Summary
Hier beschrijven we een photobleaching methode ter vermindering van de autofluorescence van cyanobacteriën. Na photobleaching, wordt stochastische optische wederopbouw microscopie gebruikt voor het verkrijgen van driedimensionale Super resolutiebeelden van de cyanobacteriën FtsZ ring.
Abstract
Super resolutie microscopie is wijd verbeid gebruikt om eiwitinteractie en subcellular structuren in vele organismen te studeren. In fotosynthetische organismen, is de resolutie van de laterale van super resolutie beeldvorming echter alleen ~ 100 nm. De lage resolutie is vooral te wijten aan de achtergrond van de hoge autofluorescence van fotosynthetische cellen veroorzaakt door hoge intensiteit lasers die vereist voor super-resolutie beeldvorming, zoals stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM zijn). Hier beschrijven we een photobleaching-bijgewoonde STORM methode die ontwikkeld werd onlangs voor de mariene picocyanobacterium Prochlorococcusimaging. Na photobleaching, de autofluorescence van Prochlorococcus is effectief verminderd zodat die STORM kan worden uitgevoerd met een laterale resolutie van ~ 10 nm. Met behulp van deze methode, wij verwerven de in vivo driedimensionale (3-D)-organisatie van het FtsZ eiwit en karakteriseren van vier verschillende FtsZ ring morphologies tijdens de celcyclus van Prochlorococcus. De methode we hier beschrijven zouden kunnen worden vastgesteld voor de super resolutie beeldvorming van andere fotosynthetische organismen.
Introduction
Super resolutie microscopies kunnen breken de grens van de diffractie van licht en bieden een beeld binnen sub diffractie resoluties (< 200 nm). Ze hebben veel gebruikt in vele organismen eiwit lokalisatie en subcellular structuren te bestuderen. Grote super resolutie Microscopie methodes omvatten gestructureerde verlichting microscopie (SIM), gestimuleerd emissie uitputting microscopie (STED), STORM en photoactivated lokalisatie microscopie (PALM). De mechanismen en de toepassingen van deze super resolutie microscopen geweest herzien elders1,2.
STORM kan bereiken een resolutie zo hoog als 10 nm door ruimtelijke scheiding3,4. Voor de STORM, slechts één molecuul binnen een regio diffractie-limited is geactiveerd ("on") en de rest van de moleculen geïnactiveerd ("off") worden bewaard. Door een accumulatie van snelle switch-on en - off van afzonderlijke moleculen, kan een "diffractie-onbeperkt" beeld worden gegenereerd3. Ondertussen zijn vele soorten organische kleurstoffen en fluorescente proteïnen die van toepassing zijn in de STORM, waardoor een gemakkelijke upgrade van regelmatige fluorescentie microscopie naar hoge resolutie microscopie5,6.
STORM is niet algemeen toegepast in fotosynthetische cellen, zoals cyanobacteriën, algen, en plantaardige cellen met chloroplasten7,8, die te wijten aan het feit dat STORM is vereist hoge laser intensiteit aan station photoswitching. De hoge intensiteit laser ongunstig prikkelt sterke autofluorescence achtergrond in fotosynthetische cellen en interfereert met de lokalisatie van de single-molecuul in STORM beeldbewerking. Om te onderzoeken de subcellular structuren of eiwitinteractie in fotosynthetische cellen gebruiken als STORM, ontwikkelden we een photobleaching protocol om de achtergrond autofluorescence signalen9doven. In een immunefluorescentie kleuring routineprocedure, worden specimens blootgesteld aan wit licht van een hoge intensiteit tijdens de blokkerende stap, die de autofluorescence van fotosynthetische cellen voldoen aan de eisen voor STORM verlaagt. Dit protocol maakt het dus mogelijk om te onderzoeken gepigmenteerde organismen met STORM.
