Summary
ここで藍藻類の蛍光を抑えるフォトブリーチング法について述べる。退色後は、確率光再建顕微鏡 FtsZ リングがシアノ バクテリアの三次元超解像度画像を得るためです。
Abstract
超解像顕微鏡法は、蛋白質の相互作用および多くの生物で細胞内構造について研究に広く使用されています。光合成生物でただし、超解像イメージングの空間分解能はのみ ~ 100 nm。低解像度は、主に確率論的光再建顕微鏡 (嵐) などの超解像イメージングに必要な高強度レーザーによる光合成細胞の高い蛍光バック グラウンドによるものです。ここでは、述べるフォトブリーチングによる嵐開発された海洋 picocyanobacteriumプロクロロコッカスをイメージングの最近。その嵐は ~ 10 の水平解像度で実行できるので退色後、プロクロロコッカスの蛍光は減ります nm。このメソッドを使用して、我々 は FtsZ タンパク質の生体内三次元 (3 D) 組織を取得し、プロクロロコッカスの細胞周期の間に 4 つの異なる FtsZ リング形態の特徴します。我々 はここで説明するメソッドは、他の光合成生物の超解像イメージングに採用される可能性があります。
Introduction
超解像顕微鏡は光の回折限界を打破し、サブ回折解像度 (< 200 nm) 内のイメージを提供できます。彼らは蛋白質のローカリゼーションおよび細胞レベル下の構造について研究する多くの生物において広く使用でされています。超解像顕微鏡検査方法は、構造化照明顕微鏡を用いて (SIM) の主要なセンサー ローカリゼーション顕微鏡 (ヤシ)、嵐、枯渇顕微鏡 (STED) を刺激します。メカニズムと顕微鏡がされているこれらの超解像度のアプリケーションの見直し他1,2。
嵐が 10 と高解像度を達成できる空間的な分離3,4nm。嵐、回折限界領域内で 1 つだけの分子は (「上」) 活性化と分子の残りの部分が ("off") 不活化されます。迅速なスイッチのと - 単一分子の蓄積、「回折無制限」画像生成された3できます。一方、有機染料、蛍光タンパク質の多くの種類は、嵐、通常蛍光顕微鏡から高分解能顕微鏡5,6への簡単なアップグレードを可能に適用されます。
嵐が藻類、シアノ バクテリアなどの光合成細胞に広く適用されていない植物細胞葉緑体7、8、その嵐であるという事実のためには、ドライブのスイッチングに高レーザー強度を必要とします。高強度レーザーは不利な光合成細胞の蛍光が強い背景を励起し、嵐イメージングにおける単一分子局在を妨げます。細胞レベル下の構造または光合成細胞の蛋白質の相互作用を調査する嵐を使用するためには、バック グラウンド蛍光信号9を癒やすため退色プロトコルを開発しました。ルーチン蛍光染色の手順で標本は嵐のための要件を満たすために光合成細胞の蛍光を下げる妨害のステップ中に高輝度の白色光にさらされます。したがって、このプロトコルの場合、嵐と色素の有機体を調査することは不可能になります。
ここでは、単細胞 picocyanobacteriumプロクロロコッカスで FtsZ リング組織を画像に嵐を使用するプロトコルについて述べる。FtsZ は非常に節約されたチューブリンのような細胞骨格タンパク質10セルの外周リング構造 (Z のリング) を形成する重合、細胞分裂11のために不可欠です。プロクロロコッカスは保持細胞が蛍光背景と主アンチ FtsZ 抗体 immunostained を削減する最初の photobleached と、fluorophore と二次抗うさぎ IgG (H + L) 抗体の共役し (など、Alexa Fluor 750)。最終的には、嵐を使用して、異なる細胞周期段階プロクロロコッカス詳細の FtsZ リング組織を観察します。
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Protocol
1. 試料の調製及び固定
- 海水ベース Pro99 中12の 5 mL を無菌プロクロロコッカスMED4 1 mL を接種します。5 日後 35 µmol 光子/m2s の強度と光の下で 23 ° cプロクロロコッカス文化を育てる、1.5 mL チューブに文化の 1 mL を集めます。
注: 接種後 5 日間プロクロロコッカスMED4 がフェーズに到達、後半ログ約 108セル/ml、嵐イメージングのために適切であります。 - 文化を修正する 1.5 mL チューブに作りたての 25% パラホルムアルデヒド (PFA) (w/v) からホルムアルデヒドの 100 μ L と 50% グルタールアルデヒド 2 μ L を追加します。20 分間室温で暗闇の中でサンプルをインキュベートします。
注: サンプルいた固定のため暗闇の中グルタルアルデヒドが軽いのため敏感です。 - スピン ・ ダウン 1 分; 13,500 x gでサンプル上澄みを除去し、Pro99 中12の 100 μ L に細胞を再懸濁します。免疫染色まで 4 ° C のサンプルを格納します。
