Summary
Her beskriver vi en photobleaching metode for å redusere autofluorescence av Cyanobakterie. Etter photobleaching brukes stokastiske optisk rekonstruksjon mikroskopi til å få tredimensjonal super-oppløsning bilder av cyanobacterial FtsZ ringen.
Abstract
Super-oppløsning mikroskopi er mye brukt til å studere protein interaksjoner og subcellular strukturer i mange organismer. I fotosynteseaktiviteten organismer, men lateral oppløsningen på super-oppløsning imaging er bare ~ 100 nm. Den lave oppløsningen skyldes i hovedsak høye autofluorescence bakgrunnen fotosynteseaktiviteten celler forårsaket av høy intensitet lasere som kreves for super-oppløsning bildebehandling, som Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM). Her beskriver vi en photobleaching-assistert STORM metode som ble utviklet nylig for imaging marine picocyanobacterium Prochlorococcus. Etter photobleaching, autofluorescence av Prochlorococcus effektivt reduseres slik at STORM kan utføres med en lateral oppløsning på ~ 10 nm. Bruker denne metoden, vi skaffe i vivo tredimensjonale (3D) organiseringen av FtsZ protein og karakterisere fire ulike FtsZ ring morphologies under cellen syklus av Prochlorococcus. Metoden som beskrives her kan vedtas for super-oppløsning avbilding av andre fotosynteseaktiviteten organismer.
Introduction
Super-oppløsning microscopies kan bryte Diffraksjon grensen av lys og gir bilder i sub Diffraksjon oppløsninger (< 200 nm). De har vært mye brukt i mange organismer protein lokalisering og subcellular strukturer. Store super-oppløsning mikroskopi metodene omfatter strukturert belysning mikroskopi (SIM), stimulert utslipp uttømming mikroskopi (STED), STORM og photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM). Mekanismer og bruk av disse super-oppløsning mikroskop har vært vurdert andre steder1,2.
STORMEN kan oppnå så høy som 10 oppløsning nm av romlige separasjon3,4. For STORM, bare ett molekyl innenfor et Diffraksjon-begrenset område er aktivert ("på") og resten av molekyler blir holdt deaktivert ("off"). En opphopning av rask slå på- og - ut av enkelt molekyler, kan en "Diffraksjon-ubegrenset" bilde være generert3. I mellomtiden, mange typer organisk fargestoffer og fluorescerende proteiner gjelder i STORM, slik at en enkel oppgradering fra vanlige fluorescens mikroskopi til høy oppløsning mikroskopi5,6.
STORMEN har ikke vært mye brukt i fotosynteseaktiviteten celler, for eksempel Cyanobakterie, alger, og anlegget celler med chloroplasts7,8, som skyldes faktum at STORM krever høy laser intensitet for å kjøre photoswitching. Høy intensitet laser unfavorably interesserer sterk autofluorescence bakgrunn i fotosynteseaktiviteten celler og forstyrrer den single-molekyl lokaliseringen i STORM bildebehandling. Bruke STORM for å undersøke subcellular strukturer eller protein interaksjoner i fotosynteseaktiviteten celler, utviklet vi en photobleaching protokoll for å slukke bakgrunn autofluorescence signaler9. I en rutinemessig immunofluorescent flekker prosedyre, er prøver utsatt for hvitt lys med en høy intensitet under det blokkerende trinnet, som senker autofluorescence fotosynteseaktiviteten celler som oppfyller kravene for STORM. Dermed gjør denne protokollen det mulig å undersøke pigmentert organismer med STORM.
