Summary
Här beskriver vi en fotoblekning metod för att minska autofluorescens av cyanobakterier. Efter fotoblekning används stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi att erhålla tredimensionella super-upplösning bilder av Cyanobakterie FtsZ ringen.
Abstract
Super-resolution mikroskopi har använts att studera proteininteraktioner och subcellulära strukturer i många organismer. I fotosyntetiserande organismer, men super-upplösning imaging lateral upplösning är endast ~ 100 nm. Den låga upplösningen beror främst på hög autofluorescens bakgrunden av fotosyntetiska celler som orsakas av hög intensitet lasrar som krävs för super-upplösning imaging, såsom stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM). Här beskriver vi en fotoblekning-assisted STORM metod som utvecklades nyligen för imaging den marina picocyanobacterium Prochlorococcus. Efter fotoblekning, reduceras effektivt autofluorescens av Prochlorococcus så att stormen kan utföras med en lateral upplösning på ~ 10 nm. Med den här metoden vi förvärva i vivo tredimensionell (3-D) organisationen av FtsZ protein och karakterisera fyra olika FtsZ ring morfologier under cellcykeln av Prochlorococcus. Den metod som vi beskriver här kan antas för den super-upplösning imaging andra fotosyntetiska organismer.
Introduction
Super-upplösning microscopies kan bryta diffraktionsgränsen av ljus och ger bilder inom sub diffraktion resolutioner (< 200 nm). De har allmänt använts i många organismer för att studera protein lokalisering och subcellulära strukturer. Major super-resolution mikroskopi metoder omfattar strukturerade belysningen mikroskopi (SIM), stimulerat utsläpp utarmning mikroskopi (STED), STORM och photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). Mekanismerna och tillämpningar av dessa super-upplösning Mikroskop har varit recenserade någon annanstans1,2.
STORMEN kan uppnå en upplösning som är så hög som 10 nm med rumsliga avskiljandet3,4. För STORM, endast en molekyl inom en diffraktion begränsad region är aktiverad (”on”) och resten av molekylerna hålls inaktiverade (”off”). Av en ansamling av snabb switch-on - och off av enstaka molekyler, kan en ”diffraktion-obegränsad” bild vara genererade3. Under tiden, många typer av organiska färgämnen och fluorescerande proteiner är tillämpliga i STORM, möjliggör en enkel uppgradering från regelbundna fluorescensmikroskopi högupplösande mikroskopi5,6.
STORMEN har inte tillämpats allmänt i fotosyntetiska celler, såsom cyanobakterier, alger, och växtceller med kloroplaster7,8, som beror på faktumet att STORM kräver hög laser intensitet att driva photoswitching. Hög intensitet laser unfavorably väcker stark autofluorescens bakgrund i fotosyntetiska celler och stör singel-molekyl lokaliseringen i STORM imaging. För att kunna använda STORM för att undersöka den subcellulära strukturer eller proteininteraktioner i fotosyntetiska celler, utvecklade vi ett fotoblekning protokoll för att släcka bakgrunden autofluorescens signaler9. I en rutinmässig Immunofluorescerande färgningsproceduren utsätts exemplar till vitt ljus med en hög intensitet under blockerande steg, vilket sänker autofluorescens fotosyntetiska celler att uppfylla kraven för STORM. Således gör detta protokoll det möjligt att undersöka pigmenterade organismer med STORM.
Här beskriver vi protokollet om du vill använda STORM till bild FtsZ ring organisationen i de encelliga picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ är ett mycket tubulin-liknande cytoskeletal protein som polymerizes för att bilda en ringstruktur (Z ring) runt omkretsen av en cell10 och är viktigt för celldelningen11. Bevarade Prochlorococcus celler är första photobleached att minska autofluorescent bakgrund och immunostained med en primär anti-FtsZ antikropp och sedan en sekundär anti-kanin IgG (H + L) antikropp är konjugerat med en fluorophore (t.ex. , Alexa Fluor 750). Så småningom används STORM att iaktta de detaljerade FtsZ ring organisationerna i Prochlorococcus under olika cellcykelns faser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. prov förberedelse och fixering
- Inokulera 1 mL axenic Prochlorococcus MED4 till 5 mL av havsvatten-baserade Pro99 medium12. Växa Prochlorococcus kulturer vid 23 ° C under ljuset med en intensitet av 35 µmol fotoner/m2s. fem dagar senare, samla 1 mL av kulturen i ett 1,5 mL rör.
