Summary
Vi presentiamo una metodologia per quantificare il contenuto di amido nei primordi dell'ovaia in ciliegio dolce (Prunus avium L.) durante la dormienza invernale utilizzando un sistema di analisi di immagine combinato con tecniche istochimiche.
Abstract
Cambiamenti in amido in piccole strutture sono associati con gli eventi chiave durante diversi processi di sviluppo della pianta, compresa la fase riproduttiva da impollinazione fecondazione e l'inizio di fruttificazione. Tuttavia, variazioni di amido durante la differenziazione a fiore non sono completamente noti, principalmente a causa della difficoltà di quantificare il contenuto di amido nelle strutture particolarmente piccole dei primordi del fiore. Qui, descriviamo un metodo per la quantificazione dell'amido nei primordi dell'ovaia del ciliegio dolce (Prunus avium L.) utilizzando un sistema di analisi di immagine collegato al microscopio, che permette riguardanti i cambiamenti nel contenuto di amido con le diverse fasi di dormienza dall'autunno alla primavera. Per questo scopo, lo stato di dormienza di boccioli di fiori è determinato valutando la crescita del germoglio di germogli trasferito a condizioni controllate in diversi momenti nel periodo invernale. Per la quantificazione dell'amido nei primordi ovaia, boccioli di fiori sono in sequenza raccolti, corretti, incorporati in paraffina, sezionati e macchiati con I2Kl (ioduro di potassio-iodio). Preparazioni sono osservati al microscopio e analizzati da un analizzatore di immagine che distingue chiaramente amido dallo sfondo. Valori del contenuto di amido si ottengono misurando la densità ottica dell'immagine che corrisponde all'amido macchiato, considerando la somma della densità ottica di ogni pixel come una stima del contenuto di amido del telaio studiato.
Introduction
Piante perenni legnose temperate adattano alle stagioni, modulando la loro crescita e sviluppo. Mentre si sviluppano durante la primavera e l'estate, smettere di crescere durante l'autunno per andare dormente in inverno1. Anche se dormienza permette loro di sopravvivere alle basse temperature invernali, agghiacciante è un prerequisito per un corretto budburst in primavera2. Le importanti implicazioni di dormienza in produzione frutticola temperato e silvicoltura hanno portato a diversi sforzi per determinare e prevedere il periodo di dormienza3. Arboree da frutto, esperimenti empirici trasferimento germogli per imporre condizioni e statistiche stime basate sui dati della fioritura sono attuali approcci per determinare la data della rottura di dormienza, che permette ai ricercatori di stimare il requisiti per ogni cultivar di refrigerazione. Tuttavia, come determinare lo stato di dormienza basato su processi biologici rimane poco chiaro3.
Fioritura di alberi da frutto temperato, come sweet cherry (Prunus avium L.), si verifica una volta all'anno e dura circa due settimane. Tuttavia, i fiori cominciano a differenziare e sviluppare circa 10 mesi prima, durante l' estate precedente4. Primordia fiore smettere di crescere durante l'autunno per rimanere dormienti all'interno i germogli durante l'inverno. In questo periodo, ogni cultivar deve accumulare un particolare requisito agghiacciante per corretta fioritura4. Nonostante la mancanza di cambiamenti fenologici nei germogli durante l'inverno, primordia fiore è fisiologicamente attivi durante la dormienza, e l'accumulo di temperature di refrigerazione è stata recentemente associata con la dinamica di accumulo di amido o diminuire all'interno delle cellule del primordio dell'ovaia, che offre un nuovo approccio per dormienza determinazione5. Tuttavia, le piccole dimensioni e la posizione del primordio ovaia richiedono una metodologia speciale.
