Summary
אנו מציגים מתודולוגיה לכמת את תכולת עמילן primordia שחלה בדובדבן מתוק (שקד avium ל') במהלך החורף תרדמה באמצעות מערכת ניתוח תמונה בשילוב עם טכניקות מעבדה הומנית.
Abstract
שינויים עמילן במבנים קטנים הם קשורים אירועי מפתח במהלך מספר תהליכים פיתוחיים צמח, כולל השלב הרבייה של האבקה הפריה, תחילת fruiting. עם זאת, בווריאציות עמילן במהלך התמיינות פרח לא לגמרי ידועים, בעיקר בשל הקושי לכמת את תכולת עמילן המבנים קטן במיוחד של primordia הפרחים. כאן, אנו מתארים שיטה כימות של עמילן ב primordia השחלה של דובדבן מתוק (שקד avium ל') באמצעות מערכת ניתוח התמונה המצורפת המיקרוסקופ, אשר מאפשר הנוגעות לשינויים בתוכן עמילן עם השלבים השונים של תרדמה האביב. למטרה זו, המצב תרדמה של ניצני פרחים נקבעת לפי הערכת את הצמיחה ניצן של נצרי הועבר תנאים מבוקרים ברגעים שונים בזמן חורף. עבור כימות של עמילן ב primordia השחלה, ניצני פרחים ברצף שנאספו, קבוע, המוטבעות פרפין, למחלקה, מוכתם אני2Kl (אשלגן יודיד-יוד). ההכנות שנצפו תחת המיקרוסקופ, נותחו על ידי מנתח התמונה בבירור שיבדיל עמילן מהרקע. ערכי תוכן עמילן מתקבלים על ידי מדידת צפיפות אופטית של התמונה התואם העמילן מוכתם, בהתחשב סכום הצפיפות האופטית של כל פיקסל כמו אומדן של עמילן תוכן של מסגרת למד.
Introduction
צמחים רב שנתיים וודי ממוזג להסתגל העונות על ידי להתכוונן וההתפתחות שלהם. בעוד הם מפתחים במהלך האביב והקיץ, הם מפסיקים לגדול במהלך הסתיו ללכת רדום בחורף1. למרות תרדמה מאפשר להם לשרוד בטמפרטורות נמוכות בחורף, מצמרר הוא תנאי הכרחי budburst נאות אביב2. ההשלכות חשוב של תרדמה ייצור פירות ממוזג, יערנות הובילו מאמצים מגוונות כדי לקבוע ולחזות את תקופת תרדמה3. במינים עץ פרי, ניסויים אמפיריים העברת נצרי לכפות תנאים ותחזיות סטטיסטי המבוסס על נתונים של פריחה הם לגישות כדי לקבוע את התאריך של שבירת תרדמה, אשר מאפשר לחוקרים להעריך דרישות עבור כל לדבורי מצמרר. עם זאת, כיצד לקבוע את מצב תרדמה המבוססת על תהליכים ביולוגיים נשאר לא ברור3.
פורחים עצי פרי ממוזג, כגון דובדבן מתוק (שקד avium ל'), מתרחש פעם בשנה ונמשך שבועיים לערך. עם זאת, פרחים מתחיל להבדיל ולפתח כ 10 חודשים קודם לכן, במהלך הקיץ הקודם4. פרח primordia מפסיקים לגדול במהלך הסתיו להישאר רדום בתוך הניצנים בחורף. על תקופה זו, כל לדבורי צריך לצבור דרישה מצמררת במיוחד עבור פריחה נאותה4. למרות העדר phenological לשינויים הניצנים בחורף, פרח primordia פעילים מבחינה פיזיולוגית בתקופת תרדמה, ההצטברות של מצמרר טמפרטורות שויכה לאחרונה הדינמיקה של הצטברות עמילן או להקטין בתוך התאים של ראשית השחלה, מציעים גישה חדשה עבור תרדמה נחישות5. עם זאת, גודלו הקטן ואת המיקום של ראשית השחלה דורשים מתודולוגיה מיוחד.
