Summary
Vi presenterar en metodik för att kvantifiera hur mycket stärkelse i de äggstock primordia i sötkörsbär (Prunus avium L.) under vintern dvala med hjälp av en bild analyssystem kombinerat med histochemical metoder.
Abstract
Förändringar i stärkelse i små strukturer är associerade med viktiga händelser under flera växt-utvecklingsprocesser, inklusive den reproduktiva fasen från pollinering befruktning och uppkomsten av bära frukt. Dock är variationer i stärkelse under blomma differentiering inte helt kända, främst på grund av svårigheten att kvantifiera hur mycket stärkelse i de blomma primordia särskilt små strukturer. Här, beskriver vi en metod för kvantifiering av stärkelse i de äggstock primordia av sötkörsbär (Prunus avium L.) genom att använda en bild analyssystem kopplade till mikroskopet, som tillåter avseende förändringar i stärkelseinnehåll med olika faser i dvala från höst till vår. För detta ändamål bestäms dvala status av blomknoppar genom att utvärdera bud tillväxt av skott som överförts till kontrollerade förhållanden vid olika tidpunkter i vintertid. För kvantifiering av stärkelse i de äggstock primordia, blomknoppar är sekventiellt samlas in, fast, inbäddade i paraffin vax, sektioneras och fläckade jag2Kl (kaliumjodid-jod). Preparat är observerade under mikroskopet och analyseras av en bild-analysator som tydligt skiljer stärkelse från bakgrunden. Stärkelse innehåll värden erhålls genom att mäta den optiska densiteten av bilden som motsvarar den färgade stärkelsen, med tanke på summan av varje pixel optiska densitet som en uppskattning av stärkelse av ramen studerade.
Introduction
Tempererade vedartade perenner anpassas till årstiderna genom att modulera deras tillväxt och utveckling. Medan de utvecklas under våren och sommaren, slutar de växa under hösten att gå vilande i vinter1. Även om dvala tillåter dem att överleva på låga vintertemperaturer, är kylning en förutsättning för en korrekt budburst i spring2. De viktiga konsekvenserna av dvala i tempererade fruktproduktion och skogsbruk har lett till olika insatser att avgöra och förutsäga den dvala period3. I frukt trädslag, empiriska experiment överföra skott till tvingar villkor och statistiska prognoser baserade på data av blomning är nuvarande metoder att bestämma datum för brytande av dvala, som tillåter forskare att uppskatta den kylning kraven för varje sort. Hur man bestämmer dvala status baserat på biologiska processer är dock fortfarande oklart3.
Blommande i tempererade fruktträd, såsom sötkörsbär (Prunus avium L.), inträffar en gång per år och varar ungefär två veckor. Men börja blommorna differentiera och utveckla ca 10 månader tidigare, under den föregående sommar4. Blomma primordia slutar växa under hösten för att förbli vilande inuti knopparna under vintern. Under denna period måste varje sort att ackumulera en viss kylning kravet för korrekt blommande4. Trots avsaknaden av fenologiska förändringar i knopparna under vintern, blomma primordia är fysiologiskt aktiva under dvala, och ansamling av kylning temperaturer nyligen har associerats med dynamiskt stärkelse ackumulation eller minska i cellerna i den äggstock primordium, erbjuder en ny strategi för dvala bestämning5. Men kräver den lilla storleken och placeringen av den äggstock primordium en speciell metodik.
Stärkelse är den stora lagring kolhydrat i woody växt arter6. Således, förändringar i stärkelse har anknytning till den fysiologiska aktiviteten av blomma vävnader, som behöver kolhydrater att stödja deras utveckling7,8. Olika viktiga händelser under den reproduktiva processen relateras också till variationer i stärkelse i olika blommiga strukturer, såsom anther meios9, tillväxten av pollen rören genom den stil eller fröämnet befruktning10. Histochemical metoder Tillåt påvisande av stärkelse i varje särskild vävnad av de blomma primordia under dvala. Svårigheten är dock fortfarande kvantifiera den stärkelsen att tillåta efter sitt mönster av ackumulering/minskning över tid eller jämföra stärkelsen innehåll bland vävnader, sorter eller år. Detta beror på den lilla mängden vävnad tillgänglig för analytiska tekniker11. Som ett alternativ tillåter bildanalys kopplat till mikroskopi12 kvantifiering av stärkelsen i mycket små prover av växt vävnaden13.
