dमें 20 μm हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: मीठे चेरी अंडाशय में स्टार्च परिमाणन के प्रतिनिधि परिणाम विभिन्न सर्दियों के तापमान की स्थिति के दो वर्षों के दौरान शरद ऋतु से वसंत के लिए मासिक एकत्र primordia. (क) यह पैनल वर्ष २०१०-२०११ से परिणाम दिखाता है, जिसमें सर्दी सर्दी थी । चिलिंग पूर्ति (snowflake) जनवरी में हुई, concomitantly स्टार्च की अधिकतम राशि के साथ । (ख) यह पैनल वर्ष २०११-२०१२ से परिणाम दिखाता है, जिसमें हल्का सर्दी था । चिलिंग पूर्ति (snowflake) फरवरी में हुई, स्टार्च की अधिकतम राशि के साथ concomitantly । मान माध्य ± की मानक त्रुटि है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: कलियों की निद्रा स्थिति का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन की योजना और मीठी चेरी में अंडाशय primordia में स्टार्च परिमाणन. (क) यह पैनल निद्रा स्थिति निर्धारण के वर्कफ़्लोज़ को दिखाता है: पादप सामग्री तैयारी, प्रक्रिया, और प्राप्त परिणाम. (ख) यह पैनल स्टार्च मात्रा का वर्कफ़्लोज़ दिखाता है: स्टार्च के सूक्ष्मदर्शी प्रेक्षण के लिए कलियों की ऊतक-रासायनिक तैयारी, स्टार्च का प्रतिबिंब विश्लेषण पता लगाना और स्टार्च परिमाणन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वुडी perennials में निद्रा फल उत्पादन और वानिकी में एक बदलती जलवायु में स्पष्ट निहितार्थ प्रस्तुत करता है, हालांकि निद्रा के पीछे जैविक प्रक्रिया अस्पष्ट बनी हुई है । निद्रा अध्ययन देखने के विभिन्न बिंदुओं से संपर्क किया जा सकता है, लेकिन शीतकालीन निद्रा के लिए एक जैविक मार्कर की तलाश में अनुसंधान पिछले वर्षों में तेज हो गया है. हालांकि, सबसे एक कली टूट गया है जब एक स्पष्ट सूचक को खोजने के लिए प्रयास असफल हो गया है निद्रा3। यहां वर्णित पद्धति, विश्लेषण छवि के साथ ऊतक-रसायन तकनीक18 के संयोजन, बहुत से एक विशेष ऊतक और मीठी चेरी कलियों में अपनी शारीरिक गतिविधि के कार्बोहाइड्रेट भंडार के बीच संबंध की जांच उपयोगी है निद्रा5 के विभिन्न चरणों के दौरान और अन्य प्रजातियों और ऊतकों10,13,20के लिए भी लागू किया जा सकता है.

स्टार्च के रूप में कार्बोहाइड्रेट भंडार फूल विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और प्रजनन प्रक्रिया7,10,13,20,21,23 और समशीतोष्ण वुडी perennials के मौसम में6। निद्रा पर विभिंन अध्ययनों से24कलियों के भीतर स्टार्च पर ध्यान दिया है । हालांकि, उनके छोटे आकार के कारण, मात्रात्मक विश्लेषणात्मक तरीकों के उपयोग के लिए कई सारी कलियों की आवश्यकता होती है, और विशेष रूप से ऊतकों या कोशिकाओं में मात्रात्मक विविधताओं का पता लगाना आसपास के कोशिकाओं के मास्किंग प्रभाव द्वारा सीमित होता है । छवि विश्लेषण प्रणाली के साथ ऊतक-रसायन तकनीकों के संयोजन के लिए एक अच्छा कली अंदर विभिंन संरचनाओं के स्टार्च सामग्री में परिवर्तन का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है ।

इस विधि के ऊतकों में स्टार्च की सटीक सामग्री की मात्रा को रोकने की सीमा है, लेकिन रिश्तेदार स्टार्च सामग्री की अनुमति देता है करने के लिए समय25 पर मात्रात्मक स्टार्च परिवर्तन का पालन करें और की स्टार्च सामग्री की तुलना परिमाणन हो विभिंन ऊतकों13,20, cultivars, या साल5। आदेश में क्षेत्रों, ऊतकों के बीच ऑप्टिकल घनत्व के मूल्यों की सही तुलना की अनुमति देने के लिए, और कलियों, सिस्टम के अंशांकन (प्रकाश की स्थिति, धुंधला तीव्रता, और आवर्धन) और रंग थ्रेसहोल्ड की सेटिंग सही ढंग से स्थापित किया जाना चाहिए , संग्रहीत, और सभी तैयारी के लिए इस्तेमाल किया ।