Hier beschrijven we het protocol voor het gebruik van STORM om het imago van de organisatie van FtsZ ring in de eencellige picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ is een zeer geconserveerde tubuline-achtige cytoskeletal eiwit die polymerizes om te vormen van een ring-structuur (de Z-ring) rond de omtrek van een cel10 en is van essentieel belang voor de celdeling11. Behouden van Prochlorococcus cellen zijn eerste photobleached de autofluorescent achtergrond en immunostained met een primaire anti-FtsZ antilichaam te verminderen, en vervolgens een secundair anti-konijn IgG (H + L) antilichaam is geconjugeerd met een fluorophore (b.v. , Alexa Fluor 750). Uiteindelijk, wordt STORM gebruikt voor het observeren van de gedetailleerde FtsZ ring organisaties in Prochlorococcus tijdens verschillende celcyclus stadia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding en fixatie van de proeven
- 1 mL van een Prochlorococcus MED4 tot 5 mL van de zeewater gebaseerde Pro99 middellange12beënten. Grow Prochlorococcus culturen bij 23 ° C onder het licht met een intensiteit van 35 µmol fotonen/m2s. vijf dagen later, verzamelen van 1 mL van de cultuur in een 1.5-mL-buis.
Opmerking: Vijf dagen na de inenting, Prochlorococcus MED4 zal bereiken de late fase van de log, met ongeveer 108 cellen/mL, die geschikt is voor beeldvorming van de STORM. - Voeg 100 µL van vers bereid uit 25% paraformaldehyde (PFA) (m/v) formaldehyde en 2 µL van 50% Glutaaraldehyde in de 1.5-mL-buis de cultuur vast te stellen. Incubeer het monster in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
Opmerking: Het monster was in het donker bewaard voor fixatie omdat Glutaaraldehyde licht is gevoelig. - Spin down het monster bij 13.500 x g voor 1 min; vervolgens Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 µL van de Pro99 middellange12. Het bewaren van het monster bij 4 ° C tot immunokleuring.
2. precoating van het dekglaasje aan met polystyreen kralen
Opmerking: Polystyreen kralen worden beschouwd als fiducial markering voor drift correctie.
- Vortex het origineel ampul van polystyreen kralen en maak een verdunning van de 1:20,000 met 50% ethanol als werkende drijfmest.
- Inschakelen van de hete plaat, de temperatuur instellen tot 120 ° C en coverslips op de hete plaat te plaatsen.
- Laden 100 µL van werkende drijfmest op elke dekglaasje aan. Incubeer het dekglaasje aan op de hete plaat voor 10 min en vervolgens zorgvuldig overbrengen in de coverslips petrischalen voor opslag bij kamertemperatuur.
Opmerking: De kant met de kralen op het aangesloten moet onder ogen zien, en de cellen moeten worden gekoppeld aan dezelfde kant. De kralen zijn geïmmobiliseerd op de coverslips en gebruikt voor het corrigeren van de monster-drijven in real-time tijdens STORM imaging. Na immobilizing de kralen, kan niet de coverslips worden gevlamd.
3. coating van Poly-L-lysine op de kraal beklede dekglaasje aan
Opmerking: Dit gebeurt voor de immobilisatie van cyanobacteriën cellen.
- Voeg 100 µL van poly-L-lysine (1 mg/mL) naar het midden van het dekglaasje aan met de kraal-gecoate zijde naar boven. Laat het zitten gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Gebruik een pipet om zorgvuldig te streven van de niet-vastgemaakte poly-L-lysine en overbrengen naar een 1.5-mL-buis. Sla de poly-L-lysine bij 4 ° C voor hergebruik.
- Spoel het dekglaasje aan met 10 mL ultra gefilterde water in een petrischaal 60 mm en dan kort drogen het dekglaasje aan op een papieren handdoek.
- Het dekglaasje aan in een petrischaal (100 mm) voor later gebruik opslaan. Om te voorkomen dat de bevestiging van het dekglaasje aan de schotel, lijn de petrischaal met een laagje parafilm.
Opmerking: Het dekglaasje aan, voorgelakt met kralen en poly-L-lysine, kan worden opgeslagen op kamertemperatuur voor ten minste een half jaar. Voorbereiding van een partij van coverslips bij voorbaat wordt daarom sterk aanbevolen.
4. de immobilisatie van cellen op het dekglaasje aan
- Een voorgelakt dekglaasje aan overbrengen in een nieuwe petrischaal met parafilm aan de onderkant, die zal worden verwezen als de kleuring schotel voortaan. Laden van 100 µL van het vaste monster op het dekglaasje aan en laat het zitten voor 30 min dat cel bijlage.