L'amido è il carboidrato di memoria principale in pianta legnosa specie6. Così, le modifiche in amido hanno riguardate l'attività fisiologica dei tessuti fiore, che hanno bisogno di carboidrati per sostenere il loro sviluppo7,8. Diversi eventi chiavi durante il processo riproduttivo sono anche legati alla variazioni nel contenuto di amido in diverse strutture floreali, come ad esempio antera meiosi9, la crescita dei tubi polline attraverso la fecondazione stile o ovulo10. Tecniche istochimiche consentono la rilevazione dell'amido in ogni tessuto particolare dei primordi fiore durante la dormienza. Tuttavia, la difficoltà rimane nel quantificare tale amido per consentire in seguito il modello di accumulazione/diminuire nel tempo o confrontando l'amido contenuto tra tessuti, cultivar o anni. Ciò è dovuto la piccola quantità di tessuto disponibile per le tecniche analitiche11. In alternativa, analisi dell'immagine legata a microscopia12 permette la quantificazione dell'amido molto piccoli campioni di tessuto di pianta13.
Approcci che combina analisi di microscopia e immagine sono stati usati per quantificare il contenuto di diversi componenti nei tessuti vegetali, come ad esempio callosio14, microprovette15, o fecola16, misurando le dimensioni della zona tinta da specifici macchie. Per amido, può essere facilmente individuata usando lo ioduro di potassio-iodio (ho2KI) reazione17. Questo metodo è altamente specifico; Ho2KI si intercala all'interno della struttura laminare di granuli di amido e forma un colore blu o marrone-rossastro scuro, a seconda del contenuto di amilosio dell' amido18. Le sezioni colorate con I2macchia KI Visualizza adeguato contrasto tra amido e il tessuto di fondo, permettendo una diagnosi inequivocabile di amido e la successiva quantificazione tramite il sistema di analisi immagine19. Sebbene questo colorante non è stechiometrico, l'accumulo di iodio è proporzionale alla lunghezza della molecola dell'amido, che può variare altamente17. Così, la dimensione della zona macchiata espressa come il numero di pixel potrebbe non riflettere accuratamente il contenuto di amido, poiché alte differenze nel contenuto di amido potrebbero essere trovate tra i campi con aree macchiate di dimensioni simili. In alternativa, il contenuto di amido può essere valutato misurando la densità ottica dei granuli colorati su bianche e nero immagini ottenute dal microscopio, come è stato segnalato in diversi tessuti in albicocca8,13 , 19, avocado10,20e ulivi21.
Qui, descriviamo una metodologia che combina la determinazione sperimentale di stato di dormienza con la quantificazione del contenuto di amido nel tessuto del primordio ovaia dall'autunno alla primavera in ciliegio dolce, che offre un nuovo strumento per la comprensione e la previsione di dormienza basata sullo studio dei meccanismi biologici collegati con dormienza.
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Protocol
1. dormienza determinazione e pianta raccolta materiale
- Assaggiare i boccioli dei fiori nel campo. Studi di dormienza sono esperimenti a lungo termine e richiedono adulto alberi abbastanza grande per raccogliere gemme e spara tutto l'inverno senza compromettere lo sviluppo degli alberi durante la prossima primavera. Gestione del frutteto speciale potrebbe essere necessaria a seconda del sistema di formazione; quindi, la potatura può essere meno severa che a fini di produzione di frutta.
- Ogni settimana, dall'inizio dell'autunno fino all'inizio del germogliamento, raccogliere e pesano 10 boccioli di fiori.
- Difficoltà i boccioli dei fiori inserendoli in una provetta di vetro da 10 mL con tappo e i campioni in ammollo in una soluzione fissante di etanolo/acido acetico (3:1) per almeno 24 ore a 4 ° C. Scartare il fissativo, quindi aggiungere 75% etanolo, generosamente assicurando che copre i campioni. I campioni possono essere conservati in questa soluzione a 4 ° C fino all'utilizzo.
Nota: L'infiltrazione vuoto utilizzabile per rimuovere le bolle d'aria all'interno della gemma e impedire loro di galleggiare. Questo facilita la penetrazione del fissativo nei tessuti, ma poteva danneggiare la struttura dei tessuti. Cercate di evitarlo se non necessario.
- Assaggiare i germogli nel campo.