עמילן הוא הפחמימות אחסון מרכזיים וודי צמח מינים6. לפיכך, שינויים עמילן קשורות לפעילות הפיזיולוגית של הרקמות פרח, אשר זקוקים לפחמימות לתמיכה שלהם פיתוח7,8. אירועים מרכזיים שונים במהלך תהליך הרבייה קשורים גם וריאציות בתוכן עמילן במבנים פרחים שונים, כגון מיוזה בצרכן9, הגידול של הצינורות אבקה דרך סגנון או ביצית הפריה10. טכניקות פתולוגיה לאפשר הגילוי של עמילן ברקמה מסוימת כל של primordia פרח בתקופת תרדמה. עם זאת, הקושי נשאר לכימות הזה עמילן כדי לאפשר בעקבות דפוס שלו הצטברות/ירידה לאורך זמן או השוואת העמילן תוכן בין רקמות, הזנים או שנים. זאת בשל הכמות הקטנה של רקמה זמין עבור שיטות אנליטיות11. כחלופה, ניתוח תמונות מקושר מיקרוסקופ12 מאפשר כימות של העמילן קטנה מאוד דגימות של רקמות הצמח13.
גישות שילוב מיקרוסקופ וניתוח התמונה שימשו כדי לכמת את התוכן של מרכיבים שונים ברקמות הצמח, כגון callose14, microtubes15, או עמילן16, על ידי מדידת הגודל של אזור צבוע על ידי ספציפי כתמים. עבור עמילן, זה ניתן בקלות להבחין באמצעות אשלגן יודיד-יוד (אני2קי) תגובה17. שיטה זו היא מאוד ספציפית; אני2קי intercalates בתוך המבנה למינריות של גרגרי עמילן וצורות כחול או חום-אדמדם בצבע כהה, בהתאם לתוכן עמילוז עמילן18. סעיפים מוכתמים אני2קי הכתם להציג ניגודיות הולמת בין עמילן הרקמה רקע, המאפשר זיהוי עמילן חד-משמעית של כימות עוקבות מערכת ניתוח תמונה19. למרות צבע זו אינה stoichiometric, ההצטברות של יוד הוא יחסי האורך של מולקולת עמילן, אשר יכול להשתנות מאוד17. לפיכך, גודל האזור המוכתם לבטא את מספר הפיקסלים אינן משקפות בהכרח במדויק את תכולת עמילן, מאז ההבדלים גבוהה בתוכן עמילן יכול להימצא בין שדות עם האזורים המוכתמים גודל דומה. כחלופה, תכולת עמילן יכול להיות מוערך על ידי מדידת צפיפות אופטית גרגרי מוכתם על תמונות בשחור-לבן המתקבל המיקרוסקופ, כפי שדווח ברקמות שונות משמש8,13 , 19, אבוקדו10,20וזית21.
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת הקביעה ניסיוני של תרדמה מצב עם כימות של עמילן בתוכן רקמת השחלה ראשית האביב, דובדבן מתוק, ומציע כלי חדש הבנה, חיזוי של תרדמה המבוסס על חקר המנגנונים הביולוגיים קשורות תרדמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרדמה נחישות ואיסוף חומרים צמח
- לטעום את ניצני פרחים בשדה. תרדמה מחקרים ניסויים ארוכי טווח, דרוש מבוגר עצים גדול מספיק כדי לאסוף את ניצנים ויורה כל החורף מבלי להתפשר על התפתחות העצים במהלך האביב הבא. בניהול הפרדס מיוחד יכול להידרש, בהתאם מערכת הדרכה; לפיכך, גיזום עשוי להיות חמור פחות מאשר למטרות ייצור פירות.
- בכל שבוע, מתחילת הסתיו ועד תחילת חופשת באד, לאסוף, שוקלת 10 פרוח ניצנים.
- לתקן את ניצני פרחים על-ידי הצבתם לתוך צינור זכוכית 10-mL עם כובע ומשרים את הדגימות בפתרון לשבועיים של חומצה אצטית/אתנול (3:1) לפחות 24 שעות-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, למחוק את מקבע ולהוסיף 75% אתנול, בנדיבות להבטיח שזה מכסה את הדגימות. יכול להיות שמור את הדגימות בפתרון זה ב 4 ° C עד השימוש.
הערה: חדירת אבק יכול לשמש כדי להסיר בועות אוויר בתוך הניצן ולמנוע מהם צף. זה מקל על החדירה של מקבע לרקמות אך עלול לגרום נזק מבנה הרקמות. תנסה להמנע מזה אם לא הכרחי.
- לטעום את נצרי בשטח.
- בכל שבוע, מתחילת הסתיו ועד תחילת חופשת באד, לקחת שלושה נצרי של 15-30 ס"מ אורך ו 5 מ מ קוטר, המכיל לפחות 10 ניצני פרחים, כל. מניחים אותם על פרחים ספוגי מים קצף בתוך תא הצמיחה ב 22 ± 1 ° C עם photoperiod אור 12 שעות.