2. ポリスチレン ビーズ Coverslip プレコート
注: ポリスチレン ビーズはドリフトの補正のための画像マーカとして考慮されます。
- 渦元ポリスチレン ビーズのバイアルし、1:20,000 で希釈する作業スラリーとして 50% エタノールを準備します。
- ホット プレートをオンに、120 ° C に温度を設定し、ホット プレート coverslips を配置します。
- 各 coverslip に作業スラリーの 100 μ L をロードします。10 分間ホット プレート上 coverslip のインキュベートし、その後、慎重に室温で保管用シャーレに、coverslips を転送します。
注: 上、それに接続されているビーズが付いている側面に向き、セルは同じ側に接続する必要があります。ビーズは、coverslips に固定化した、サンプルの漂流を修正するために使用される嵐イメージング中にリアルタイム。ビーズを固定後、coverslips が燃え上がることはできません。
3. ビーズ コーティング Coverslip の上にポリ-L-リジンのコーティング
注: シアノ バクテリア細胞の固定化のためこれです。
- ビーズ コーティング面を上に向けて、coverslip の中心にポリ-L-リジン (1 mg/mL) の 100 μ L を追加します。室温で 30 分間座ってみましょう。
- ピペットを使用して、慎重に未接続ポリ L リジンを熱望して 1.5 mL チューブにそれを転送します。再利用のための 4 ° C でポリ L リジンを保存します。
- 60 mm のペトリ皿に 10 ml の超フィルター水 coverslip をすすいで coverslip ペーパー タオルの上に簡潔に乾かします。
- ペトリ皿 (100 mm) 後で使用のために、coverslip を格納します。皿に、カバーガラスの添付ファイルを防ぐため、パラフィルムの層でシャーレを行します。
注: ビーズとポリ-L-リジン、プレコート、coverslip は室温で少なくとも半年は、格納できます。したがって、事前に coverslips のバッチを準備する勧めします。
4. 上の細胞の固定化
- プレコート coverslip を今後染色皿と呼ばれる、下部パラフィルムで新しいペトリ皿に転送します。100 μ L の上、固定のサンプルを読み込むし、携帯添付できるように 30 分間座ってみましょう。
- 今後洗濯料理と呼ばれる、12 ウェルのプレートのウェルに、coverslip を転送します。Coverslip を洗浄する井戸をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (10 mM ナ2HPO4、1.8 mM KH2PO4、137 mM NaCl と KCl、2.7 mM の pH 7.4) の 1 つの mL を追加します。PBS バッファーを削除し、再度、coverslip を洗浄する新しい PBS バッファーを追加します。
5. シアノ バクテリア細胞の透過
- ピペットを使用して PBS バッファーを削除します。0.05% 非イオン性の洗剤-100 (v/v)、10 ミリメートルの EDTA、10 mM トリス (pH 8.0) と 0.2 mg/mL リゾチームを含む洗濯料理のほかに 1 mL の作りたて透過バッファーを追加します。
- 37 ° C、20 分で洗濯料理を孵化させなさい。透過バッファーを削除します。
- PBS バッファーの 1 つの mL を追加し、5 分 PBS バッファーを削除するために洗濯料理を優しく振るシェーカーで洗濯皿を置きます。3 x、coverslip を洗浄するこの手順を繰り返します。
6. クロロフィルの退色顔料ブロックの手順で
- 染色の皿、coverslip に転送します。0.2% (v/v) 非イオン性洗剤 100 と、coverslip の上の 3% (v/v) ヤギ血清を含むブロック バッファーの 50 μ L を追加します。
- 氷の上の皿を汚す全体を置き、1,800 µmol 光子/m2·s で光強度を少なくとも 60 分フォトブリーチング用キセノン光源の下に移動します。
- 退色とブロックの後に、ペーパー タオルの端に吸着させることによりブロック バッファーを慎重に取り外します。
注: キセノン ライトの強度が高いので適切なサングラスが目の保護のため必要であります。一方、光源と目の損傷を引き起こす可能性があります、光の漏れを避けるためにアルミ箔を使用してプレートをラップします。Coverslip 15 分毎、coverslip しっとりしていることを確認するチェックしてください。Coverslip が乾燥している場合は、バッファーの妨害の 50 μ L を追加します。
7. 抗体の結合
- 製造元の指示に従って水を 200 μ l 添加の反アナベナFtsZ 抗体を溶解します。