- Ogni settimana, dall'inizio dell'autunno fino all'inizio del germogliamento, prendere tre germogli di 15-30 cm di lunghezza e 5 mm di diametro, contenente almeno 10 boccioli di fiori. Mettetele su fiorista impregnati d'acqua schiuma in una camera di crescita a 22 ± 1 ° C con un fotoperiodo di 12 h luce.
- Dopo 10 giorni nella camera di crescita, scegliere e pesare 10 boccioli di fiori dai germogli.
- Valutare la crescita del germoglio e determinare lo stato di dormienza. Il periodo di campionamento deve essere adattato alle condizioni del luogo. Nelle condizioni di frutteto (Saragozza, Spagna, 41 ° 44'30 "N, 0 ° 47'00" W e 220 m sul livello del mare), il campionamento dei germogli è stato effettuato dal 30 novembre fino alla fine di febbraio o inizio marzo.
- Settimanale valutare la risposta di boccioli di fiori per le condizioni di crescita adatto della camera, dall'inizio dell'autunno fino al budburst in primavera, confrontando il peso delle 10 gemme raccolte dal campo.
- Se non ci sono differenze o tali differenze sono meno del 30%, considera che le gemme non hanno rispettato i loro requisiti agghiacciante e sono endodormant22. Se le differenze sono più del 30%, considera che i germogli hanno soddisfatto le loro esigenze agghiacciante e sono ecodormant22.
2. pianta preparazione materiale per la quantificazione di amido
- Selezionare circa sei gemme fissi da ogni campionamento datano (Vedi punto 1.1). A seconda della cultivar, ogni germoglio di fiore di ciliegio dolce contiene fino a cinque primordia di fiore.
- Rimuovere le squame esterne bud e posizionare la gemma sul vetro di un orologiaio con etanolo al 75% per evitare che si secchino.
- Sezionare il germoglio ed estrarre almeno un primordio di fiore a gemma con l'aiuto di pinze di precisione e un bisturi oftalmologico sotto un microscopio stereoscopico. Il primordio fiore può essere conservato in un tubo di vetro da 10 mL con etanolo di 75% a 4 ° C, o procedere immediatamente alla fase successiva.
- Disidratare i campioni in una serie di alcool butilico terziario.
- Sostituire la soluzione di etanolo di 75% con 10 mL di 75% alcool butilico terziario (TBA) generosamente coprire i campioni e li Incubare per 1,5 h. Una pipetta Pasteur può essere utile per eliminare la soluzione.
- Ripetere il passaggio 2.2.1, aggiungendo TBA con aumento della concentrazione (100%, 85% e 95% v/v; e 3x con puro TBA) in una stufa di essiccazione a 30 ° C con estrazione dell'aria, poiché puro TBA crystalizes a temperatura ambiente (< 20 ° C) ed è molto volatile e tossico. Se TBA crystalizes con il campione, esso potrebbe danneggiare i tessuti.
- Incorporare i campioni in paraffina18.
- Fate sciogliere la paraffina introducendo le perle di paraffina nella stufa essiccazione a 60 ° C con estrazione dell'aria del giorno precedente. Le perle di paraffina possono essere anche fuso su una piastra riscaldante, ma assicurano che la paraffina liquida sia a 60 ° C e non a una temperatura più elevata, per evitare danni ai tessuti.
- Sostituire il TBA con un mix di olio di paraffina e TBA (1:1) e incubare per 24 h all'interno di una stufa di essiccazione a 60 ° C. Quindi, sostituire il mix di TBA e olio di paraffina con puro sciogliere la paraffina e incubare per almeno 6 ore all'interno di una stufa di essiccazione a 60 ° C. Ripetere 2x e incubare l'ultimo cambiamento per almeno 4-6 d.
- Ogni campione viene posto su un piccolo stampo base metallo su una superficie di calore, embedded in cera di paraffina e passo la cassetta incasso. Posto sopra una superficie fredda e rimuovere il blocco una volta che la cera si solidifica.