Strategier som kombinerar Mikroskopi och bildanalys har använts för att kvantifiera innehållet i olika komponenter i växt vävnader, såsom callose14, mikrorör15, eller stärkelse16, genom att mäta storleken på det område som färgats av specifika fläckar. För stärkelse, det kan lätt påvisas med hjälp av kaliumjodid-jod (jag2KI) reaktion17. Denna metod är mycket specifika; Jag2KI intercalates inom laminar struktur stärkelse korn och bildar en mörk blå eller rödbrun färg, beroende på amylose innehåll av stärkelse18. Sektioner är fläckade av jag2KI fläcken visar tillräcklig kontrast mellan stärkelse och bakgrunden vävnad, vilket gör att en otvetydig stärkelse upptäckt och efterföljande kvantifieringen av bild analys system19. Även detta färgämne inte är stökiometriska, är ansamling av jod proportionell till längden av stärkelse molekylen, som kan starkt variera17. Således, storleken på det färgade området uttryckt som antalet pixlar kanske inte återspeglar exakt innehållet av stärkelse, eftersom hög skillnader i stärkelseinnehåll kunde hittas mellan fält med färgade områden av liknande storlek. Som ett alternativ, kan stärkelse utvärderas genom att mäta de färgade granulerna på svartvita bilder från mikroskopet, optiska densitet som det har rapporterats i olika vävnader i aprikos8,13 , 19, avokado10,20och oliv21.
Här beskriver vi en metodik som kombinerar experimentell bestämning av dvala status med kvantifiering av stärkelsehalten i äggstocken primordium vävnaden från höst till vår i sweet cherry, erbjuder ett nytt verktyg för förståelse och förutsägelse dvala baserat på studier av de biologiska mekanismerna koppling till dvala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dvala beslutsamhet och Plant Material samling
- Prova blomknoppar i fältet. Dvala studier är långsiktiga experiment och kräver vuxen träd stor nog för att samla knoppar och skjuter hela vintern utan att kompromissa med trädens utveckling under nästa vår. Speciella orchard management kan krävas beroende på utbildningssystemet; beskärning kan således vara mindre allvarliga än för frukt produktion.
- Varje vecka, från början av hösten tills uppkomsten av bud paus, samla in och väga 10 blomknoppar.
- Fixa blomknoppar genom att placera dem i en 10 mL glasrör med en mössa och Blötlägg proverna i ett fixativ lösning av etanol/ättiksyra (3:1) under minst 24 timmar vid 4 ° C. Sedan kassera fixeringsvätskan och lägga till 75% etanol, generöst att säkerställa att det täcker proverna. Proverna kan bevaras i den här lösningen vid 4 ° C fram till användning.
Obs: Vakuum infiltration kan användas för att avlägsna luftbubblor inuti knoppen och förhindra dem från flytande. Detta underlättar genomträngningen av fixeringsvätskan in vävnader men kan skada strukturen i vävnaderna. Försök att undvika det om det inte behövs.
- Prova skott i fältet.
- Varje vecka från början av hösten tills uppkomsten av bud paus, ta tre skott på 15-30 cm i längd och 5 mm i diameter, innehållande minst 10 blomknoppar varje. Placera dem på vatten-indränkt florist skum i en tillväxt kammare vid 22 ± 1 ° C med en 12 h ljus fotoperiod.
- Efter 10 dagar i tillväxt kammaren, plocka och väger 10 blomknoppar från skotten.
- Utvärdera bud tillväxten och fastställa dvala status. Provtagningsperioden måste anpassas till villkoren för platsen. I orchard förhållanden (Zaragoza, Spanien, 41 ° 44 ”30” N, 0 ° 47 ”00” W och 220 m över havet), provtagning av skotten utfördes från 30 November till slutet av februari eller början av mars.
- Varje vecka utvärdera svaret av blomknoppar till lämplig tillväxt villkorar av kammaren, från början av hösten fram budburst på våren, genom att jämföra vikten på 10 knopparna plockas från fältet.
- Om det finns inga skillnader eller dessa skillnader är mindre än 30%, anse att knopparna inte har uppfyllt sin kylning krav och är endodormant22. Om skillnaderna är mer än 30%, anse att knopparna har uppfyllt deras skrämmande krav och är ecodormant22.