Obs: Fem dagar efter inympningen, Prochlorococcus MED4 når den sena fasen logg, med cirka 108 celler/mL, vilket är lämpligt för avbildning av STORM. - Tillsätt 100 µL formaldehyd nylagade från 25% PARAFORMALDEHYD (PFA) (w/v) och 2 µL av 50% glutaraldehyd i 1,5 mL röret fixar kulturen. Inkubera provet mörkt vid rumstemperatur i 20 min.
Obs: Provet hölls i mörkret för fixering eftersom glutaraldehyd är ljus känslig. - Snurra ner provet vid 13.500 x g för 1 min; ta sedan bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 µL av Pro99 medium12. Förvara provet vid 4 ° C tills immunfärgning.
2. precoating av täckglaset med polystyren pärlor
Obs: Polystyren pärlor anses relaterat markören för drift korrigering.
- Vortex original flaska av polystyren pärlor och förbereda en 1:20,000 utspädning med 50% etanol som arbetande flytgödsel.
- Slå på den varma plattan, Ställ in temperaturen till 120 ° C och placera coverslips på värmeplattan.
- Ladda 100 µL av arbetande flytgödsel på varje täckglas. Inkubera i täckglas på värmeplattan i 10 min och sedan noggrant överföra coverslips till petriskålar för förvaring i rumstemperatur.
Obs: Sidan med pärlorna bifogas bör möta, och cellerna bör fästas på samma sida. Pärlorna är orörlig på coverslips och används för att korrigera den prov-drifting i realtid under STORM imaging. Efter immobilisera pärlorna, kan inte vara flammade coverslips.
3. beläggning av Poly-L-lysin på det pärla-belagd täckglaset
Obs: Detta görs för immobilisering av Cyanobakterie celler.
- Tillsätt 100 µL av poly-L-lysin (1 mg/mL) till mitten av täckglaset med pärla-belagd vänd. Låt det sitta i 30 min i rumstemperatur.
- Använd en pipett noggrant aspire den okopplade poly-L-lysin och överföra den till en 1,5-mL tub. Spara den poly-L-lysin vid 4 ° C för återanvändning.
- Skölj täckglaset med 10 mL ultra-filtrerat vatten i en 60 mm petriskål och sedan kort torka täckglaset på en pappershandduk.
- Lagra täckglaset i en petriskål (100 mm) för senare användning. För att förhindra utmätning av täckglaset till skålen, linje petriskål med ett lager av parafilm.
Obs: Den täckglas, förbelagts med pärlor och poly-L-lysin, kan förvaras vid rumstemperatur i minst ett halvår. Därför rekommenderas det starkt att förbereda ett parti av coverslips i förväg.
4. immobilisering av celler på täckglaset
- Överföra ett silicagel täckglas till en ny petriskål med parafilm längst ner, som kommer att hänvisas till som färgning skålen hädanefter. Ladda 100 µL av det fasta provet på täckglaset och låt det sitta i 30 min så att cellen.
- Överföra täckglaset till en väl 12-well platta, som kommer att hänvisas till som tvätta skålen hädanefter. Tillsätt 1 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl och 2,7 mM KCl, pH 7,4) till brunnen för att tvätta täckglaset. Ta bort PBS-bufferten och lägga till en ny PBS-bufferten för att tvätta täckglaset igen.