- Sezione e reidratare i preparativi.
- Preparare adesivo di Haupt: sciogliere 1 g di gelatina di Knox pianura in 100 mL di acqua distillata a 30 ° C; quindi, aggiungere 2 g di cristalli di fenolo sciolti (C6H5OH) e 15 mL di glicerolo. Sviluppa adesivo di Haupt su una lastra di vetro con un pennello e aggiungere una goccia di una soluzione di 1% di formaldeide.
- Sezione ogni paraffina bloccare a 10 µm in un microtomo rotatorio e inserire le sezioni su lastra di vetro coperto con adesivo di Haupt.
- Posizionare i vetrini con le sezioni su una superficie di calore a 35-40 ° C fino a secco; quindi spostare le diapositive di vetro in un portavetrini.
- Preparare le soluzioni dewax e reidratazione. Posto 200 mL di Histoclear II in tre piatti di vetro di colorazione, un altro con Histoclear II:ethanol (1:1, v/v), una serie di etanolo (100%, 70%, 40% v/v) e un lavaggio finale con acqua distillata.
- Sparaffinatura le sezioni con tre lavaggi, ogni 5 min, II Histoclear e Histoclear II:ethanol (1:1, v/v). Posizionare il portavetrini all'interno i piatti di vetro-macchiatura, assicurando che la soluzione copre completamente le diapositive e, quindi, spostare il portavetrini da una soluzione a quella successiva.
- Reidratare le sezioni dalla seguente serie di lavaggi 2 min: una serie di etanolo (100%, 70%, 40% v/v) e un lavaggio finale con acqua distillata. Infine, asciugare i vetrini a temperatura ambiente.
- Macchia le sezioni18.
- Preparare I2KI colorazione: sciogliere 2 g di ioduro di potassio (KI) e 0,2 g di iodio (ho2) in 100 mL di acqua distillata. Applicare una goccia di fresco ho2KI sopra le sezioni per 5 min e, quindi, eliminare l'eccesso di macchia assorbendo con una carta assorbente. Rapidamente, procedere al passaggio successivo.
- Applicare una piccola goccia di un supporto di montaggio sintetico, posto un piccolo bicchiere di copertura sulla parte superiore e premere con forza. Una volta che il supporto di montaggio si asciuga, osservare sotto un microscopio a campo chiaro per una valutazione preliminare dell'amido dell'ovaia.
Nota: Questo passaggio non è obbligatorio, anche se si ottiene un migliore contrasto tra l'amido e lo sfondo. Se la sezione deve essere riutilizzato con altre macchie dopo quantificazione di amido, posizionare il vetro di copertura sopra la goccia di macchia e scartare l'eccesso assorbendo con una carta assorbente (vedere 2.5.1). Poi, dopo la quantificazione di amido, lavare fuori I2KI macchia con acqua distillata e posto le preparazioni a fuoco in superficie a 35-40 ° C fino a secco.
3. quantificazione del contenuto di amido
- Calibrare le condizioni ottiche.
Nota: I livelli di rilevamento utilizzati dall'analizzatore di immagine per rilevare l'amido macchiato sono direttamente dipendenti da condizioni di luce e l'ingrandimento del microscopio; così, fissare queste condizioni per tutte le preparazioni valutate. Adattare la regolazione qui proposta per il microscopio disponibile e condizioni di luce.- Regolare il diaframma d'apertura al 20 X ingrandimento e il controllo della luminosità o dell'intensità luminosa.
- Assicurarsi che non ci siano filtri sul portafiltro e selezionare una condizione di campo chiaro nel microscopio. Selezionare un ingrandimento adatto (per esempio, 40 X per primordio ovaia ciliegio dolce).
- Controllare le condizioni di acquisizione immagine. Regolare le impostazioni della fotocamera con una preparazione macchiata senza tessuto via immagine | Acquisizione | Pre-view.