Her beskriver vi protokollen for å bruke STORM for å image FtsZ ring organisasjonen i den encellede picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ er en høyt konservert tubulin-lignende cellen cytoskjelett proteiner som polymerizes for å danne en ring struktur (Z ringen) rundt omkretsen av en celle10 og er avgjørende for celledeling11. Bevart Prochlorococcus cellene er første photobleached å redusere autofluorescent bakgrunnen og immunostained med et primære anti-FtsZ antistoff, og deretter en sekundær anti-kanin IgG (H + L) antistoffer blir bøyd med en fluorophore (f.eks , Alexa Fluor 750). Til slutt, brukes STORM til å observere de detaljerte FtsZ ring organisasjonene i Prochlorococcus under forskjellige cellen syklus faser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøv forberedelse og fiksering
- Vaksinere 1 mL av axenic Prochlorococcus MED4 til 5 mL av sjøvann-baserte Pro99 middels12. Vokse Prochlorococcus kulturer på 23 ° C under lys med en intensitet av 35 µmol fotoner/m2s. fem dager senere, samle 1 mL av kultur i en 1.5-mL tube.
Merk: Fem dager etter vaksinasjon, Prochlorococcus MED4 vil nå slutten Logg fasen, med ca 108 cellen/mL, som er passende for STORM bildebehandling. - Legg 100 µL av formaldehyd nylagde fra 25% paraformaldehyde (PFA) (w/v) og 2 µL av 50% glutaraldehyde inn i 1,5-mL røret å løse kultur. Inkuber prøven i mørket ved romtemperatur for 20 min.
Merk: Utvalget ble holdt i mørket fiksering fordi glutaraldehyde er lys følsom. - Nedspinning prøven 13.500 x g for 1 min; deretter fjerne nedbryting og resuspend cellene i 100 µL av Pro99 medium12. Lagre prøven på 4 ° C til immunostaining.
2. precoating av dekkglassvæske med polystyren perler
Merk: Polystyren perler regnes som fiducial merket drift korreksjon.
- Vortex originalen medisinglass av polystyren perler og forberede en 1:20,000 fortynning med 50% etanol som arbeider slurry.
- Slå på kokeplate, Still inntemperaturen 120 ° c og plassere coverslips på kokeplate.
- Legg 100 µL av arbeider slurry til hver dekkglassvæske. Inkuber dekkglassvæske på kokeplate på 10 min og deretter overføre nøye på coverslips til Petri retter for lagring ved romtemperatur.
Merk: Siden med perler tilknyttet skal være vendt opp, og cellene skal legges på samme side. Perler er immobilisert på coverslips og brukes til å korrigere det prøve-drivende i sanntid under STORM bildebehandling. Etter immobilizing perler, kan ikke coverslips være flammet.
3. coating av Poly-L-lysine på perle-belagt dekkglassvæske
Merk: Dette er gjort for immobilisering av cyanobacterial celler.
- Legge til 100 µL av poly-L-lysine (1 mg/mL) i midten av dekkglassvæske med perle-belagt siden vendt opp. La det sitte i 30 min ved romtemperatur.
- Bruke en pipette nøye aspire fristilt poly-L-lysine og overføre den til en 1.5-mL tube. Lagre poly-L-lysine på 4 ° C for gjenbruk.
- Skyll dekkglassvæske med 10 mL ultra filtrert vann i en 60 mm Petriskål og tørk kort dekkglassvæske på et papirhåndkle.
- Lagre dekkglassvæske i en Petriskål (100 mm) for senere bruk. For å hindre feste dekkglassvæske fatet, linje Petriskål med et lag av parafilm.
Merk: Dekkglassvæske, precoated med perler og poly-L-lysin, kan lagres i romtemperatur i minst et halvt år. Derfor anbefales forberede en gruppe med coverslips på forhånd.
4. immobilisering av celler i dekkglassvæske
- Overføre en precoated dekkglassvæske til en ny Petriskål med parafilm nederst, som vil bli referert til som flekker retten heretter. Last 100 µL av fast prøven på dekkglassvæske og la det sitte i 30 min å tillate celle vedlegg.
- Overføring av dekkglassvæske til et godt av en 12-vel plate, som vil bli referert til som vask parabolen heretter. Legge til 1 mL av fosfat-bufret saltvann (PBS) (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl og 2,7 mM KCl, pH 7.4) godt å vaske dekkglassvæske. Fjern PBS bufferen og legge en ny PBS buffer å vaske dekkglassvæske igjen.