- 1 μ L のブロック バッファーの 99 μ L にアンチ FtsZ 抗体を希釈します。上、希釈した一次抗体の 50 μ L を追加し、30 分間室温でインキュベートします。
- 洗濯料理、coverslip に転送します。PBS バッファーの 1 つの mL を追加し、ふれ洗濯皿を置きます。軽くこの手順、coverslip を洗浄する 3 x 5 分繰り返し洗濯料理を振る。
- 染色の皿、coverslip に転送します。500 μ L のブロック バッファーに二次抗体の 1 μ L を希釈します。Coverslip の上に希釈した二次抗体の 50 μ L を追加し、室温で暗闇の中で 30 分間インキュベートします。
- 洗濯料理、coverslip に転送します。シェーカーで PBS バッファーの 1 つの mL で洗います。そっと振って 5 分ラップ洗浄皿アルミ紙に耐光性それを洗濯料理。3 x この手順を繰り返します。
- 500 μ L のホルムアルデヒド 4% パラホルムアルデヒド (PFA) (w/v) から作りたてを井戸に追加します。Coverslip 室温で暗闇の中で 15 分間、インキュベートします。
- ホルムアルデヒドを削除し、洗浄のステップ 3 倍を繰り返します。
- 暗闇の中で 4 ° C で PBS バッファーにイメージングまで、coverslip を格納します。
8. バッファーをイメージング嵐の準備
- 嵐画像の直前にテーブル 1によるとバッファーをイメージングの 1 mL を準備します。
注: 画像バッファーの寿命は約 2 時間、準備の使用前に、新鮮です。グルコース酸化酵素、カタラーゼの付加の後のボルテックスを避けてください。
注意: メチルビオロゲンは有害な物質です。特に注意して処理してください。シクロオクタテトラエンは猫の発癌物質として分類されます。1 化学。吸入を避ける、皮膚化学フード シクロオクタテトラエン原液とイメージングのバッファーを作るしてください。
9. 嵐データの取込み
- チャンバー (図 1) の coverslip をロードします。シアノ バクテリア細胞を洗浄避けるために商工会議所に優しく新鮮画像バッファーを読み込みます。空気中の酸素との反応を防ぐために画像処理のバッファーの上部にある長方形の coverslip を配置します。トラップ、coverslip の下に気泡を避けるため。
- カメラ、LED ライトとレーザーを入れます。画像集録、重心位置の決定、漂流訂正13サンプル用オープン ・嵐ソフトウェア。
- レンズの上に液浸オイルの半分ドロップを追加します。商工会議所を読み込み、目的のレンズを確認、coverslip に接触します。
- 750 nm レーザーで信号を確認します。
注: 常に、蛍光は減少することを確認する第 2 抗体染色マイナスのネガティブ コントロールを含めます。 - セルとマーカを含むサンプル領域を識別します。ドリフト補正サンプル ソフトウェアを起動します。
注: 一般に、理想的なサンプル エリアが 10-30 セルには含まれます。一方、任意の重複しているセルを避けるためにもセルを区切る必要があります。 - 参照として 1 つの広視野画像を取得、カメラ電子乗算 (EM) と 300 で露出時間 30 ms (図 2 a) を得る。
- ハイパワー約 4.5 kW/cm2に 750 nm 励起レーザー強度を高めます。Fluorophores が付いているまばらな点滅パターンに移行して、一度は、10,000 フレーム 33 hz (図 2 b) を集めることによって 1 つの超解像画像を取得します。
注: フルオロ孤立した場合は、数分以上 fluorophores が付いて暗い状態に切り替わるし、隔離された単一分子の順番にちらつきまで待ちます。ここで説明したフレーム数は、我々 のサンプルに適しています、他の対象となる構造物の最適化が必要があります。
10. 生データから超解像画像の再構成
- ImageJ でQuickPALM (材料表)14と呼ばれるプラグインを使用すると、3-D の色超解像画像を再構築します。
注: 予備波長画像 (図 2) 色分けされたスケール バーと共に (図 2) が表示されます。色は、z 軸の深さを表します。 - 3次元構造のビデオ、構造で超解像のスタックを示す z 軸画像断面ごとの 10 nm QuickPALM14を使用しています。スタックの明るさを調整し、1 つのターゲット セルのスタックを複製します。セルの 3 D イメージを生成するのに ImageJ で3D ビューアー (材料表)15と呼ばれるプラグインを使用します。デモ用 3次元構造の回転を記録します。
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Representative Results