- Fissare la luminosità al 50%, il guadagno a 1.0 x e gli indicatori di istogramma la gamma valore alla 1.00 e il contrasto a 0 - 100, allineando con i limiti dell'istogramma di distribuzione di luminosità.
- Attivare la funzione di sovraesposizione/sottoesposizione e regolare il tempo di esposizione al limite della sovraesposizione.
- Applicare la funzione di bilanciamento del bianco per l'immagine completa per visualizzare tutti i componenti di colore neutro dell'immagine senza alcun tono di colore e la correzione dell'ombreggiatura all'immagine completa per creare un'immagine corretta e omogenea.
- Calibrare il sistema di analisi di immagine per ottenere i valori di controllo del livello grigio (0, nero; 255, bianco) di diverse densità ottica (OD) che si ottengono i valori di trasmittanza (T).
- Acquisire un'immagine di una preparazione macchiata senza tessuto, considerato il controllo bianco, e misurare il livello di grigio dell'immagine in bianco e nero via misura | Grigio misura | Calibrare il grigio | Valore di riferimento = 0 | Misura | Calibrare | OK. Ciò corrisponde con una trasmissione di 100%; così, una densità ottica pari a 0, secondo OD = 2 - accedere T.
- Acquisire un'immagine della stessa preparazione con un filtro 4N, che riduce la quantità di luce 4 x e misura il livello di grigio dell'immagine in bianco e nero via misura | Grigio misura | Calibrare il grigio | Valore di riferimento = 0,6 | Misura | Calibrare | OK. Ciò corrisponde con una trasmissione di 25%; così, una densità ottica di 0,6, secondo OD = 2 - accedere T.
- Acquisire un'immagine della stessa preparazione senza luce, considerato il nero, e misurare il livello di grigio dell'immagine in bianco e nero via misura | Grigio misura | Calibrare il grigio | Valore di riferimento = 1 | Misura | Calibrare | OK. Ciò corrisponde con una trasmittanza di 0%; così, una densità ottica pari a 1, secondo OD = 2 - accedere T.
- Rilevare l'amido.
- Acquisire un'immagine a colori del campo da misurare in formato TIFF con una risoluzione di almeno 300 punti per pollice (dpi).
- Creare un'immagine binaria corrispondente alla zona macchiata. Impostare le soglie di tre colori (valori tra 0 - 255 per ciascuno) fino a quando l'immagine binaria riflette esattamente i granuli di amido macchiato osservati, via immagine | Rilevare | Selezionare le soglie di rosso, blu e verde | OK. Fare paragoni ripetutamente visual in varie preparazioni e tessuti con cui ottimizzare i livelli di rilevamento finale. Memorizzare e utilizzare questi livelli per tutte le preparazioni.
- Quantificare l'amido. Convertire l'immagine originale a colori in un'immagine in bianco e nero con il sistema di analisi di immagine. Utilizzare l'immagine binaria come una maschera sovrapposta l'immagine in bianco e nero via immagine | Binary modifica. Misurare la somma della densità ottica di ogni pixel sotto la maschera tramite misura | Livello di grigio | OK e considerare questo valore come il contenuto di amido nel campo misurato.
- Ripetere i passaggi 3.4.1 - 3.4.3 in quattro luoghi dei primordi dell'ovaia per ottenere un valore rappresentativo del contenuto di amido nell'ovaia dei primordi del fiore.
- Ripetere i passaggi 3.4.1 - 3.4.3 e passo 3.4.5 in fiori diversi di ogni data di raccolta.