- לאחר 10 ימים בבית הבליעה צמיחה, לבחור, שוקלת 10 פרוח ניצנים של נצרי.
- להעריך את הצמיחה ניצן, לקבוע את מצב תרדמה. תקופת הדגימה חייב להיות מותאם לתנאים של המיקום. בתנאים הפרדס (סרגוסה, ספרד, 41 ° 44'30 "N 0 ° 47'00" W ו- 220 מ' מעל פני הים), הדוגמאות של נצרי בוצע מתוך 30 נובמבר עד סוף פברואר או תחילת מרץ.
- מדי שבוע להעריך את התגובה של פקעי לתנאי גידול מתאימים לחדר, מתחילת הסתיו ועד budburst באביב, מהשוואת המשקל של ניצנים 10 בחרה מהשדה.
- אם אין הבדלים או הבדלים אלה הם פחות מ- 30%, שקול הניצנים לא מילאו אחר דרישות מצמררת שלהם והם endodormant22. אם ההבדלים הם יותר מ 30%, שקול הניצנים כבר מילאת את דרישות מצמררת שלהם והם ecodormant22.
2. הצמח הכנה גשמי על כימות עמילן
- בחר ניצנים קבוע בערך שש מן הדגימה כל תאריך (ראה שלב 1.1). תלוי הזנים, כל פרוח ניצן הדובדבן המתוקות מכיל עד חמישה פרחים primordia.
- להסיר את הקשקשים החיצוניים באד ומניחים את הניצן על הזכוכית של שען עם 75% אתנול כדי למנוע את זה ממנו להתייבש.
- לנתח את הניצן ולחלץ ראשית פרח אחד לפחות לכל ניצן עם העזרה של דיוק מלקחיים ואזמל ophthalmologic תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. ראשית פרח יכול להיות שמור שפופרת זכוכית 10-mL עם 75% אתנול ב 4 ° C, או פנה/י מיד לשלב הבא.
- מייבשים את הדגימות בסדרה אלכוהול בוטיל שלישוני.
- החלף את הפתרון אתנול 75% 10 מ"ל של 75% אלכוהול בוטיל שלישוני (יפורסם בהמשך) בנדיבות לכסות את הדגימות ואת תקופת דגירה אותם של 1.5 h. פיפטה פסטר יכול להיות שימושי למחוק את הפתרון.
- חזור על שלב 2.2.1, הוספת תאריך יפורסם עם ריכוזים העולה (85%-95%, 100%, וי/v; ו- 3 x עם יפורסם טהור) לתוך תנור ייבוש ב 30 ° C עם אוויר החילוץ, מאז יפורסם טהור crystalizes בטמפרטורת החדר (< 20 ° C), הוא תנודתי מאוד רעילים. אם יפורסם crystalizes עם הדגימה, זה היה פוגע ברקמות.
- להטביע את הדגימות פרפין18.
- ממיסים הפרפין תציגו את הפנינים פרפין בתנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס עם שאיבת אוויר ביום הקודם. הפנינים פרפין ניתן להמיס גם על גזייה, אך ודא פרפין נוזלי ב 60 מעלות צלזיוס ולא על טמפרטורה גבוהה יותר, כדי למנוע נזק לרקמות.
- להחליף את יפורסם עם שילוב של יפורסם ושמן פרפין (1:1), תקופת דגירה של 24 שעות בתוך תנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להחליף את התמהיל של יפורסם, שמן פראפין עם טהור ממיסים פראפין, תקופת דגירה של פחות 6 שעות בתוך תנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס. לחזור על זה 2 x דגירה השינוי האחרון לפחות 4-6 יח.
- במקום כל דגימה על תבנית בסיס מתכת קטן מעל משטח חום, מוטבע פרפין, ועל קצב בקלטת ההטבעה. . שימו אותה על משטח קר, להסיר את החסימה לאחר השעווה פני השטח למוצק.
- סעיף, נתרענן ההכנות.
- הכינו דבק של האפט: להמיס 1 גר' ג'לטין נוקס רגיל ב- 100 מ של מים מזוקקים ב 30 מעלות צלזיוס; לאחר מכן, להוסיף 2 g של פנול גבישי חופשי (או56H. C) ו-15 מיליליטר גליצרול. מורחים דבק של האפט על שקופית מזכוכית עם מברשת, להוסיף טיפה של פתרון פורמלדהיד ' 1% '.