2. anläggningen Material förberedelse för stärkelse kvantifiering
- Välj cirka sex fasta knoppar från varje provtagning datum (se steg 1.1). Beroende på sorter innehåller varje sweet cherry blomknopp upp till fem blomma primordia.
- Ta bort externa knopp skalor och placera knopp på en urmakare glas med 75% etanol till hindra den från att torka ut.
- Dissekera knoppen och extrahera minst en blomma primordium per bud med hjälp av precision pincett och en oftalmologiska skalpell i stereoskopisk Mikroskop. Den blomma primordium kan bevaras i en 10 mL glasrör med 75% etanol vid 4 ° C, eller omedelbart gå vidare till nästa steg.
- Torkar ut proverna i en tertiär butylalkohol serie.
- Ersätt 75% etanol lösningen med 10 mL 75% tertiär butylalkohol (TBA) att generöst täcka proverna och inkubera dem i 1,5 h. En Pasteur-pipett kan vara användbart att kassera lösningen.
- Upprepa steg 2.2.1, lägga TBA med stigande koncentrationer (85%, 95% och 100% v/v, och 3 x med ren TBA) i snabbtorkande spis vid 30 ° C med sugkapacitet, sedan ren TBA crystalizes i rumstemperatur (< 20 ° C) och är mycket flyktiga och giftiga. Om TBA crystalizes med provet, skulle det skada vävnaderna.
- Bädda in proverna i paraffin18.
- Smält paraffinet genom att införa paraffin pärlor i snabbtorkande kaminen vid 60 ° C med sugkapacitet föregående dag. Paraffin pärlor också kan smältas på en värmeplatta, men se till att den flytande paraffinen är 60 ° c och inte högre temperatur, att undvika vävnadsskada.
- Ersätta TBA med en blandning av TBA och paraffin olja (1:1) och Inkubera under 24 h släpper snabbtorkande spis i 60 ° C. Sedan, ersätta blandningen av TBA och paraffinolja med ren smält paraffin och inkubera i minst 6 tim inuti snabbtorkande spis i 60 ° C. Upprepa det 2 x och inkubera senaste ändringen för minst 4-6 d.
- Placera varje prov på en liten metall bas mögel över en värme yta, inbäddade i paraffin vax och tempo inbäddning kassett. Placera den över en kall yta och ta bort blocket när vaxet är stelnat.
- Avsnitt och rehydrera förberedelserna.
- Förbereda Haupts lim: lös upp 1 g vanligt Knox gelatin i 100 mL destillerat vatten vid 30 ° C; Lägg sedan till 2 g fenol lösa kristaller (C6H5OH) och 15 mL glycerol. Spridda i Haupt lim över en glasskiva med en pensel och Lägg en droppe av en 1% formaldehydlösning.
- Avsnitt varje paraffin blockera på 10 µm i en roterande mikrotom och placera avsnitten på glasskiva täckt med Haupts självhäftande.
- Placera glas glasen med sektioner över en värme yta på 35-40 ° C tills de är torra; sedan flytta glasskivor till en objektglashållaren.
- Förbered dewax och rehydrering lösningarna. Placera 200 mL Histoclear II i tre glas-färgning rätter, en med Histoclear II:ethanol (1:1, v/v), en etanol-serien (100%, 70%, 40%, v/v), och en slutlig destillerat vatten-tvätt.
- Dewax i avsnitt med tre tvättar, varje 5 min, i Histoclear II och i Histoclear II:ethanol (1:1, v/v). Placera objektglashållaren inuti glas-färgning rätter, att säkerställa att lösningen helt täcker bilderna, och sedan flytta objektglashållaren från en lösning till nästa.
- Rehydrera avsnitten genom följande serie 2-min tvättar: en etanol-serien (100%, 70%, 40%, v/v) och en slutlig destillerat vatten-tvätt. Slutligen torka glas glasen vid rumstemperatur.
- Fläcken avsnitt18.
- Förbereda jag2KI fläcken: lös upp 2 g kaliumjodid (KI) och 0,2 g jod (I2) i 100 mL destillerat vatten. Applicera en droppe av färska jag2KI över avsnitt i 5 min och sedan kassera överskottet av fläcken genom att absorbera det med ett läskpapper. Snabbt vidare till nästa steg.