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Representative Results
Gli studi di dormienza richiedono la determinazione del momento quando sono soddisfatte le prescrizioni agghiacciante. Nonostante la mancanza di cambiamenti fenologici durante l'inverno in condizioni di campo (Figura 1A), alberi di ciliegio non recuperare la capacità di crescita in condizioni adatte fino a quando non passano un certo periodo a bassa temperatura. Il trasferimento regolare dei germogli in una camera di condizioni controllate (Figura 1B) durante il periodo invernale ha permesso la valutazione dello stato di dormienza dei boccioli. La valutazione della crescita del germoglio di fiore era fatto misurando l'aumento di peso di bud. Mentre, durante la dormienza, nessun cambiamento potrebbe essere osservato dopo 10 giorni di condizioni adatte (Figura 1), una volta che è stata superata la dormienza, i germogli si gonfiò e scoppiano nella camera di crescita (Figura 1). I risultati di questa analisi ha permesso lo stato di dormienza delle gemme da stabilire. A causa delle diverse temperature che si verificano durante l'inverno, la dormienza è stato superato in date diverse, a seconda dell'anno. Mentre, durante il primo anno dello studio, la rottura di dormienza si è verificato nel mese di gennaio, il secondo anno ha presentato una stagione invernale più mite; così, l'agghiacciante adempimento si è verificato circa tre settimane dopo, nel mese di febbraio.
Ciliegio dolce porta boccioli in speroni, dove la gemma apicale è un germoglio vegetativo e le gemme laterali sono germogli di fiore (Figura 1 e 1 D). Gemme indifferenziate iniziò a differenziarsi in fiore o gemme vegetative alla fine dell'estate, e quando entrano in dormienza nel periodo invernale, diversi primordia fiore rimanga all'interno di germoglio, protetto da numerose squame verdi e coperto da scale esterne marrone ( Figura 1 e Figura 2A). La dissezione del bocciolo ha mostrato i primordi di piccolo fiore all'interno (Figura 2A). Ogni germoglio di fiore contenute primordia di singolo fiore di uno a cinque (Figura 2B). Nonostante le piccole dimensioni del primordio ogni fiore, tutte le parti di un fiore sono differenziate e può essere distinte: il pistillo, le antere, i petali e i sepali (Figura 2). L'uso delle tecniche istochimiche (alcol: acetica [3:1] fissazione, l'incorporamento di cera di paraffina, microtomo sezionamento e macchiatura amido iodato) ha permesso la distribuzione dell'amido entro il fiore tessuti primordio devono essere rispettate (Figura 2D ).
Amido nel primordio dell'ovaia è stato quantificato in ogni sezione. Quattro misure di 1337 µm2, all'ingrandimento di 40x, rappresentato il layout generale di amido nel primordio ovaia di ciliegio dolce (Figura 3A). Granuli di amido erano chiaramente distinguibili dallo sfondo dopo I2KI macchiatura (Figura 3B). L'amido è stato identificato mediante il sistema di analisi di immagine, regolando il colore soglie di rosso, verde e blu fino ad osservare tutti i granuli di amido sono stati coperti dall'immagine binaria creato dal sistema in base ai parametri definiti colore (Figura 3). I valori del contenuto di amido ottenuto erano il risultato della misura della densità ottica di ogni pixel sotto la maschera dell'immagine bianco e nero (Figura 3D).
La quantificazione dell'amido ha rivelato un modello coerenza di amido dinamica durante l'inverno (Figura 4). Coerentemente, la quantità di amido all'inizio dell'inverno ha presentato un valore di densità ottica pari a meno di 40.0003, mentre l'importo massimo raggiunto un valore compreso tra 120.000 e 140.000 in entrambi gli anni. Mentre il valore massimo è stato raggiunto a gennaio durante il primo anno (Figura 4A), si è presentato in febbraio dell'anno secondo (Figura 4B). Questi risultati con la carnagione di dormienza contrastanti, la quantità massima di amido si è verificato in concomitanza con l'adempimento agghiacciante in entrambi gli anni.
Questo approccio richiede la determinazione dello stato di dormienza (Figura 5A) in concomitanza con la quantificazione di amido sul tessuto ovario (figura 5B) al fine di inquadrare i cambiamenti nel contenuto di amido in relazione alla dormienza.