5. permeabilisering Cyanobakterie celler
- Ta bort PBS-bufferten med pipett. Tillsätt 1 mL nyberedd permeabilisering buffert till brunnen av tvätt skålen, som innehåller 0,05% icke-joniskt rengöringsmedel-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8,0) och 0,2 promille lysozym.
- Inkubera tvätta skålen vid 37 ° C i 20 min. Ta sedan bort vilket bufferten.
- Tillsätt 1 mL PBS-bufferten och placera tvätta skålen på en shaker som skakar försiktigt tvätta skålen för 5 min. ta bort PBS-bufferten. Upprepa detta steg 3 x att tvätta täckglaset.
6. fotoblekning av klorofyll pigment i en blockering steg
- Överföra täckglaset till färgning skålen. Tillsätt 50 µL blockerande buffert, som innehåller 0,2% (v/v) icke-joniskt rengöringsmedel-100 och 3% (v/v) get serum, på toppen av täckglaset.
- Placera hela färgning plattan på is och flytta den under xenon ljuskällan för fotoblekning för minst 60 min, med en ljusstyrka på 1.800 µmol fotoner/m2·s.
- Efter fotoblekning och blockera, ta försiktigt bort det blockerande buffert av absorberande det med kanten på en pappershandduk.
Obs: Intensiteten av Xenonljus är så hög att det krävs ett par rätt solglasögon för ögonskydd. Under tiden, Linda ljuskällan och plattan med aluminiumfolie för att undvika läckage av ljus, vilket kan orsaka ögonskada. Kontrollera täckglaset varje 15 min för att se till att täckglaset förblir fuktig. Om täckglaset är torr, tillsätt 50 µL blockerande buffert.
7. antikropp bindande
- Lös upp anti -Anabaena FtsZ antikropp i 200 µL av vatten enligt tillverkarens anvisningar.
- Späd 1 µL anti-FtsZ antikropp till 99 µL blockerande buffert. Tillsätt 50 µL utspädda primär antikropp på täckglaset och odla den i rumstemperatur i 30 min.
- Överföra täckglaset till tvätt skålen. Tillsätt 1 mL PBS-bufferten och placera tvätta skålen på en shake. Skaka försiktigt tvätta skålen för 5 min. Upprepa detta steg 3 x att tvätta täckglaset.
- Överföra täckglaset till färgning skålen. Späd 1 µL av en sekundär antikropp in 500 µL blockerande buffert. Tillsätt 50 µL utspädda sekundära antikroppar på täckglaset och inkubera det i 30 min i mörker vid rumstemperatur.
- Överföra täckglaset till tvätt skålen. Tvätta det med 1 mL PBS-bufferten på en shaker. Skaka försiktigt tvätta skålen för 5 min. Wrap tvätta skålen med aluminium papper för att göra det ljus-bevis. Upprepa detta steg 3 x.
- Tillsätt 500 µL formaldehyd nylagade från 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) (w/v) till brunnen. Inkubera i täckglas för 15 min i mörker vid rumstemperatur.
- Ta bort formaldehyd och upprepa tvätt steg 3 x.
- Lagra täckglaset i PBS-bufferten vid 4 ° C i mörker tills imaging.
8. beredning av stormen Imaging buffert
- Laga 1 mL imaging buffert enligt tabell 1, omedelbart före stormen bildtagning.
Obs: Hållbarhetstiden för imaging bufferten är ca 2 h, förbereda den färska, precis innan användning. Undvika vortexa efter tillsats av glukosoxidas och katalas.
FÖRSIKTIGHET: Metyl viologen är giftiga material. Vänligen hantera det med särskild omsorg. Cyclooctatetraene klassificeras som ett cancerframkallande ämne katt. 1 kemiska. Vänligen Undvik inandning och hudkontakt och göra cyclooctatetraene stamlösning och imaging buffert i en kemisk huva.