- סעיף פרפין כל לחסום-10 מיקרומטר ב מיקרוטום על כל ההזמנות ולמקם את הסעיפים על גבי השקופית זכוכית מכוסה דבק של האפט.
- מיקום בשקופיות זכוכית עם הסעיפים מעל משטח חום ב 35-40 ° C עד יבש; לאחר מכן, להעביר את השקופיות זכוכית מתלה שקופיות.
- הכינו את dewax ופתרונות התייבשות. במקום 200 מ של Histoclear השני שלוש מנות צביעת זכוכית, עוד אחד עם Histoclear II:ethanol (1:1, וי/v), סדרות אתנול (100%, 70%, 40%, וי/v), ואת מכונת שטיפת מים מזוקקים הסופי.
- Dewax הסעיפים עם שלושה שוטף, כל 5 דקות, Histoclear II, Histoclear II:ethanol (1:1, וי/v). למקם ארון התקשורת שקופיות בתוך הכלים צביעת זכוכית, המבטיח כי הפתרון מכסה לחלוטין את השקופיות,,, מעבר המתלה שקופיות של פתרון אחד לשני.
- נתרענן הסעיפים לפי הסדרה הבאה ממכוני 2-מין: סדרות אתנול (100%, 70%, 40%, וי/v) ו מכונת שטיפת מים מזוקקים הסופי. לבסוף, יבש בשקופיות זכוכית בטמפרטורת החדר.
- כתם סעיפים18.
- להכין לי כתם קי2: להמיס דור 2 של אשלגן יודיד (KI) ו- 0.2 גר' יוד (אני2) ב- 100 מ של מים מזוקקים. להחיל טיפה של טרי אני2קי מעל section(s) במשך 5 דקות, ואז למחוק את העודפים של כתם ע י קליטת אותו עם נייר סופג. במהירות להמשיך לשלב הבא.
- החל טיפה קטנה של תקשורת הרכבה סינתטי, במקום כוסית כיסוי עליון ולאחר ללחוץ חזק. ברגע שהתקשורת הרכבה מתייבש, להתבונן במיקרוסקופ שדה בהיר עבור הערכה ראשונית של העמילן השחלה.
הערה: השלב זה אינו חובה, למרות קונטרסט טוב יותר בין העמילן ואת הרקע מתקבל. אם המקטע חוזר עם כתמים אחרים לאחר עמילן כמת, הצב את מכסה הזכוכית על הירידה של כתם ולמחוק את העודפים ע י קליטת אותו עם נייר סופג (ראה 2.5.1). לאחר מכן, לאחר כימות עמילן, לשטוף החוצה את2קי כתם עם מים מזוקקים והמקום ההכנות מעל חום פני השטח ב 35-40 ° C עד יבש.
3. כימות של תכולת עמילן
- כיילו את התנאים אופטי.
הערה: רמות איתור המשמשים במנתח התמונה כדי לזהות את העמילן מוכתם תלויים ישירות לתנאי תאורה ואת ההגדלה של המיקרוסקופ; לפיכך, לתקן תנאים אלה עבור כל ההכנות מוערכים. להתאים את ההתאמה הציע כאן המיקרוסקופ הזמינים ואת לתנאי תאורה.- התאם את הסרעפת צמצם בקו ה-20 X ההגדלה ואת בקרת הבהירות או עוצמת אור.
- ודא כי ישנם אין מסננים את המחזיק מסנן ולאחר בחר תנאי שדה בהיר במיקרוסקופ. בחר הגדלה מתאימה (למשל, 40 X עבור הדובדבן המתוקות השחלה ראשית).
- בקרת תנאי רכישת התמונה. התאם את הגדרות המצלמה עם הכנה מוכתם ללא רקמה באמצעות תמונה | רכישה | נוף קדם.
- לתקן את הבהירות ב-50%, הרווח ב- 1.0 x ו האינדיקטורים היסטוגרמה הגאמא לערך 1.00, הניגוד-0 - 100, להתיישר עם המגבלות של ההיסטוגרמה הפצה בהירות.
- להפעיל את הפונקציה חשיפת יתר/מצילום ולהתאים את זמן החשיפה על גבול חשיפת יתר.