5. permeabilization Cyanobacterial celler
- Fjerne PBS bufferen bruker en pipette. Legge til 1 mL av ferskt tilberedte permeabilization buffer av vask rett, som inneholder 0,05% ikke-ioniske vaskemiddel-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8.0) og 0,2 mg/mL lysozyme.
- Inkuber vask retten på 37 ° C for 20 min. Deretter Fjern bufferen som permeabilization.
- Legg 1 mL av PBS buffer og plasser vask rett på en shaker som forsiktig rister vask parabolen for 5 min. fjerner PBS bufferen. Gjenta dette trinnet 3 x å vaske dekkglassvæske.
6. Photobleaching av klorofyll pigmenter på en blokkering
- Overføring av dekkglassvæske til flekker retten. Legge til 50 µL av blokkering buffer, som inneholder 0,2% (v/v) ikke-ioniske vaskemiddel-100 og 3% (v/v) geit serum, på toppen av dekkglassvæske.
- Plasser hele flekker plate på isen og flytte den under xenon lyskilden for photobleaching i minst 60 minutter, med lav intensitet på 1800 µmol fotoner/m2·s.
- Etter photobleaching og blokkering, nøye fjerne blokkering bufferen ved adsorbing det med kanten av et papirhåndkle.
Merk: Intensiteten av Xenonlys er så høy at et par riktig solbriller er nødvendig for vernebriller. I mellomtiden bryte lyskilden og plate med aluminiumsfolie for å unngå lekkasje av lys, som kan skade øyet. Kontroller dekkglassvæske hvert 15 min at dekkglassvæske fortsatt er fuktig. Hvis dekkglassvæske tørr, Legg 50 µL blokkerer bufferen.
7. antistoff Binding
- Oppløse anti -Anabaena FtsZ antistoffer i 200 µL av vann i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fortynne 1 µL av anti-FtsZ antistoffer til 99 µL blokkerer bufferen. Legg til 50 µL utvannet primære antistoff på dekkglassvæske og ruge det ved romtemperatur for 30 min.
- Overføring av dekkglassvæske til vask parabolen. Legg 1 mL av PBS buffer og plasser vask rett på en riste. Forsiktig risting vask parabolen for 5 min. Gjenta dette trinnet 3 x å vaske dekkglassvæske.
- Overføring av dekkglassvæske til flekker retten. Fortynne 1 µL av en sekundær antistoff til 500 µL blokkerer bufferen. Legg til 50 µL utvannet sekundære antistoff på dekkglassvæske og ruge det i 30 min i mørket ved romtemperatur.
- Overføring av dekkglassvæske til vask parabolen. Vask det med 1 mL av PBS bufferen på en shaker. Forsiktig risting vask parabolen for 5 min. Wrap vask parabolen med aluminium papir å gjøre det lystette. Gjenta dette trinnet 3 x.
- Legg til 500 µL av formaldehyd nylagde fra 4% paraformaldehyde (PFA) (w/v) i brønnen. Inkuber dekkglassvæske i 15 min i mørket ved romtemperatur.
- Fjern formaldehyd og gjenta vask trinn 3 x.
- Lagre i dekkglassvæske i PBS buffer ved 4 ° C i mørket til bildebehandling.
8. forberedelse av STORM Imaging Buffer
- Forberede 1 mL av imaging bufferen etter tabell 1, umiddelbart før STORM avbilding.
Merk: Holdbarheten av tenkelig bufferen er ca 2 timer, forberede den friske, rett før bruk. Unngå vortexing etter at gluko og catalase.
FORSIKTIG: Methyl viologen er giftig materiale. Kan håndtere det med spesielle. Cyclooctatetraene er klassifisert som et karsinogen katten. 1 kjemiske. Vennligst unngå innånding og hudkontakt for å gjøre cyclooctatetraene lagerløsning og tenkelig buffer i kjemisk hette.