- Applicera en liten droppe av en syntetisk montering media, placera en liten skyddsglaset på toppen och tryck hårt. När montering media torkar, iaktta i ljusa fält Mikroskop för en preliminär utvärdering av äggstocken stärkelsen.
Obs: Detta steg är inte obligatoriskt, även om en bättre kontrast mellan stärkelse och bakgrunden erhålls. Om avsnittet måste återanvändas med andra fläckar efter stärkelse kvantifiering, placera täckglaset över släpp av fläcken och kassera överskottet av absorbera det med ett läskpapper (se 2.5.1). Sedan, efter stärkelse kvantifiering, tvätta sig I2KI fläcken med destillerat vatten och placera förberedelserna på värme yta på 35-40 ° C tills de är torra.
3. kvantifiering av stärkelse
- Kalibrera de optiska villkor.
Obs: De detektionsnivåer som används i bilden Analyzer för att upptäcka den färgade stärkelsen är direkt beroende av ljusförhållanden och förstoring av Mikroskop; alltså fixa dessa villkor för alla förberedelser utvärderas. Anpassa den justering som föreslås här till tillgängliga mikroskopet och ljusförhållanden.- Justera aperturbländaren på 20 X förstoring och ljusstyrka eller ljusintensitet.
- Kontrollera att det inte finns några filter på filterhållaren och välj en ljus-villkoret i mikroskopet. Välj en lämplig förstoring (t.ex., 40 X för sweet cherry äggstock primordium).
- Styra bild förvärv villkoren. Justera kamerainställningarna med färgade preparat utan vävnad via bild | Förvärv | Pre-View.
- Fixa ljusstyrkan på 50%, vinsten på 1,0 x och histogram indikatorerna gamma värde på 1,00 och kontrasten på 0 - 100, rada upp med gränserna för ljusstyrka distribution histogrammet.
- Aktivera funktionen överexponering/underexponering och justera exponeringstid på gränsen till överexponering.
- Gälla kompletta bilden för att visa alla neutral färg komponenter i bilden utan någon färgton och skuggning korrigeringen till kompletta bilden för att skapa en korrigerad och homogen bild funktionen vitbalans.
- Kalibrera bild analys systemet för att erhålla Kontrollvärdena grå nivån (0, svart; 255, vit) på olika optiska densitet (OD) som erhålls genom värdena som transmittans (T).
- Skaffa sig en bild av ett färgade preparat utan vävnad, anses kontroll vit och mäta grå nivån på den svartvita bild via åtgärd | Grå åtgärd | Kalibrera grå | Referensvärdet = 0 | Åtgärden | Kalibrera | OK. Detta motsvarar med en 100% transmittans; Således, en optisk densitet på 0, enligt OD = 2 - Logga T.
- Skaffa sig en bild av samma preparatet med 4N filter, vilket minskar mängden ljus 4 x, och mäta den grå nivån av den svartvita bild via åtgärd | Grå åtgärd | Kalibrera grå | Referensvärdet = 0,6 | Åtgärden | Kalibrera | OK. Detta motsvarar med en 25% transmittans; Således, en optisk densitet 0,6, enligt OD = 2 - Logga T.
- Skaffa sig en bild av samma preparatet utan ljus, övervägt svart och mäta grå nivån på den svartvita bild via åtgärd | Grå åtgärd | Kalibrera grå | Referensvärdet = 1 | Åtgärden | Kalibrera | OK. Detta motsvarar med en 0% transmittans; Således, en optisk densitet 1, enligt OD = 2 - Logga T.
- Upptäcka stärkelse.
- Förvärva en färgbild av fältet att mäta i TIFF-format med en upplösning på minst 300 punkter per tum (dpi).
- Skapa en binär bild som motsvarar området färgas. Ange de tre färg tröskelvärdena (värden mellan 0 - 255 för varje) tills den binära bilden exakt återspeglar färgade stärkelse granulerna observerade, via bild | Upptäcka | Välj tröskelvärdena i röd, blå och grön | OK. Gör upprepade gånger visuella jämförelser i olika preparat och vävnader att stämma upp de slutliga detektionsnivåer. Lagra och använda dessa nivåer för alla förberedelser.