嵐は、確率的個々 スイッチング蛍光物質を活性化して超解像イメージングを実現します。すべての蛍光体の位置が記録され、これらの場所4に基づく超解像画像を構築します。したがって、fluorophore 位置の精度は超解像画像再構成のために重要です。プロクロロコッカス吸収スペクトル ピーク 447 nm および 680 nm、およびプロクロロコッカスは、波長 700 nm16上最小吸収。ただし、プロクロロコッカスMED4 細胞はまだ嵐イメージングに必要な (図 3 a)、750 nm レーザーの非常に高い強度に露出されたとき高い蛍光を放出しました。したがって、プロクロロコッカス細胞の高い蛍光バック グラウンドは超解像イメージングを大きく妨げます。
プロクロロコッカスでタンパク質の組織を調査する嵐を利用するためには、フォトブリーチング法を開発しました。後 30 分の高輝度の白色光への暴露、プロクロロコッカスMED4 細胞の蛍光減少 (図 3 b)、蛍光で複数のセルがまだ検出されました。我々 はさらに 60 分退色時間の伸長し、細胞の大半が彼らの蛍光 (図 3) を失ったことを発見します。ここで開発したフォトブリーチング法が光合成生物で蛍光を大幅に短縮できることが示唆されました。
退色後、我々 は嵐を使用して細胞分裂蛋白質プロクロロコッカスで FtsZ を視覚化することができたMED4 細胞。シアノ バクテリアプロクロロコッカスは最小と地球17の最も豊富な光合成の有機体。プロクロロコッカスセルの直径は唯一 500-700 nm18です。このような小さいセルのサイズと、従来の広視野の蛍光顕微鏡検査 (図 2 a)プロクロロコッカス細胞における FtsZ リング組織を可視化することが可能はにくい。ただし、嵐の 9.6 の空間解像度、z 軸の xy 平面と 41.6 nm nm。嵐を使用すると、FtsZ リングはプロクロロコッカス(図 2 bと4) の詳細な形態を明らかにすることができました。嵐の 3次元画像を回転させることにより我々 は FtsZ リング形態の 4 種類を識別: クラスター (図 4 a、映画 S1)、不完全なリング (図 4 b、映画 S2)、(図 4 C、完全なリング映画 S3)、二重リング (図 4 D、映画 S4)。ギャップは、 Caulobacter cresentus19で発見に似ているプロクロロコッカス(図 4、映画 S3) の完全な FtsZ リングで観察されました。FtsZ リング形態のこれらの 4 つのタイプは、プロクロロコッカスの細胞周期中に FtsZ リングの組み立てを示し、本研究では、プロクロロコッカスの細胞分裂中に FtsZ リングの役割を理解することができました9。
図 1: 載荷室と嵐イメージング coverslips とイメージングのバッファーと組み立て室のコンポーネント。サンプルに coverslip が最初の底の部分の溝に置かれました。上部は、底の部分に慎重にねじ込むだった。画像バッファー、チャンバーに添加し、正方形の coverslip で慎重に覆われています。泡は測定の確度に影響を与える可能性があります任意の動きを最小限に抑えるために避けなければなりません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表的な広視野、2 D 嵐および 3 カラープロクロロコッカスMED4 の FtsZ の嵐画像。画像は通常 (A) 広視野顕微鏡、(B) 2 D 嵐および (C) を使用してビューの同じフィールドから撮影された 3-D の色の嵐。パネルCの色は、z 軸上の蛍光信号の深さを示します。パネルCの数字は、興味のセルを表します。スケール バー = 1 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:プロクロロコッカスMED4 のフォトブリーチング。プロクロロコッカスMED4 を固定セルがない photobleached は、(A) または (B) の photobleached 30 分、(C) 60 分。XD 300 キセノン光が使用された 1,800 µmol/m2·s. の強度で細胞興奮していた同じ強度で 750 nm のレーザーで、使われた嵐イメージングのため。Autofluorescences は、嵐に影響を与える蛍光が最小限の存在を確認する嵐で使われている同じフィルターをイメージしました。スケール バー = 2 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 4 つの FtsZ リング形態の代表的な嵐画像。4 つの異なる FtsZ リング形態観察されたプロクロロコッカス: クラスター (A)、(B) 不完全なリング、(C) 完全なリングと (D) 二重リング。同じセルの回転の後の (i) ワイド フィールド蛍光顕微鏡、xy 平面上の嵐 (ii) と (iii) 嵐のイメージが示されていた。パネルA内のセルに対応する 3 D 映画、 B C、およびDに表示されます映画 S1、S2、S3、および S4、それぞれ。スケール バー = 500 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 化学物質 | 原液 | 最終濃度 |