- Het dekglaasje aan overbrengen in een putje van een 12-well-plaat, die zal worden verwezen als de schotel wassen voortaan. Voeg 1 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (10 mM nb2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl en 2,7 mM KCl, pH 7.4) naar de waterput om te wassen het dekglaasje aan. Verwijder van de PBS-buffer en voeg een nieuwe PBS buffer te wassen het dekglaasje aan weer.
5. permeabilization van cyanobacteriën cellen
- De buffer van de PBS met behulp van een precisiepipet verwijderen. Voeg 1 mL vers bereide permeabilization buffer naar de waterput van de schotel van wassen, dat 0,05% niet-ionogene wasmiddel-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8.0) en 0,2 mg/mL lysozym bevat.
- Incubeer de schotel wassen bij 37 ° C gedurende 20 minuten. Verwijder vervolgens de buffer permeabilization.
- Voeg 1 mL PBS buffer en plaats de schotel wassen op een shaker die zachtjes de wassen schotel schudt voor 5 min. verwijderen de PBS-buffer. Herhaal deze stap 3 x te wassen het dekglaasje aan.
6. Photobleaching van de chlorofyl pigmenten in een stap blokkeren
- Het dekglaasje aan overbrengen in de kleuring schotel. Voeg 50 µL van buffer met blokkerend, waarin 0,2% (v/v) niet-ionogene wasmiddel-100 en 3% (v/v) geit serum, op de bovenkant van het dekglaasje aan.
- Plaats van de hele plaat op ijs kleuring en verplaats het onder de xenon lichtbron voor photobleaching gedurende ten minste 60 minuten, met een lage intensiteit op 1.800 µmol fotonen/m2·s.
- Na photobleaching en blokkeren, verwijder voorzichtig de buffer met blokkerend door adsorberend het met de rand van een papieren handdoek.
Opmerking: De intensiteit van het xenonlicht is zo hoog dat een paar goede zonnebril nodig is voor de bescherming van de ogen. Ondertussen, wikkel de lichtbron en de plaat aluminiumfolie gebruiken om te voorkomen dat het lekken van licht, dat oog schade kan veroorzaken. Controleer het dekglaasje aan elke 15 min om ervoor te zorgen dat het dekglaasje aan vochtig blijft. Als het dekglaasje aan droog is, voeg 50 µL van buffer met blokkerend.
7. antilichaam Binding
- Ontbinden anti -Anabaena FtsZ antilichaam in 200 µL van water volgens de instructies van de fabrikant.
- Verdunnen 1 µL van anti-FtsZ antilichaam in 99 µL van buffer met blokkerend. Voeg 50 µL van verdunde primair antilichaam op het dekglaasje aan en na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Het dekglaasje aan overbrengen in de schotel wassen. Voeg 1 mL PBS buffer en plaats de schotel wassen op een schok. Voorzichtig schudden de wassen schotel voor 5 min. Herhaal deze stap 3 x te wassen het dekglaasje aan.
- Het dekglaasje aan overbrengen in de kleuring schotel. Verdunnen 1 µL van een secundair antilichaam in 500 µL van buffer met blokkerend. Voeg 50 µL van verdunde secundair antilichaam op het dekglaasje aan en Incubeer het 30 min in het donker bij kamertemperatuur.
- Het dekglaasje aan overbrengen in de schotel wassen. Wassen met 1 mL PBS buffer op een shaker. Voorzichtig schudden de wassen schotel voor 5 min. Wrap de schotel wassen met aluminium papier zodat het lichtdicht. Herhaal deze stap 3 x.
- Voeg 500 µL van vers bereid uit 4% paraformaldehyde (PFA) (m/v) formaldehyde naar de waterput. Incubeer het dekglaasje aan gedurende 15 min. in het donker bij kamertemperatuur.
- Verwijder de formaldehyde en herhaal de wassen stap 3 x.
- Bewaar het dekglaasje aan in PBS buffer bij 4 ° C in het donker tot imaging.
8. bereiding van de STORM Imaging Buffer
- Bereiden 1 mL buffer volgens tabel 1, onmiddellijk vóór de STORM beeldvorming imaging.