9. bildeopptak STORM data
- Legg dekkglassvæske i lasting chamber (figur 1). Laste nylagde tenkelig buffer forsiktig inn i kammeret å unngå vaske av cyanobacterial celler. Plass en rektangulær dekkglassvæske på tenkelig bufferen for å hindre sin reaksjon med oksygen i luften. Unngå overtrykk luftbobler under dekkglassvæske.
- Slå på kameraet, LED-lys og laser. Åpne STORM programvare for bildeopptak, centroid posisjon besluttsomhet og prøve drivende korreksjon13.
- Legg til halv en dråpe neddyppingsolje på linsen. Last kammeret og kontroller at linsen av målet kommer i kontakt med dekkglassvæske.
- Undersøke signalet med en 750-nm laser.
Merk: Alltid inkludere en andre antistoff-minus-flekk negativ kontroll for å sikre at autofluorescence er redusert. - Identifisere et område som inneholder både celler og fiducial markører. Start programvaren for eksempel drivende korreksjon.
Merk: vanligvis et ideelt område inneholder 10-30 celler. I mellomtiden skal cellene skilles godt for å unngå noen overlappende cellene. - Hent en wide-field bilde som referanse, med kameraet elektron multiplikasjon (EM) få 300 og en eksponeringstid på 30 ms (figur 2A).
- Øke 750-nm eksitasjon laser intensiteten til en høyere makt, ca 4,5 kW/cm2. Når fluorophores har overført til en sparsom blinkende mønster, kjøpe en super-oppløsning bildet ved å samle 10.000 rammer på 33 Hz (figur 2B).
Merk: Hvis fluorophores ikke er isolert, vent et par minutter før mer fluorophores slår mørke staten og isolert enkelt molekylene blinke sekvensielt. Antall rammer som er beskrevet her er egnet for vårt eksempel og må være optimalisert for andre målrettede strukturer.
10. rekonstruksjon av super-oppløsning bilder fra rådata
- Bruke en plugin kalt QuickPALM (Tabell for materiale)14 i ImageJ for å rekonstruere en 3D-farge super-oppløsning bildet.
Merk: En foreløpig kromatisk bildet (figur 2C) sammen med en fargekodet skala bar (figur 2C) vises. Fargen representerer dybden på z-aksen. - Vise 3D-struktur i en video, konstruere en stabel av super-oppløsning bilder med z delt hver 10 nm Bruk QuickPALM14. Juster lysstyrken på stabler og kopiere av en Målcelle. Bruke en plugin kalt 3D-visningen (Tabell for materiale)15 i ImageJ for å generere 3D bildet av cellen. Registrere rotasjon av 3D strukturen for demonstrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
STORM oppnår super-oppløsning bildebehandling av personlige photoswitchable fluorophores stochastically. Plasseringen av hver fluorophore registreres og en super-oppløsning bildet er så konstruert basert på disse plasseringene4. Presisjonen for hvor fluorophore er derfor viktig for super-oppløsning bildet gjenoppbygging. Absorpsjon spektra av Prochlorococcus peak på 447 nm og 680 nm,og Prochlorococcus har et minimum absorpsjon på bølgelengder over 700 nm16. Prochlorococcus MED4 celler ut imidlertid fortsatt høy autofluorescence når de utsettes for en ekstremt høy intensitet av 750-nm laser (figur 3A), som kreves for STORM bildebehandling. Dermed påvirker høy autofluorescence bakgrunnen av Prochlorococcus celler sterkt super-oppløsning bildebehandling.
For å utnytte STORM undersøke protein organisasjoner i Prochlorococcus, utviklet vi en photobleaching metode. Etter eksponering for et hvitt lys med høy intensitet i 30 min redusert autofluorescence Prochlorococcus MED4 celler (figur 3B), selv om flere celler med autofluorescence fremdeles ble oppdaget. Vi ytterligere langstrakte photobleaching tiden til 60 min og fant at fleste cellene mistet sin autofluorescence (Figur 3 c). Disse resultatene indikerer at metoden photobleaching vi utviklet her kan sterkt redusere autofluorescence i fotosynteseaktiviteten organismer.