| グルコース | N/A | 10% (w/v) |
| トリス Cl (pH 8.0) | 0.5 M | 50 mM |
| アスコルビン酸 | 100 mM | 1 mM |
| メチルビオロゲン | 100 mM | 1 mM |
| シクロオクタテトラエン | 200 mM | 2 mM |
| TCEP | 0.5 M | 25 mM |
| グルコースオキシダーゼ | 56 mg/ml | 0.56 mg/ml |
| カタラーゼ | 4 mg/ml | 40 μ g/ml |
表 1: 画像バッファーのレシピ。
ムービー S1: FtsZ タンパク質のクラスター観察でプロクロロコッカスMED4 セル。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
映画 S2: FtsZ タンパク質の不完全なリングで観察されたプロクロロコッカスMED4 セル。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
映画 S3: FtsZ タンパク質の完全なリングで観察されたプロクロロコッカスMED4 セル。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
映画 S4: FtsZ タンパク質の二重リングで観察されたプロクロロコッカスMED4 セル。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
このプロトコルでは、ラン藻プロクロロコッカス(図 3) の蛍光を大幅に削減するための手順について説明しましたし、その後、immunostain 3-D FtsZ を勉強する嵐を利用することを可能にした細胞のタンパク質リング形態プロクロロコッカス(図 4)。このプロトコルは、他の光合成の有機体で超解像イメージングに採用される可能性があります。
光合成生物に関する過去の研究は、主に超解像イメージング SIM は、高強度のレーザーを必要としないので達成するために SIM を使用しました。ただし、SIM の空間分解能であるのみ ~ 100 nm の1、嵐よりもずっと低い。本研究では嵐画像の空間分解能は 9.6 を達することができる9z 軸の xy 平面と 41.6 nm nm。退色と嵐画像の改良された解像度では、前例のない詳細の光合成生物を研究する研究者をことができます。
嵐の前に退色は場所とされる生物におけるタンパク質の動態を観察する研究者を可能にする重要なステップです。ほかにシアノ バクテリア、シロイヌナズナは、退色9の 60 分後急冷することが植物の開花の蛍光を示しています。変質広く使用されています、例えば信号対雑音比と複数バイオ マーカーの可視化を順次改善するため20。それはまたイメージングが有利なラマン分光法21の下で蛍光サンプルを観察する前に、その退色を示した。したがって、他の光合成生物、真核生物の藻類、維管束植物プロテオロドプシンとバクテリオ クロロフィルを含んでいる生物などの蛍光を抑えるこのフォトブリーチング法を適用することは不可能ででしょう。
光合成生物に; 別の吸収スペクトルを持っている別の顔料が含まれています。したがって、有機色素と蛍光タンパク質は慎重に選択する必要があります。たとえば、本研究では、約 750 の最大励起波長で染料の nm が使用されました。二つのチャンネルが (750 nm、650 nm) 嵐のため利用可能なここに提示されます、プロクロロコッカス蛍光信号まだ観察できる長期間退色後も 650 nm レーザーの下にさらされた後。これはおそらく、650 nm はプロクロロコッカスの主要な吸収波長の 1 つです。その一方で、いくつか導入したと紅藻 488 からの吸収スペクトルを有する顔料22に彼らとしてフィコエ リスリンを含む 560 nm nm、650 nm23最小吸収。したがって、これらのフィコエ リスリンを含む光合成内蛋白質を研究する 750 nm チャネルの代わりに 650 nm のチャネルを使用する可能ででしょう。
要約すると、退色と嵐の適切な組み合わせは、詳しくは、ダイナミクスと潜在的な機能をさらに明らかにする光合成細胞でタンパク質の組織を理解するための強力なアプローチを提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、彼女のテクニカル サポートと原稿のコメントありがとう Daiying 徐。本研究は、中国の国家自然科学基金 (プロジェクト番号 41476147) からの助成金、研究助成金の評議会は、香港特別行政区、中国 (プロジェクト番号 689813 および 16103414) でサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
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