Figura 1: set-up sperimentale per la determinazione dello stato di dormienza dei boccioli di ciliegio dolce. Rami (A), durante l'inverno, Visualizza le gemme dormienti chiuso e coperto di squame marrone scuri. (B), questo pannello mostra germogli trasferiti alla camera di crescita. A metà gennaio, alcune cultivar è rimasto dormente con le gemme ancora chiuso (freccia bianca), mentre altri erano in grado di crescere, mostrando gonfiò germogli (freccia nera). (C) questo pannello mostra un dettaglio di un germoglio con germogli di fiore dormienti situati lateralmente e un singolo germoglio vegetativo che si trova in posizione apicale nello sperone. (D), questo pannello mostra un dettaglio di un tiro una volta dormienza è stata superata dopo 10 giorni in camera di crescita, mostrando gonfiore di bud. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: impianto di preparazione del materiale per la quantificazione di amido. (A), questo pannello mostra una sezione trasversale di un bocciolo di fiore, mostrando due primordi fiore (fp) protetto da numerose squame (sc). (B) tre primordi di fiore (fp) si riuniscono in un bocciolo di fiore. (C) questo pannello mostra la sezione trasversale di un primordio di fiore, con tutti i whorls differenziati: sepali (se), petali (pe), antere (an) e pistillo (pi). Il primordio dell'ovaia si distingue alla base del pistillo (freccia). (D), una sezione centrale di un primordio di fiore era raccolti e fissato nel mese di gennaio, incorporato in paraffina, sezionati e macchiato con I2KI (marrone scuro) per amido. Questo pannello mostra il primordio dell'ovaia (freccia). Le barre di scala sono 500 µm in pannelli A e B e 200 µm in pannelli C e D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: amido quantificazione in primordio ovaia sweet cherry. (A), questo pannello mostra una sezione centrale di un primordio ovaia macchiato con I2KI, mostrando i quattro fotogrammi in cui amido contenuto è stata misurata. (B), questo pannello mostra un dettaglio del primordio dell'ovaia. I granuli di amido sono colorati in marrone scuro. (C), questo pannello mostra un'immagine di pseudocolor in cui amido corrisponde a diverse tonalità di blu. (D), questo pannello viene illustrata una maschera di immagine binaria che copre I2KI-macchiato amido (blu) sull'immagine originale bianco e nero. La densità ottica è misurata solo in pixel dell'immagine originale coperto dalla maschera. Le barre di scala sono 100 µm nel pannello A e 20 µm in pannelli B - D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: risultati rappresentativi della quantificazione di amido nei primordi dell'ovaia ciliegio dolce raccolto mensile da autunno a primavera durante due anni di condizioni di temperatura di inverno diverso. (A), questo pannello mostra i risultati degli anni 2010-2011, che ha avuto un inverno freddo. L'adempimento agghiacciante (fiocco di neve) si è verificato nel mese di gennaio, in concomitanza con la massima quantità di amido. (B), questo pannello mostra i risultati degli anni 2011-2012, che ha avuto un inverno mite. L'adempimento agghiacciante (fiocco di neve) si è verificato nel mese di febbraio, in concomitanza con la massima quantità di amido. I valori sono la media ± errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: schema del disegno sperimentale per valutare lo stato di dormienza delle gemme e la quantificazione di amido nei primordi dell'ovaia in ciliegio dolce. (A), questo pannello mostra i flussi di lavoro della determinazione dello stato di dormienza: la preparazione del materiale di impianto, il processo e i risultati ottenuti. (B), questo pannello mostra i flussi di lavoro della quantificazione di amido: la preparazione istochimica dei germogli per un'osservazione al microscopio dell'amido, la rilevazione di analisi di immagine di amido e la quantificazione di amido. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Dormienza in piante legnose perenni presenta chiare implicazioni nella produzione della frutta e della silvicoltura in un clima che cambia, anche se il processo biologico dietro dormienza rimane poco chiaro. Studi di dormienza possono essere affrontati da diversi punti di vista, ma la ricerca alla ricerca di un marcatore biologico per dormienza invernale si è intensificata negli ultimi anni. Tuttavia, la maggior parte dei tentativi di trovare un indicatore inequivocabile risultati quando un germoglio ha rotto la dormienza sono stati infruttuoso3. La metodologia descritta nel presente documento, combinando tecniche istochimiche18 con immagine di analisi, è stato molto utile per esaminare la relazione tra riserve di carboidrati di un tessuto particolare e la sua attività fisiologica in boccioli di ciliegio dolce durante le diverse fasi di dormienza5 e può essere applicato anche ad altre specie e tessuti10,13,20.