Opmerking: Als de houdbaarheid van de beeldvorming buffer ongeveer 2 h is, voorbereiden voor het vers, vlak voor gebruik. Vermijd vortexing na toevoeging van glucose-oxidase en katalase.
Let op: Methyl viologen is giftig materiaal. Gelieve het bijzonder voorzichtig behandelen. Cyclooctatetraeen is geclassificeerd als kankerverwekkende stof Cat. 1 chemische. Gelieve Vermijd inademing en huidcontact en maak de stamoplossing van cyclooctatetraeen en imaging buffer in een chemische kap.
9. Beeldacquisitie STORM vangegevens
- Laad het dekglaasje aan in de zaal van de laden (Figuur 1). Laad de vers bereide imaging buffer zachtjes in de zaal om te voorkomen dat het wassen van de cyanobacteriën cellen. Plaats een rechthoekige dekglaasje aan op de bovenkant van de beeldvorming buffer om te voorkomen dat haar reactie met zuurstof in de lucht. Vermijd overlapping luchtbellen onder het dekglaasje aan.
- Zet de camera, de LED-licht, en de laser. Open STORM software voor Beeldacquisitie, centroid positie bepaling en monster correctie13te drijven.
- Voeg de helft een druppel onderdompeling olie op de top van de lens. Laden van de kamer en zorg ervoor dat de lens van de doelstelling maakt contact met het dekglaasje aan.
- Bekijk het signaal met een 750-nm laser.
Opmerking: Omvat altijd een tweede antilichaam-min-kleuring negatieve controle om ervoor te zorgen dat de autofluorescence is verminderd. - Het identificeren van een samplegebied die zowel cellen en fiducial markeringen bevat. Start de software voor monster correctie te drijven.
Opmerking: In het algemeen, de ideale samplegebied 10-30 cellen bevat. Ondertussen moeten de cellen goed om te voorkomen dat overlappende cellen worden gescheiden. - Verwerven van een afbeelding van het breed-gebied als referentie, met de camera elektron vermenigvuldiging (EM) krijgen op 300 en een belichtingstijd van 30 ms (figuur 2A).
- Verhogen van de intensiteit van de laser 750 nm excitatie aan een hogere macht, ongeveer 4,5 kW/cm2. Zodra de fluorophores hebben omgevormd in een verspreid patroon, een super resolutiebeeld te verwerven door het verzamelen van 10.000 frames op 33 Hz (figuur 2B).
Opmerking: Als de fluorophores niet geïsoleerd zijn, wacht een paar minuten totdat meer fluorophores zijn overgestapt naar de donkere staat en de geïsoleerde afzonderlijke moleculen opeenvolgend flikkeren. Het aantal frames hier beschreven is geschikt voor onze steekproef en moet worden geoptimaliseerd voor andere gerichte structuren.
10. wederopbouw van Super resolutiebeelden van onbewerkte gegevens
- Gebruik een plugin genaamd QuickPALM (Tabel of Materials)14 in ImageJ te reconstrueren van een 3D-kleurenafbeelding super resolutie.
Opmerking: Een voorlopige chromatische beeld (figuur 2C) samen met een gekleurde schaal bar (figuur 2C) verschijnt. De kleur geeft de diepte op de z-as. - Om aan te tonen de 3D structuur in de constructie van een video, een stapel van super resolutie beelden met z-as gesegmenteerd elke 10 nm met behulp van QuickPALM14. De helderheid van de stapels en dupliceer de stack van een target cel. Gebruik een plugin genaamd de 3D-Viewer (Tabel of Materials)15 in ImageJ te genereren van de 3D-afbeelding van de cel. Record de draaihoek van de 3D-structuur voor demonstratie-doeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
STORM behaalt super resolutie beeldvorming door het activeren van individuele photoswitchable fluorophores stochastically. De locatie van elke fluorophore wordt geregistreerd en een super resolutiebeeld is dan opgebouwd op basis van deze locaties4. De nauwkeurigheid van de locatie van de fluorophore is daarom belangrijk voor de wederopbouw van de super-resolutie afbeelding. De spectra van de absorptie van Prochlorococcus piek bij 447 nm en 680 nm,en Prochlorococcus heeft een minimale absorptie bij golflengten boven 700 nm16. Prochlorococcus MED4 cellen uitgestoten echter nog steeds hoog autofluorescence bij blootstelling aan een uiterst hoge intensiteit van de 750 nm laser (figuur 3A), die vereist voor de beeldvorming van de STORM is. Dus interfereert de achtergrond van de hoge autofluorescence van Prochlorococcus cellen sterk met super resolutie beeldvorming.