- Kvantifiera stärkelsen. Konvertera den ursprungliga färgbild till en svartvit bild med bild analyssystem. Använda den binära bilden som en överlagrade mask på svartvit bild via bild | Binär redigera. Mäter summan av varje pixel under den mask via åtgärd optiska densitet | Grå nivå | OK och betrakta detta värde som stärkelse i fältet uppmätta.
- Upprepa steg 3.4.1 - 3.4.3 i fyra platser av de äggstock primordia att få ett representativt värde av stärkelse i äggstockarna på blomma primordia.
- Upprepa steg 3.4.1 - 3.4.3 och steg 3.4.5 i olika blommor av varje samlande datum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dvala studier kräver bestämning av det ögonblick när kylning kraven är uppfyllda. Trots avsaknaden av fenologiska förändringar under vintern under fältmässiga förhållanden (figur 1A) tillfrisknar körsbärsträd inte kapaciteten för tillväxt under lämpliga förhållanden tills de passerar en viss period under låga temperaturer. Den regelbundna överföringen av skott på en avdelning som kontrollerade förhållanden (figur 1B) vintertid får utvärderingen av blomknoppar dvala status. Utvärdering av blomknopp tillväxt skedde genom att mäta ökningen av knopp vikt. Medan, under dvala, inga förändringar kunde observeras efter 10 dagar av lämpliga förhållanden (figur 1 c), när dvala övervanns, knoppar svällde och brast i tillväxt kammaren (figur 1 d). Resultaten av denna analys får statusen dvala av knopparna ska fastställas. På grund av de olika temperaturerna under vintern, övervanns dvala vid olika tidpunkter, beroende på år. Medan, under det första året av studien, att bryta dvala inträffade i januari andra året presenterade en mildare vinter; skrämmande uppfyllandet inträffade således cirka tre veckor efter, i februari.
Sweet cherry björnar blomknoppar i spurs, där den apikala bud är en vegetativ knopp och laterala knopparna är blomknoppar (figur 1 c och 1 D). Odifferentierad knoppar började differentieras till blomma eller vegetativa knoppar i slutet av sommaren, och när de anger dvala vintertid, flera blomma primordia kvar inuti knoppen, skyddas av många gröna skalor och omfattas av brun yttre skalor ( Figur 1 c och figur 2A). Dissektion av blomknopp visade de liten blomma primordia inuti (figur 2A). Varje blomknopp innehöll en till fem enskilda blomma primordia (figur 2B). Trots den lilla storleken på varje blomma primordium, alla delar av en blomma är differentierade och kan särskiljas: pistill, ståndarknappar, kronblad och foderblad (figur 2 c). Att använda histochemical metoder (alkohol: ättiksyra [3:1] fixering, paraffinvax inbäddning, snittning av mikrotomen och jod-baserade stärkelse färgning) tillåten distribution av stärkelsen inom blomman primordium vävnader ska observeras (figur 2D ).
Stärkelse i den äggstock primordium kvantifierades i varje avsnitt. Fyra åtgärder av 1337 µm2, 40 x förstoring, representerade den allmänna layouten för stärkelse i de sweet cherry äggstock primordium (figur 3A). Stärkelse granulat var klart skilja sig från bakgrunden efter jag2KI färgning (figur 3B). Stärkelsen identifierades av bild analys systemet, genom att justera färg trösklar av röda, gröna och blå tills alla stärkelse granulerna observerade omfattades av binära bilden skapas av systemet baserat på parametrarna definierad färg (figur 3 c). Värdena för stärkelseinnehåll erhålls var resultatet av en mäta av den optiska densiteten för varje pixel under masken på den svartvita bilden (figur 3D).
Kvantifiering av stärkelse avslöjade ett konsekvent mönster av stärkelse dynamisk under vintern (figur 4). Konsekvent, presenteras mängden stärkelse i tidig vinter en optisk densitet värde av mindre än 40.0003, medan det maximala beloppet nådde en värdera mellan 120 000 och 140 000 under båda åren. Medan det högsta värdet nåddes i januari under det första året (figur 4A), inträffade den i februari under det andra året (figur 4B). Kontrasterande dessa resultat med hy av dvala, inträffade den maximala mängden stärkelse samtidigt med kylning uppfyllandet under båda åren.