- להחיל את הפונקציה איזון לבן על התמונה המלאה כדי להציג את כל הרכיבים בצבע נייטרלי של התמונה ללא שום נימה צבע ותיקון הצללה על התמונה המלאה כדי ליצור תמונה מתוקנת ולא הומוגנית.
- כיילו את מערכת ניתוח התמונה כדי להשיג את ערכי בקרה של רמת האפור (0, שחור; 255, לבן) של צפיפויות אופטיים שונים (OD) שמושגות על-ידי הערכים להדמיה (T).
- לקבל תמונה של הכנה מוכתם בלי רקמות, נחשב שליטה לבן, וכך למדוד רמת האפור של תמונת שחור-לבן ויה מידה | אפור מידה | לכייל גריי | הפניה ערך = 0 | מדד | לכייל | טוב. זה תואם עם להדמיה 100%; לפיכך, צפיפות אופטית של 0, על-פי יתר = 2 - כניסה טי
- רוכשים תמונה של הכנת אותו עם מסנן 4N, אשר מפחית את כמות האור 4 x ומדד רמת האפור של תמונת שחור-לבן ויה מידה | אפור מידה | לכייל גריי | הפניה ערך = 0.6 | מדד | לכייל | טוב. זה תואם עם להדמיה 25%; לפיכך, צפיפות אופטית של 0.6, על-פי יתר = 2 - כניסה טי
- רוכשים תמונה של הכנת אותו בלי אור, נחשב שחור, וכך למדוד רמת האפור של תמונת שחור-לבן ויה מידה | אפור מידה | לכייל גריי | הפניה ערך = 1 | מדד | לכייל | טוב. זה תואם עם להדמיה 0%; לפיכך, צפיפות אופטית של 1, על-פי יתר = 2 - כניסה טי
- לזהות עמילן.
- רוכשים תמונה צבעונית של השדה כדי למדוד את הקובץ בתבנית TIFF ברזולוציה לפחות 300 נקודות לאינץ ' (dpi).
- ליצור תמונה בינארית המתאים לאזור צבעונית. להגדיר את גדלי סף של צבע שלוש (ערכים בין 0 - 255 עבור כל אחד) עד התמונה הבינארית משקף בדיוק את גרגרי עמילן מוכתם שנצפו, דרך תמונה | זיהוי | בחר את הסף של אדום, כחול וירוק | טוב. השוואות שוב ושוב חזותיים שונים ההכנות ואת רקמות כדי לכוונן את רמות זיהוי גמר. לאחסן ולהשתמש רמות אלה עבור כל ההכנות.
- לכמת את העמילן. להמיר את התמונה המקורית של צבע תמונה שחור-לבן עם מערכת ניתוח התמונה. להשתמש בתמונה בינאריים כמו מסכה-גבי על תמונת שחור-לבן ויה תמונה | בינארי ערוך. למדוד את סכום הצפיפות האופטית של כל פיקסל תחת המסכה באמצעות מידה | גריי רמת | טוב ולשקול ערך זה כתוכן עמילן בשטח נמדד.
- חזור על שלבים 3.4.1 - 3.4.3 בארבעה מקומות השחלה primordia כדי לקבל ערך נציג של התוכן עמילן בשחלה של פרח primordia.
- חזור על שלבים 3.4.1 - 3.4.3. וצעד ' ר 3.4.5 בפרחים שונים של כל תאריך איסוף
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרדמה מחקרים דורשות קביעת רגע מתי התקיימו הדרישות מצמררת. למרות העדר phenological שינויים במהלך החורף בתנאים שדה (איור 1 א'), עצי הדובדבן משחזר את הקיבולת של גדילה בתנאים מתאימים עד שהם עוברים תקופה מסוימת תחת בטמפרטורות נמוכות. ההעברה הרגילה של נצרי לתא תנאים מבוקרים (איור 1B) בתקופת החורף מותר הערכת מצב תרדמה פקעי. ההערכה של הגידול וניצן נעשה על ידי מדידת עליית ניצן משקל. בזמן, בתקופת תרדמה, אין שינויים יכול להיות שנצפו לאחר 10 ימים בתנאים נאותים (איור 1C), ברגע תרדמה הוכרע, הניצנים התנפחו, פרץ בבית הבליעה צמיחה (איור 1D). התוצאות של ניתוח זה מותר המצב תרדמה של ניצנים שתוקם. בשל הטמפרטורות שונים המתרחשים במהלך החורף, תרדמה היה להתגבר על תאריכים שונים, בהתאם לשנה. אמנם, במהלך השנה הראשונה של המחקר, שבירת תרדמה אירעה בחודש ינואר השנה השניה הציג חורף מתון יותר; לפיכך, התגשמות מצמררת אירעה כשלושה שבועות לאחר מכן, בחודש פברואר.