9. bild förvärv av STORM Data
- Ladda täckglaset i lastning kammare (figur 1). Ladda nylagade imaging bufferten försiktigt in i kammaren att undvika tvätta bort Cyanobakterie cellerna. Placera ett rektangulärt täckglas på toppen av de imaging buffert för att förhindra dess reaktion med syret i luften. Undvika svällning luftbubblor under täckglaset.
- Slå på kameran, LED ljus och laser. Öppna STORM programvara för bild förvärv, centroiden placerabeslutsamheten och prov drifting korrigering13.
- Lägg hälften en droppe av nedsänkning olja ovanpå linsen. Ladda kammaren och se till att linsen av målet kommer i kontakt med täckglaset.
- Undersök signalen med en 750-nm laser.
Obs: Inkludera alltid en andra antikropp-minus-färgning negativ kontroll för att säkerställa att autofluorescens minskas. - Identifiera ett prov område som innehåller både celler och relaterat markörer. Starta programvaran för prov drifting korrigering.
Obs: I allmänhet idealisk exempelområdet innehåller 10-30 celler. Under tiden bör cellerna separeras väl för att undvika överlappande celler. - Förvärva en wide-fältet bild som referens, med kameran elektron multiplikation (EM) vinna på 300 och en exponeringstid av 30 ms (figur 2A).
- Öka intensiteten, laser 750-nm magnetiseringen till en högre makt, cirka 4,5 kW/cm2. När fluorophores har övergått i en gles blinkande mönster, förvärva en super-upplösning bild genom att samla 10.000 bilder på 33 Hz (figur 2B).
Obs: Om fluorophores inte är isolerade, vänta ett par minuter tills mer fluorophores kopplas till mörka staten och de isolerade enstaka molekylerna flimra sekventiellt. Antalet ramar som beskrivs här är lämplig för vårt urval och måste optimeras för andra riktade strukturer.
10. rekonstruktion av super-upplösning bilder från rådata
- Använd en plugin som kallas QuickPALM (Tabell för material)14 i ImageJ för att rekonstruera en 3-D super-resolution färgbild.
Obs: En preliminär kromatisk bild (figur 2 c) tillsammans med en färgkodad skala bar (figur 2 c) visas. Färg representerar djupet på z-axeln. - För att demonstrera 3-D struktur i en video, bygga en stack av super-upplösning bilder med z-axis sektioneras varje 10 nm med QuickPALM14. Justera ljusstyrkan för stackarna och duplicera en målcell pappersbunten. Använda en plugin som kallas 3D Viewer (Tabell för material)15 i ImageJ för att generera 3D-bilden av cellen. Registrera rotation av 3D-strukturen i demonstrationssyfte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
STORM uppnår super-upplösning imaging genom att aktivera enskilda photoswitchable fluorophores stochastically. Placeringen av varje fluorophore registreras och en super-upplösning bilden sedan konstrueras utifrån dessa platser4. Precisionen av fluorophore var därför viktigt för super-upplösning bild återuppbyggnad. Absorberingsspectra av Prochlorococcus topp på 447 nm och 680 nm,och Prochlorococcus har en minimal absorption vid våglängder över 700 nm16. Dock avges Prochlorococcus MED4 celler fortfarande hög autofluorescens när de utsätts för en extremt hög intensitet av 750-nm laser (figur 3A), som krävs för STORM imaging. Således är hög autofluorescens bakgrunden av Prochlorococcus celler kraftigt stör super-upplösning imaging.
För att utnyttja STORM för att undersöka protein organisationer i Prochlorococcus, utvecklat vi en metod för fotoblekning. Efter exponering för ett vitt ljus med hög intensitet för 30 min, autofluorescens Prochlorococcus MED4 celler minskat (figur 3B), även om flera celler med autofluorescens upptäcktes fortfarande. Vi har ytterligare långsträckt fotoblekning tid att 60 min och fann att majoriteten av cellerna förlorat sin autofluorescens (figur 3 c). Dessa resultat indikerar att den fotoblekning metod vi utvecklat här kraftigt kan minska autofluorescens i fotosyntetiska organismer.