Detta tillvägagångssätt kräver bestämning av dvala status (figur 5A) samtidigt med stärkelse kvantifiering på äggstocken vävnad (figur 5B) för att rama in ändringarna i stärkelse i förhållande till dvala.
Figur 1: Experimental set-up för bestämning av dvala status av blomknoppar av sötkörsbär. (A) grenar, under vintern, Visa vilande knopparna stängd och omfattas av mörk brun skalor. (B) denna panel visar skott överförs till avdelningen i tillväxt. I mitten av januari, vissa sorter som varit vilande med knopparna fortfarande stängd (vit pil), medan andra kunde växa, visar svällning knoppar (svart pil). (C) denna panel visar en detalj av en plåtning med vilande blomknoppar ligger lateralt och en enda vegetativ knopp ligger i apikala position i sporren. (D), denna panel visar en detalj av ett skott när dvala övervanns efter 10 dagar i växande kammaren visar knopp svullnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: plantera material förberedelse för stärkelse kvantifiering. (A) denna panel visar en övergripande del av en blomknopp, visar två blomma primordia (fp) skyddas av ett flertal skalor (sc). (B) tre blomma primordia (fp) samlas i en blomknopp. (C) i denna panel visas en övergripande del av en blomma primordium, med alla virvlar differentierade: foderblad (se), kronblad (pe), ståndarknappar (en) och pistill (pi). Den äggstock primordium kännetecknas vid basen av pistillen (pil). (D), ett mellersta delen av en blomma primordium var samlat och fast i januari, inbäddade i paraffin vax, sektioneras och fläckade jag2KI (Mörkbrun) för stärkelse. I denna panel visas i äggstocken primordium (pil). Skala barerna är 500 µm i paneler A och B och 200 µm i paneler C och D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: stärkelse kvantifiering i sweet cherry äggstock primordium. (A) denna panel visar en mellersta delen av en äggstock primordium fläckade jag2KI, visar de fyra ramarna i vilka stärkelse innehåll mättes. (B) denna panel visar en detalj av den äggstock primordium. Granulatet stärkelse färgas i mörkbrunt. (C), denna panel visar en falsk bild i vilken stärkelse motsvarar olika nyanser av blått. (D), denna panel visar en binär Bildmask som täcker jag2KI-färgade stärkelse (blå) på den svarta och vita ursprungliga bilden. Den optiska densiteten mäts endast i pixlarna i den ursprungliga bilden som omfattas av masken. Skala barerna är 100 µm i panel A och 20 µm i paneler B - D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat av stärkelse kvantifiering i sweet cherry äggstock primordia samlas in månadsvis från hösten till våren under två år av olika temperatur vinterförhållanden. (A) denna panel visar resultaten från åren 2010-2011, som hade en kall vinter. Skrämmande uppfyllandet (snowflake) inträffade i januari, samtidigt med den maximala mängden stärkelse. (B) denna panel visar resultaten från åren 2011-2012, som hade en mild vinter. Skrämmande uppfyllandet (snowflake) inträffade i februari, samtidigt med den maximala mängden stärkelse. Värdena är det medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: system av experimentell design att bedöma statusen dvala av knoppar och stärkelse kvantifiering i de äggstock primordia i sweet cherry. (A) denna panel visar arbetsflöden av dvala status bestämning: växt materiella beredning, processen och resultaten. (B) denna panel visar arbetsflöden av stärkelse kvantifiering: histochemical utarbetandet av knopparna för en mikroskopisk observation av stärkelsen, bild analys påvisning av stärkelse och stärkelse kvantifiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dvala i woody perenner presenterar tydliga konsekvenserna i fruktproduktion och skogsbruk i ett förändrat klimat, även om den biologiska processen bakom dvala oklar. Dvala studier kan behandlas ur olika synvinklar, men forskningen letar du efter en biologisk markör för vintern dvala har intensifierats de senaste åren. De flesta försök att hitta en entydig indikator som visar när en knopp har brutit dvala har dock misslyckade3. De metoder som beskrivs häri, att kombinera histochemical metoder18 med analys bild, har varit mycket användbar för att undersöka sambandet mellan kolhydrat reserver av en viss vävnad och dess fysiologiska aktivitet i sweet cherry knoppar under de olika faserna i dvala5 och kan också användas till andra djurslag och vävnader10,13,20.