דובדבן מתוק נושא ניצני פרחים ב דורבנות, איפה הפסגה ניצן ניצן וגטטיבי, ניצנים לרוחב הם ניצני פרחים (איור 1C וד' 1). ניצנים מובחן התחיל להתמיין פרח או ניצנים צמח בסוף הקיץ, אך כאשר הם נכנסים תרדמה בזמן החורף, primordia פרח מספר להישאר בתוך הניצן, מוגן על ידי קשקשים ירוקים רבים, מכוסה קשקשים החיצוני חום ( איור 1C ו איור 2A). ניתוח ניצן הפרח הראה את primordia פרח קטן בתוך (איור 2 א). כל וניצן הכיל אחד עד חמישה פרחים בודדים primordia (איור 2B). למרות גודלו הקטן של ראשית כל פרח, כל החלקים של פרח מובחנים, יכול להיות מכובד: העלי, את פורים, עלי כותרת, עלי גביע (איור 2C). השימוש בטכניקות פתולוגיה (אלכוהול: קיבוע [3:1] אצטית פרפין הטבעה, מיקרוטום חלוקתה, עמילן יוד מבוססי מכתים) אפשרה ההפצה של העמילן בתוך הפרח ראשית רקמות שחלים (איור דו-ממדי ).
עמילן בראשית השחלה הייתה לכמת בכל מקטע. ארבעת קבין של 1337 µm2, 40 x הגדלה, ייצג את הפריסה הכללית של עמילן ב ראשית השחלה דובדבן מתוק (איור 3 א). גרגרי עמילן היו בבירור להבחין בין הרקע אחרי2קי מכתים (איור 3B). העמילן זוהה על ידי מערכת ניתוח התמונה, על-ידי התאמת הצבע סף של אדום, ירוק וכחול עד שנצפה כל גרגרי עמילן כוסו על ידי התמונה הבינארית שנוצרו על ידי המערכת מבוסס על הפרמטרים שהוגדרו צבע (איור 3C). הערכים של עמילן תוכן שהושג היו התוצאה של מידת הצפיפות האופטית של כל פיקסל תחת המסכה על התמונה בשחור-לבן (דמות תלת-ממד).
כימות של עמילן גילה דפוס עקבי של עמילן דינמי במהלך החורף (איור 4). באופן עקבי, כמות עמילן בחורף המוקדם הציג ערך צפיפות אופטית של פחות מ-40,0003, ואילו הסכום המרבי הגיעו ערך בין 120,000 ל- 140,000 שתי שנים. הערך המרבי היה להגיע בינואר במהלך השנה הראשונה (איור 4A), הוא התרחש בחודש פברואר בשנה השניה (איור 4B). מנוגדים אלה תוצאות עם עור תרדמה, הכמות המרבית של עמילן אירע/ת עם הגשמת מצמררת בשנים בשני.
גישה זו דורשת הקביעה של מצב תרדמה (איור 5A) יחד עם עמילן כימות על רקמת השחלה (איור 5B) כדי להפליל את השינויים בתוכן עמילן ביחס תרדמה.