स्टार्च धुंधला और पोटेशियम आयोडीन के आधार पर परिमाणन अनुभाग की धुलाई के बाद अन्य दाग के बाद के उपयोग की अनुमति देता है । इस प्रकार, अलग विश्लेषण अतिरिक्त तैयारी के बिना किया जा सकता है और सिंथेटिक बढ़ते मीडिया5,20का इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं । इसी तरह, morphometric माप26 एक ही तैयारी के बाद किया जा सकता है, स्टार्च संचय के पैटर्न अलग संरचनाओं की वृद्धि के संबंध में तैयार करने की अनुमति5,13. विधि अंय संरचनाओं या रंग का स्तर है कि विश्लेषक का उपयोग करने के लिए स्टार्च, जो अंय विकासात्मक प्रक्रियाओं है कि कोशिकाओं के छोटे समूहों में स्टार्च सामग्री में परिवर्तन शामिल की अनुमति दे सकते है का पता लगाने के समायोजन के साथ प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

इस विधि के उपयोग द्वारा अनावरण किया अंडाशय primordia में निद्रा रिहाई और स्टार्च संचय के बीच संबंध निद्रा और सर्द आवश्यकताओं के जैविक आधार को समझने के लिए एक ध्वनि के आधार प्रदान करता है5. तथापि, पैराफिन-एम्बेड सेक्शन पर प्रतिबिंब विश्लेषण द्वारा स्टार्च मात्रा बहुत ही बोझिल और समय लेने वाली हो सकती है ताकि बड़ी संख्या में कृषकों की चिलिंग आवश्यकताओं का अनुमान लगाया जा सके । भविष्य के प्रयासों में विश्वसनीय जैविक संकेतकों का अध्ययन करने पर ध्यान केंद्रित करना होगा जो पेड़ की निद्रा स्थिति का आसानी से संकेत दे सकते हैं । इस बीच, निद्रा के दौरान स्टार्च विविधताओं के पैटर्न आगे शारीरिक और आनुवंशिक अध्ययन फ्रेम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और यहाँ वर्णित छवि विश्लेषण के साथ ऊतक-रसायन तकनीकों के संयोजन अन्य वुडी बारहमासी फसलों में इस्तेमाल किया जा सकता निद्रा के संबंध में विभिन्न ऊतकों की स्टार्च सामग्री का परिमाण निर्धारित करना.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों कृतज्ञता उनके मददगार चर्चा और सलाह के लिए धंयवाद मारिया Herrero और एलिएसईओ Rivas । इस काम के द्वारा समर्थित किया गया Ministerio डी Economía वाई Competitividad — यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि, यूरोपीय संघ [अनुदान संख्या BES-2010-037992 को ई. एफ.]; Instituto Nacional डी जांच Ación y Tecnología अग्रिया y Alimentaria [अनुदान संख्या RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; और गोबियरनो डी Aragón-यूरोपीय सामाजिक कोष, यूरोपीय संघ [Grupo () A12-17R ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Precision scale Sartorius CP225D
Stereoscopic microscope Leica Microsystems MZ-16
Drying-stove Memmert U15
Paraffin Embedding station Leica Microsystems EG1140H
Rotatory microtome Reichert-Jung 1130/Biocut
Microtome blade Feather S35 Stainless steel
Bright field microscope Leica Microsystems DM2500
Digital Camera Leica Microsystems DC-300
Image Analysis System Leica Microsystems Quantiment Q550

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक १४५ सर्द आवश्यकताओं फूल कलियों आयोडीन आधारित धुंधला करना माइक्रोस्कोपी पैराफिन मोम समावेशन Prunus एवियम भंडार शूट मीठी चेरी
सर्दियों निद्रा के दौरान मीठी चेरी के अंडाशय Primordia में स्टार्च Quantify करने के लिए Histochemical धुंधला और छवि विश्लेषण का मेल
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Fadon, E., Rodrigo, J. Combining… More

Fadon, E., Rodrigo, J. Combining Histochemical Staining and Image Analysis to Quantify Starch in the Ovary Primordia of Sweet Cherry during Winter Dormancy. J. Vis. Exp. (145), e58524, doi:10.3791/58524 (2019).

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