Kolhydrat reserver i form av stärkelse spelar en viktig roll både i blomma utveckling och den reproduktiva process7,10,13,20,21,23 och i säsongsvariationer i tempererade vedartade perenner6. Olika studier på dvala ägnat uppmärksamhet åt stärkelsen inom den knoppar24. Dock på grund av sin storlek, flera hela knoppar krävs för användning av kvantitativa analysmetoder, och påvisande av kvantitativa variationer i specifika vävnader eller celler begränsas av maskering effekten av omgivande celler. Kombinationen av histochemical metoder med bild analyssystem erbjuder en bra möjlighet att studera förändringar i stärkelse av olika strukturer inuti knoppen.
Denna metod har begränsning förhindra kvantifiering av det exakta innehållet av stärkelse i vävnaden men tillåter relativa stärkelse att kvantifieras att följa kvantitativa stärkelse förändringar över tid25 och jämföra stärkelsen innehåll olika vävnader13,20sorter, eller år5. För att möjliggöra korrekt jämförelse av värdena för optisk densitet mellan fält, vävnader och knoppar, kalibrering av systemet (ljusförhållanden, färgning intensitet och förstoring) och inställningen av färg tröskelvärden måste fastställas exakt , lagras och används för alla förberedelser.
Stärkelse färgning och kvantifiering baserat på kalium jod tillåter efterföljande användning av andra fläckar efter tvättning av avsnittet. Således olika analyser kan utföras utan ytterligare preparat och syntetiska montering media inte är används5,20. Jämväl, morfometriska mätningar26 kan göras efter de samma förberedelser, så att mönstret av stärkelse ackumulering att utformas i förhållande till tillväxten av olika strukturer5,13. Metoden kan anpassas till andra strukturer eller arter med justeringen av färgnivåer som använder analyzer för att upptäcka den stärkelse, som kan tillåta att studera andra utvecklingsprocesser som omfattar ändringar i stärkelseinnehåll i små grupper av celler.
Förhållandet mellan dvala release och stärkelse ackumulering i de äggstock primordia Avtäcka genom användning av denna metod ger en god grund för att förstå den biologiska grunden för dvala och kylning krav5. Dock kan stärkelse kvantifiering av bildanalys på paraffin-inbäddat sektioner Visa sig vara mycket besvärligt och tidskrävande att uppskatta kylning kraven i ett stort antal sorter. Framtida insatser måste inriktas på att studera tillförlitliga biologiska indikatorer som enkelt kan ange statusen dvala av trädet. Samtidigt mönstret av stärkelse variationer under dvala kan användas för att rama in ytterligare fysiologiska och genetiska studier, och kombinationen av histochemical metoder med bildanalys som beskrivs häri kan användas i andra vedartade perenna grödor till kvantifiera stärkelse av olika vävnader i förhållande till dvala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tacka tacksamt Maria Herrero och Eliseo Rivas för deras bra diskussion och råd. Detta arbete stöds av Ministerio de Economía y Competitividad — Europeiska regionalutvecklingsfonden, Europeiska unionen [grant number BES-2010-037992 till E. F.]; Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [grant nummer RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; och de Gobierno de Aragón — Europeiskasocialfonden, Europeiska unionen [Grupo Consolidado A12-17R].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
References
- Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae. Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).
- Rohde, A., Bhalerao, R. P.
- Fadón, E., Rodrigo, J. Unveiling winter dormancy through empirical experiments. Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).
- Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.). Trees - Structure and Function. , In Press (2018).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry. Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).
- Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots. HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiology. , (2016).
- Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca). Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).
- Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana). PLoS One. 8 (10), e78467 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Quantification of starch in plant tissues. Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Rodrigo, J., Herrero, M. Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.). Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).
- Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), (2012).
- Faulkner, C., et al. An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants. Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).
- Kuhn, B. F. Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. "Stevnsbaer.". European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).
- Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGraw-Hill. New York, NY. (1940).
- Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York, NY. (1999).
- Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system. Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana). Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).
- Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering. Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).
- Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy - Physiological terminology and classification for dormancy research. HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques. Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).
- Kaufmann, H., Blanke, M. Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry. Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).
- Herrero, M., Dickinson, H. G. Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses. Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