איור 1: הגדרת ניסיונית לקביעת מצב תרדמה ניצני פרחים של דובדבן מתוק- (א) ענפים, במהלך החורף, להראות ניצנים רדומים סגור, מכוסה קשקשים חום כהה. (B) לוח זה מציג יורה להעביר אל התא צמיחה. באמצע ינואר, כמה הזנים נותר רדום עם הניצנים עדיין סגור (חץ לבן), בעוד אחרים היו מסוגלים לגדול, מציג המנופח ניצנים (חץ שחור). (C) לוח זה מציג פרטים של יורה עם ניצני פרחים רדום ממוקם רוחבית וניצן צמח יחיד הממוקם במיקום הפסגה בדחף. (D) לוח זה מציג פרטים של יורה ברגע תרדמה הוכרע לאחר 10 ימים בבית הבליעה הולך וגדל, מציג באד נפיחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: לשתול חומרים לקראת עמילן כמת. (א) לוח זה מראה קטע חציה של ניצן של פרח, מציג פרח שני primordia (fp) מוגן על ידי קשקשים רבים (sc). (B) שלושה פרחים primordia (fp) לאסוף ב ניצן של פרח. (ג) לוח זה מציג קטע חציה של ראשית פרח, עם כל המעגלים הבדיל: עלי גביע (se), עלי כותרת (pe), פורים (an), העלי (pi). ראשית השחלה היא נבדלת בבסיס של העלי (חץ). (ד) A האמצעי של ראשית פרח היה אסף קבוע בחודש ינואר, המוטבעות פרפין, למחלקה ואני מוכתם אני2קי (חום כהה) עבור עמילן. לוח זה מראה את ראשית השחלה (חץ). פסי סולם מיקרומטר 500 ב לוחות A ו- B הינם מיקרומטר 200 פאנלים C ו- D. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: עמילן כמת ב ראשית השחלה הדובדבן המתוקות. (א) לוח זה מציג חלק האמצעי ראשית השחלה מוכתם אני2קי, המציגה את ארבע מסגרות תוכן עמילן אשר נמדדה. (B) לוח זה מציג פרטים של ראשית השחלה. גרגרי עמילן מוכתמים בחום כהה. (ג) לוח זה מראה תמונה מדומה של עמילן אשר מקביל גוונים שונים של כחול. (ד) לוח זה מראה מסכה תמונה בינארי המכסים אני2שהוכתמו קי עמילן (כחול) על התמונה המקורית בשחור-לבן. הצפיפות האופטית נמדד רק הפיקסלים של התמונה המקורית מכוסה על-ידי המסכה. פסי בקנה מידה 100 מיקרומטר בלוח א הינם 20 מיקרומטר פאנלים B - D. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: התוצאות נציג של כימות עמילן ב primordia השחלה הדובדבן המתוקות שנאסף חודשי הסתיו לאביב במהלך שתי שנות בתנאי טמפרטורת חורף שונות. מראה (A) בלוח זה התוצאות של השנים 2010-2011, אשר היה חורף קר. התגשמות מצמררת (פתית שלג) אירעה בחודש ינואר, יחד עם הכמות המרבית של עמילן. (B) לוח זה מראה את התוצאות מן השנים 2011-2012, אשר היה חורף מתון. התגשמות מצמררת (פתית שלג) אירעה בחודש פברואר, יחד עם הכמות המרבית של עמילן. הערכים הם זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ערכה של עיצוב ניסיוני כדי להעריך את מצב תרדמה של ניצנים, כימות עמילן ב primordia השחלה בדובדבן מתוק- (א) לוח זה מראה את זרימות העבודה של קביעת מצב תרדמה: הכנת חומרים צמח, התהליך, התוצאות המתקבלות. (B) לוח זה מראה את זרימות העבודה של כימות עמילן: ההכנות פתולוגיה של הניצנים תצפית מיקרוסקופית של העמילן, ניתוח תמונת זיהוי עמילן, עמילן כימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תרדמה של וודי למלחמת ששת הימים מציג השלכות ברורות בייצור פירות, יערנות באקלים שינוי, למרות תהליך ביולוגי מאחורי תרדמה עדיין לא ברור. תרדמה מחקרים ניתן לצפות דרך נקודות מבט שונות, אך המחקר מחפש סמן ביולוגי החורף תרדמה החריפה בשנים האחרונות. עם זאת, רוב ניסיונות למצוא את מחוון חד-משמעית מראה מתי ניצן שבור תרדמה כבר נכשלת3. המתודולוגיה המתוארים בזאת, שילוב טכניקות פתולוגיה18 עם ניתוח התמונה, היה מאוד שימושי כדי לבדוק את היחסים בין פחמימות עתודות של רקמה מיוחדת ופעילות פיזיולוגית שלה הדובדבן המתוקות ניצנים במהלך השלבים השונים של תרדמה5 וניתן להחילם גם על שאר המינים ורקמות10,13,20.
מאגרי פחמימות בצורה של עמילן לשחק תפקיד חשוב הן פיתוח פרח והן את תהליך הרבייה7,10,13,20,21,23 , ב- seasonality של צמחים רב שנתיים וודי ממוזג6. מחקרים שונים על תרדמה לשלם תשומת לב העמילן בתוך ניצנים24. עם זאת, בשל גודלם הקטן, מספר ניצנים כולו נדרשים עבור השימוש בשיטות אנליטיות כמותיים ולאחר הגילוי של וריאציות כמותית של רקמות מסוים או תאים הוא מוגבל על ידי השפעת מיסוך התאים המקיפים אותם. השילוב של טכניקות מעבדה הומנית עם מערכת ניתוח התמונה מציע הזדמנות טובה ללמוד שינויים בתוכן עמילן של מבנים שונים בתוך הניצן.