Etter photobleaching, kunne vi bruke STORM visualisere celledeling protein FtsZ i Prochlorococcus MED4 celler. Cyanobacterium Prochlorococcus er den minste og mest tallrike fotosynteseaktiviteten organisme på jorden17. Diameteren på en Prochlorococcus celle er bare 500-700 nm18. Med slik en liten Cellestørrelse er det umulig å visualisere FtsZ ring organisasjonen i Prochlorococcus celler ved hjelp av konvensjonelle wide-field fluorescens mikroskopi (figur 2A). STORM har imidlertid en romlig oppløsning på 9,6 nm i xy-fly og 41.6 nm i z-aksen. Bruker STORM, kunne vi avsløre en detaljert morfologi av FtsZ ringen i Prochlorococcus (tall 2B og 4). Roterende 3D STORM bilder, vi identifisert fire forskjellige typer FtsZ ring morphologies: klynger (figur 4A, Filmen S1), en ufullstendig ring (figur 4B, Filmen S2), en komplett ring (Figur 4 C, Filmen S3), og doble ringene (Figur 4 D, Filmen S4). Hullene ble observert i fullstendig FtsZ Ringenes Prochlorococcus (figur 4C, Filmen S3) som ligner som Caulobacter cresentus19. Disse fire typer FtsZ ringen morphologies viste monteringen av FtsZ ringen under cellen syklus av Prochlorococcus, og denne studien hjalp oss å forstå rollen FtsZ ringen under celledeling av Prochlorococcus 9.
Figur 1: komponenter i lasting kammeret og sammensatte chamber med coverslips og bildebehandling bufferen for STORM bildebehandling. Dekkglassvæske med prøven ble plassert i sporet i den nederste delen først. Den øvre delen var så nøye skruen på den nederste delen. Tenkelig bufferen ble lagt i lasting kammeret og deretter forsiktig dekket med en firkantet dekkglassvæske. Bobler bør unngås for å redusere enhver bevegelse som kan påvirke nøyaktigheten av måling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant wide-feltet, 2D-STORM og 3D farge STORM bilder av FtsZ i Prochlorococcus MED4. Bildene ble tatt fra samme synsfelt vanlig (A) wide-field mikroskopi, (B) 2D-STORM og (C) 3D-farge STORM. Fargene i C -panelet angir dybden av fluorescerende signalene på z-aksen. Tallene i C -panelet angir cellene rundt. Skala barer = 1 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Photobleaching av Prochlorococcus MED4. Fast Prochlorococcus MED4 celler var (A) ikke photobleached, eller de var photobleached til (B) 30 min og (C) 60 min. Xenonlys XD-300 ble brukt på en intensitet av 1800 µmol/m2·s. celler ble opphisset av en 750-nm laser på samme intensitet som ble brukt for STORM bildebehandling. Autofluorescences ble fotografert med de samme filtrene som brukes i STORM å sikre tilstedeværelsen av minimal autofluorescence å påvirke STORM. Skala barer = 2 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant STORM bilder av fire FtsZ ring morphologies. Fire ulike FtsZ ring morphologies ble observert i Prochlorococcus: (A) klynger, (B) en ufullstendig ring, (C) en komplett ring og (D) dobbel ringer. For samme celle, ble bilder av (i) wide-field fluorescens mikroskopi, (ii) STORM på xy-flyet, og (iii) STORM etter rotasjon vist. 3D film tilsvarer cellene i paneler A, vises B, Cog D i filmer S1, S2, S3 og S4, henholdsvis. Skala barer = 500 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kjemikalier | Lagerløsning | Siste konsentrasjon |
| glukose | I/T | 10% (w/v) |
| Tris-Cl (pH 8.0) | 0,5 M | 50 mM |
| Askorbinsyre | 100 mM | 1 mM |
| Methyl viologen | 100 mM | 1 mM |
| Cyclooctatetraene | 200 mM | 2 mM |
| TCEP | 0,5 M | 25 mM |
| Gluko | 56 mg/ml | 0.56 mg/ml |
| Catalase | 4 mg/ml | 40 µg/ml |
Tabell 1: Oppskrift på tenkelig bufferen.