Efter fotoblekning, kunde vi använda STORM för att visualisera proteinet celldelning FtsZ i Prochlorococcus MED4 celler. Cyanobakterien Prochlorococcus är den minsta och mest förekommande fotosyntetiska organismen på jorden17. En Prochlorococcus cell diameter är endast 500-700 nm18. Med en sådan liten Cellstorlek är det omöjligt att visualisera FtsZ ring organisationen i Prochlorococcus celler med konventionella wide-fältet fluorescensmikroskopi (figur 2A). Men stormen har en rumslig upplösning 9,6 nm i xy-planet och 41,6 nm i z-axeln. Med STORM, kunde vi avslöja en detaljerad morfologi av FtsZ ring i Prochlorococcus (siffror 2B och 4). Genom att rotera 3D-STORM bilder, vi identifierat fyra olika typer av FtsZ ring morfologier: kluster (figur 4A, Film S1), en ofullständig ring (figur 4B, Film S2), en komplett ring (figur 4 C, Film S3), och dubbla ringar (figur 4 D, Film S4). Brister observerades i fullständig FtsZ ringar Prochlorococcus (figur 4 c, Film S3), som är liknande till det som finns i Caulobacter cresentus19. Dessa fyra typer av FtsZ ring morfologier visade församlingen processen av FtsZ ring under cellcykeln av Prochlorococcus, och denna studie hjälpte oss att förstå rollen som den FtsZ ringen under celldelning av Prochlorococcus 9.
Figur 1: komponenter i lastning kammare och monterade kammare med coverslips och imaging bufferten för STORM imaging. Täckglas med provet placerades på spåret på den nedre delen först. Den övre delen var sedan noggrant skruvas på den nedre delen. Imaging bufferten lades i lastning kammare och sedan noggrant täckt med en fyrkantig täckglas. Bubblorna bör undvikas för att minimera eventuella rörelse som kan påverka noggrannheten i mätningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa wide-fältet, 2-D STORM och 3-D färg STORM bilder av FtsZ i Prochlorococcus MED4. Bilderna togs från samma synfält med regelbundna (A) wide-fältet mikroskopi, (B) 2-D STORM och (C) 3D-färg STORM. Färgerna i panel C visar djupet av fluorescerande signalerna på z-axeln. Siffrorna i panel C visar cellerna i intresse. Skala barer = 1 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Fotoblekning av Prochlorococcus MED4. Fast Prochlorococcus MED4 celler var (A), inte photobleached, eller de photobleached för (B) 30 min och (C) 60 min. XD-300 xenon ljuset användes vid en intensitet av 1 800 µmol/m2·s. celler var glada av en 750-nm laser med samma intensitet som användes för STORM avbildning. Autofluorescences var avbildade med samma filter som används i stormen för att kontrollera förekomsten av minimal autofluorescens påverka STORM. Skala barer = 2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa STORM bilder av fyra FtsZ ring morfologier. Fyra olika FtsZ ring morfologier observerades i Prochlorococcus: (A) kluster, (B) en ofullständig ring, (C) en komplett ring och (D) dubbla ringar. För samma cell visades bilder av a wide-fältet fluorescensmikroskopi, (ii) STORM på xy-planet, och (iii) STORM efter rotation. 3D-filmer motsvarande celler i paneler A, visas B, Coch D i filmer S1, S2, S3 och S4, respektive. Skala barer = 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kemikalier | Stamlösning | Slutlig koncentration |
| glukos | EJ TILLÄMPLIGT | 10% (w/v) |
| Tris-Cl (pH 8,0) | 0,5 M | 50 mM |
| Askorbinsyra | 100 mM | 1 mM |
| Metyl viologen | 100 mM | 1 mM |
| Cyclooctatetraene | 200 mM | 2 mM |
| TCEP | 0,5 M | 25 mM |
| Glukosoxidas | 56 mg/ml | 0.56 mg/ml |
| Katalas | 4 mg/ml | 40 µg/ml |
Tabell 1: Recept för imaging bufferten.