Om gebruik te maken van STORM om te onderzoeken eiwit organisaties in Prochlorococcus, ontwikkelden we een photobleaching methode. Na blootstelling aan een wit licht van hoge intensiteit voor 30 min daalde het autofluorescence van Prochlorococcus MED4 cellen (figuur 3B), hoewel meerdere cellen met autofluorescence zijn nog steeds waargenomen. We verder langwerpige de photobleaching tijd om 60 min en vond dat de meerderheid van de cellen hun autofluorescence (Figuur 3 c verloren). Deze resultaten wijzen erop dat de methode van de photobleaching we hier ontwikkelden de autofluorescence in fotosynthetische organismen aanzienlijk kan afnemen.
Na photobleaching, konden we gebruik STORM te visualiseren de celdeling proteïne FtsZ in Prochlorococcus MED4 cellen. De cyanobacterium Prochlorococcus is de kleinste en de overvloedigste fotosynthetische organisme op aarde17. De diameter van een Prochlorococcus -cel is slechts 500-700 nm18. Met zulk een kleine celgrootte is het onmogelijk om te visualiseren de FtsZ ring-organisatie in Prochlorococcus cellen met behulp van conventionele breed-gebied fluorescentie microscopie (figuur 2A). STORM heeft echter een ruimtelijke resolutie van 9.6 nm in de xy-oppervlakte en 41.6 nm in de z-as. Met behulp van STORM, konden we onthullen een gedetailleerde morfologie van de ring van FtsZ in Prochlorococcus (cijfers 2B en 4). Ronddraaiende 3D-beelden van de STORM, we vier verschillende soorten FtsZ ring morphologies geïdentificeerd: clusters (figuur 4A, Film S1), een onvolledige ring (figuur 4B, Film S2), een volledige ring (Figuur 4 C, Film S3), en dubbele ringen (Figuur 4 D, Film S4). Hiaten werden waargenomen in de volledige FtsZ ringen van Prochlorococcus (figuur 4C, Film S3), die is vergelijkbaar met die gevonden in Caulobacter cresentus19. Deze vier soorten FtsZ ring morphologies toonde het proces van de vergadering van de ring van FtsZ tijdens de celcyclus van Prochlorococcus, en deze studie hielp ons om te begrijpen van de rol van FtsZ Ringu tijdens de celdeling van Prochlorococcus 9.
Figuur 1: componenten van de kamer van de laden en de geassembleerde zaal met de coverslips en imaging buffer voor STORM imaging. Het dekglaasje aan met het monster werd gelegd op de groef van het onderste gedeelte eerst. Het bovenste deel werd vervolgens zorgvuldig geschroefd op het onderste gedeelte. De imaging buffer werd toegevoegd in de zaal van de laden en vervolgens zorgvuldig bedekt met een vierkante dekglaasje aan. Bubbels moeten worden vermeden om te minimaliseren van iedere beweging die invloed op de nauwkeurigheid van de meting hebben kan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Vertegenwoordiger breed-gebied, STORM 2-D en 3-D kleur STORM beelden van FtsZ in Prochlorococcus MED4. De beelden werden genomen uit de zelfde gezichtsveld met behulp van microscopie van de breed-gebied regelmatig (A), (B) 2D-STORM en (C)-3D-kleur STORM. De kleuren in het deelvenster C geven aan de diepte van de fluorescerende signalen op de z-as. De getallen in deelvenster C geven aan welke cellen van belang. De schaal balken = 1 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Photobleaching van Prochlorococcus MED4. Vaste Prochlorococcus MED4 cellen (A) niet photobleached, ze waren of photobleached voor (B) 30 min en (C) 60 min. Het licht van de xenon XD-300 werd gebruikt bij een intensiteit van 1.800 µmol/m2·s. cellen werden opgewekt door een 750-nm laser bij de dezelfde intensiteit als werd gebruikt voor STORM imaging. De autofluorescences waren beeld met dezelfde filters zoals gebruikt in STORM om ervoor te zorgen dat de aanwezigheid van minimale autofluorescence bij