Film S1: klynger av FtsZ proteiner observert i Prochlorococcus MED4 celler. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Film S2: en ufullstendig ring FtsZ proteiner observert i Prochlorococcus MED4 celler. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Film S3: en komplett ring FtsZ proteiner observert i Prochlorococcus MED4 celler. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Film S4: en dobbel-ring FtsZ proteiner observert i Prochlorococcus MED4 celler. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, vi beskrev en prosedyre for å redusere autofluorescence av cyanobacterium Prochlorococcus (Figur 3 c) og deretter immunostai proteinene i celler som mulig for oss å bruke STORM å studere det 3D FtsZ Ring morphologies i Prochlorococcus (Figur 4). Denne protokollen kan vedtas for super-oppløsning imaging i andre fotosynteseaktiviteten organismer.
Tidligere studier på fotosynteseaktiviteten organismer i hovedsak brukt SIM for å oppnå super-oppløsning imaging fordi SIM ikke krever lasere av høy intensitet. Den romlig oppløsningen på SIM er imidlertid bare ~ 100 nm1, som er mye lavere enn STORM. I denne studien romlig oppløsning av STORM bilder kunne nå 9.6 nm i xy-fly og 41.6 nm i z9. Forbedret oppløsning photobleaching og STORM bildebehandling kan forskere studere fotosynteseaktiviteten organismer i enestående detaljer.
Photobleaching før STORM er et kritisk punkt som gjør at forskerne å observere plasseringen og dynamikken i proteiner i autofluorescent organismer. Foruten Cyanobakterie, har vi vist at autofluorescence av blomstrende anlegget Arabidopsis thaliana kan også bli slukket etter 60 min photobleaching9. Photobleaching har vært mye brukt, for eksempel for å forbedre signal-til-støy-forhold og visualisering av flere biomarkers sekvensielt20. Det var også vist at photobleaching før imaging er fordelaktig når observere en autofluorescence prøve under Raman spektroskopi21. Derfor kan det være mulig å bruke denne photobleaching-metoden for å redusere autofluorescence av andre fotosynteseaktiviteten organismer, inkludert eukaryotic alger, planter og organismer som inneholder proteorhodopsin og bacteriochlorophyll.
Fotosynteseaktiviteten organismer inneholder ulike pigmenter som har forskjellige absorpsjon spectra; organisk fargestoffer og fluorescerende proteiner må derfor velges varsomhet. For eksempel i denne studien, en farge med en maksimal eksitasjon bølgelengde på rundt 750 nm ble brukt. Selv om to kanaler (750 nm og 650 nm) tilgjengelig for STORM presenteres her, Prochlorococcus autofluorescent signaler kan fortsatt observeres etter blir eksponert under en 650-nm laser, selv etter langvarig photobleaching. Dette er sannsynligvis fordi 650 nm er en av de store absorpsjon bølgelengdene for Prochlorococcus. På den annen side, noen Synechococcus og Rødalger inneholde phycoerythrin som deres pigment22, som har en absorpsjon spekteret fra 488 nm til 560 nm og et minimum absorpsjon 650 nm23. Derfor kan det være mulig å bruke en 650-nm kanal i stedet for en 750-nm for å studere proteiner i disse phycoerythrin inneholder autotrophs.
Oppsummert gir en riktig kombinasjon av photobleaching og STORM en kraftig tilnærming for å forstå protein organisasjonen i fotosynteseaktiviteten celler i detalj, noe som ytterligere vil avsløre sin dynamikk og potensial funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Daiying Xu for hennes kundestøtte og kommentarer på manuskriptet. Denne studien er støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation av Kina (prosjektnummeret 41476147) og gir forskningsråd Hong Kong spesiell administrativ Region, Kina (prosjektnumre 689813 og 16103414).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser? Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