Film S1: kluster av FtsZ proteiner hos Prochlorococcus MED4 celler. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Film S2: en ofullständig ring av FtsZ proteiner hos Prochlorococcus MED4 celler. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Film S3: en komplett ring av FtsZ proteiner hos Prochlorococcus MED4 celler. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Film S4: en dubbel-ring av FtsZ proteiner hos Prochlorococcus MED4 celler. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll, beskrev vi ett förfarande för att avsevärt minska autofluorescens av Cyanobakterien Prochlorococcus (figur 3 c) och, sedan immunostain proteinerna i cellerna, vilket gjorde det möjligt för oss att utnyttja STORM för att studera den 3D-FtsZ Ring morfologier i Prochlorococcus (figur 4). Detta protokoll kan antas för super-upplösning imaging i andra fotosyntetiska organismer.
Tidigare studier på fotosyntetiska organismer används främst SIM för att uppnå super-upplösning imaging eftersom SIM inte kräver lasrar av hög intensitet. Den rumsliga upplösningen i SIM är dock endast ~ 100 nm1, vilket är mycket lägre än för STORM. I denna studie den rumsliga upplösningen i STORM bilder kunde nå 9,6 nm i xy-planet och 41,6 nm i z-9. Förbättrad upplösning som tillhandahålls av fotoblekning och STORM imaging tillåter forskare att studera fotosyntetiska organismer i oöverträffad detaljrikedom.
Fotoblekning före stormen är ett viktigt steg som gör att forskare att iaktta de läge och dynamiken i proteiner i autofluorescent organismer. Förutom cyanobakterier, har vi visat att autofluorescens av blommande växten Arabidopsis thaliana kunde också kvävas efter 60 min fotoblekning9. Fotoblekning har använts, till exempel för att förbättra signal-brus-förhållandet och visualisering av flera biomarkörer sekventiellt20. Det var också visat att fotoblekning innan imaging är fördelaktigt när observerar en autofluorescens prov enligt Raman spektroskopi21. Därför kan det vara genomförbart att tillämpa denna fotoblekning metod för att minska autofluorescens andra fotosyntetiserande organismer, inklusive eukaryota alger, kärlväxter och organismer som innehåller proteorhodopsin och bacteriochlorophyll.
Fotosyntetiska organismer innehåller olika pigment som har olikt Absorberingsspectra; Därför behöver organiska färgämnen och fluorescerande proteiner väljas försiktigt. Till exempel i denna studie, ett färgämne med en högsta magnetiseringen våglängd på cirka 750 nm användes. Även om två kanaler (750 nm och 650 nm) tillgängliga för STORM presenteras här, Prochlorococcus autofluorescent signaler kan fortfarande observeras efter att exponeras under en 650-nm laser, även efter långvarig fotoblekning. Detta är förmodligen eftersom 650 nm är en av de största absorption våglängderna för Prochlorococcus. Å andra sidan, vissa Synechococcus och röda alger innehåller fykoerytrin som deras pigment22, som har ett absorptionsspektrum från 488 nm till 560 nm och en minimal absorption vid 650 nm23. Därför kan det vara möjligt att använda en 650-nm kanal istället för en 750-nm för att studera proteinerna inom dessa fykoerytrin-innehållande autotrofer.
Sammanfattningsvis ger en korrekt kombination av fotoblekning och STORM en kraftfull metod för att förstå protein organisationen i fotosyntetiska celler i detalj, vilket ytterligare kommer att avslöja deras dynamik och potential funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Daiying Xu för hennes tekniskt stöd och synpunkter på manuskriptet. Denna studie stöds av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (projektnummer 41476147) och beviljar Vetenskapsrådet för den särskilda administrativa regionen Hongkong, Kina (projektnummer 689813 och 16103414).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser? Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