בשיטה זו יש המגבלה של מניעת כימות של התוכן המדויק של עמילן ברקמה אך מאפשר תכולת עמילן יחסית ניתן לכמת לעקוב אחר שינויים כמותיים עמילן זמן25 ומעלה, כדי להשוות את העמילן תוכן של ברקמות שונות13,20, הזנים או שנה5. על מנת לאפשר את ההשוואה הנכונה של הערכים של צפיפות אופטית בין שדות, רקמות, ניצנים, הכיול של המערכת (לתנאי תאורה מכתימים בעוצמה, הגדלה) ואת ההגדרה של צבע ספי חייבת להווצר במדויק , המאוחסנים ונעשה שימוש עבור כל ההכנות.
עמילן מכתים, כימות המבוסס על יוד האשלגן מאפשר שימוש עוקבות אחר כתמי לאחר השטיפה של המקטע. לפיכך, ניתן לבצע ניתוחים שונים בלי תכשירים נוספים, הרכבה סינתטי המדיה אינם בשימוש5,20. באופן דומה, ניתן לבצע מדידות morphometric26 לאחר ההכנות אותו, ומאפשר את התבנית של עמילן הצטברות למסגור ביחס הצמיחה של מבנים שונים5,13. ניתן להתאים את שיטת מבנים או מינים עם ההתאמה של רמות צבע להשתמש במנתח כדי לזהות את העמילן, אשר יכול לאפשר חקר תהליכים התפתחותיים אחרים המערבים שינויים בתוכן עמילן בקבוצות קטנות של תאים אחרים.
מערכת היחסים בין שחרור תרדמה עמילן ההצטברות primordia השחלה חשפה את השימוש בשיטה זו מספק בסיס קול כדי להבין את הבסיס הביולוגי של תרדמה, דרישות מצמרר5. עם זאת, עמילן כמת על ידי ניתוח תמונות במקטעי פרפין-מוטבע יכול להתברר מאוד מסורבלת ולדרוש זמן רב להעריך את הדרישות מצמררת של מספר גדול של הזנים. המאמצים העתידיים צריך להיות ממוקד על לימוד אינדיקטורים ביולוגיים אמין זה יכול בקלות מציינים את מצב תרדמה של העץ. בינתיים, הדפוס של עמילן וריאציות בתקופת תרדמה יכולה לשמש מסגרת נוספת מחקרים פיזיולוגיים ותעשיה, השילוב של טכניקות מעבדה הומנית עם ניתוח תמונות המתוארים בזאת יכול לשמש בגידולים אחרים רב-שנתי וודי כדי לכמת את תכולת עמילן ברקמות שונות ביחס תרדמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים בתודה מריה Herrero, Eliseo ריבאס על דיון מועיל ועצות שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי y Ministerio דה Economía Competitividad — קרן פיתוח אזוריים אירופה, האיחוד האירופי [מספר גרנט ולבס-2010-037992 ל פ א]; y אינסטיטוטו נאסיונאל דה Investigación Tecnología Agraria y Alimentaria [גרנט מספרים RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; ארמון דה שמאייש — קרן חברתית אירופה, האיחוד האירופי [Grupo Consolidado A12-17R].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
References
- Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae. Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).
- Rohde, A., Bhalerao, R. P.
- Fadón, E., Rodrigo, J. Unveiling winter dormancy through empirical experiments. Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).
- Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.). Trees - Structure and Function. , In Press (2018).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry. Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).
- Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots. HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiology. , (2016).
- Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca). Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).
- Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana). PLoS One. 8 (10), e78467 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Quantification of starch in plant tissues. Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Rodrigo, J., Herrero, M. Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.). Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).
- Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), (2012).
- Faulkner, C., et al. An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants. Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).
- Kuhn, B. F. Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. "Stevnsbaer.". European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).
- Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGraw-Hill. New York, NY. (1940).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York, NY. (1999).
- Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system. Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana). Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).
- Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering. Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).
- Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy - Physiological terminology and classification for dormancy research. HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques. Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).
- Kaufmann, H., Blanke, M. Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry. Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).
- Herrero, M., Dickinson, H. G. Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses. Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