Riserve di carboidrati sotto forma di amido svolgono un ruolo importante sia per lo sviluppo del fiore e il processo riproduttivo7,10,13,20,21,23 e nella stagionalità delle piante perenni legnose temperato6. Diversi studi su dormienza hanno prestato attenzione all'amido nelle gemme24. Tuttavia, a causa del loro di piccola dimensione, diverse gemme intero sono necessari per l'utilizzo di metodi analitici quantitativi e la rilevazione delle variazioni quantitative in particolare tessuti o cellule è limitata dall'effetto di mascheramento delle cellule circostanti. La combinazione di tecniche istochimiche con il sistema di analisi di immagine offre una buona opportunità per studiare i cambiamenti nel contenuto di amido di diverse strutture all'interno sul nascere.
Questo metodo ha il limite di prevenire la quantificazione l'esatto contenuto di amido nel tessuto ma consente il contenuto di amido relativo essere quantificata per seguire le modifiche quantitative amido sopra tempo25 e confrontare l'amido contenuto di diversi tessuti13,20, cultivar o anni5. Al fine di consentire il corretto confronto tra i valori di densità ottica tra campi, tessuti e germogli, la calibrazione del sistema (condizioni di luce, colorazione intensità e ingrandimento) e l'impostazione del colore devono essere accuratamente stabilite soglie , memorizzati e utilizzati per tutte le preparazioni.
Macchiatura di amido e quantificazione a base di iodio potassio permette l'uso successivo di altre macchie dopo il lavaggio della sezione. Così, diverse analisi possono essere eseguite senza ulteriori preparazioni e montaggio sintetico media non sono utilizzati5,20. Allo stesso modo, misure morfometriche26 può essere fatto dopo i preparativi stessi, permettendo che il modello di accumulazione di amido da incorniciare in relazione alla crescita di diverse strutture5,13. Il metodo può essere adattato ad altre specie con la regolazione dei livelli di colore che utilizzano l'analizzatore per rilevare l'amido, che possa consentire lo studio di altri processi di sviluppo che comportano modifiche nel contenuto di amido in piccoli gruppi di cellule o strutture.
Il rapporto fra il rilascio di dormienza e amido accumulo nei primordi dell'ovaia svelato dall'utilizzo di questo metodo fornisce una solida base per capire le basi biologiche della dormienza e agghiacciante requisiti5. Tuttavia, amido quantificazione mediante analisi d'immagine su sezioni in paraffina potrebbe rivelarsi per essere molto ingombrante e richiede molto tempo per valutare i requisiti di agghiaccianti di un gran numero di cultivar. Gli sforzi futuri devono essere concentrati sullo studio affidabili indicatori biologici che possono facilmente indicano lo stato di dormienza dell'albero. Nel frattempo, il modello di variazioni di amido durante la dormienza può essere utilizzato per inquadrare ulteriori studi fisiologici e genetici, e la combinazione di tecniche istochimiche con analisi di immagine descritti nel presente documento potrebbe essere utilizzata in altre colture legnose perenni per quantificare il contenuto di amido di tessuti differenti in relazione alla dormienza.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano con gratitudine Maria Herrero ed Eliseo Rivas per loro discussione utili e consigli. Questo lavoro è stato supportato dal Ministerio de Economía y Competitividad — Fondo europeo di sviluppo regionale, dell'Unione europea [concessione numero BES-2010-037992 a E. F.]; l'Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [grant numeri 00-00015-RFP2015, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; e del Gobierno de Aragón — Fondo sociale europeo, Unione europea [Grupo Consolidado A12-17R].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
References
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