STORM. De schaal balken = 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vertegenwoordiger STORM beelden van vier FtsZ ring morphologies. Vier verschillende FtsZ ring morphologies werden waargenomen in Prochlorococcus: (A) clusters, (B) een onvolledige ring, (C) een volledige ring en (D) dubbele ringen. Voor dezelfde cel, werden beelden van (i) breed-gebied fluorescentie microscopie, (ii) STORM op de xy-oppervlakte, en (iii) STORM na rotatie getoond. De 3D-films overeenkomt met de cellen in panelen A, worden B, Cen D getoond in films S1, S2, S3 en S4, respectievelijk. De schaal balken = 500 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Chemische stoffen | Stockoplossing | Eindconcentratie |
| glucose | N/B | 10% (m/v) |
| Tris-Cl (pH 8,0) | 0,5 M | 50 mM |
| Ascorbinezuur | 100 mM | 1 mM |
| Methyl viologen | 100 mM | 1 mM |
| Cyclooctatetraeen | 200 mM | 2 mM |
| TCEP | 0,5 M | 25 mM |
| Glucose-oxidase | 56 mg/ml | 0.56 mg/ml |
| Katalase | 4 mg/ml | 40 µg Mo/ml |
Tabel 1: Recept voor de beeldvorming buffer.
Film S1: Clusters van FtsZ eiwitten waargenomen Prochlorococcus MED4 cellen. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film S2: een onvolledige ring van FtsZ eiwitten waargenomen Prochlorococcus MED4 cellen. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film S3: een volledige ring van FtsZ eiwitten waargenomen Prochlorococcus MED4 cellen. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film S4: een dubbele-ring van FtsZ eiwitten waargenomen Prochlorococcus MED4 cellen. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol, beschreven we een procedure aanzienlijk verminderen de autofluorescence van de cyanobacterium Prochlorococcus (Figuur 3 c) en, vervolgens, immunokleuring de eiwitten in de cellen, waardoor ons te gebruiken om te bestuderen van de 3D-FtsZ STORM ring morphologies in Prochlorococcus (Figuur 4). Dit protocol kan worden vastgesteld voor super-resolutie beeldvorming in andere fotosynthetische organismen.
Eerdere studies op fotosynthetische organismen voornamelijk gebruikt SIM om super resolutie imaging omdat SIM geen lasers van hoge intensiteit vereist. De ruimtelijke resolutie van SIM is echter slechts ~ 100 nm1, die is veel lager dan die van STORM. In deze studie, de ruimtelijke resolutie van de beelden van de STORM konden bereiken 9.6 nm in de xy-oppervlakte en 41.6 nm in de z-as9. De verbeterde resolutie geboden door photobleaching en STORM imaging kunt onderzoekers bestuderen fotosynthetische organismen in ongekend detail.
Photobleaching vóór STORM is een cruciale stap waarmee onderzoekers te observeren van de locatie en de dynamiek van de eiwitten in autofluorescent organismen. Naast cyanobacteriën, hebben wij aangetoond dat autofluorescence van de bedektzadigen die Arabidopsis thaliana kan ook worden gehard na 60 min van photobleaching9. De photobleaching is wijd verbeid gebruikt, bijvoorbeeld voor het verbeteren van de signaal-/ ruisverhouding en de visualisatie van meerdere biomarkers sequentieel20. Het werd ook aangetoond dat photobleaching voordat imaging gunstig is wanneer een autofluorescence monster onder Raman spectroscopie21observeren. Daarom is het wellicht haalbaar dit photobleaching methode ter vermindering van de autofluorescence van andere fotosynthetische organismen, met inbegrip van eukaryote algen, vaatplanten en organismen met proteorhodopsin en bacteriochlorophyll toe te passen.
Fotosynthetische organismen bevatten verschillende pigmenten die verschillende absorptiespectra hebben; organische kleurstoffen en fluorescerende eiwitten moeten zorgvuldig worden geselecteerd. Bijvoorbeeld, in deze studie, een kleurstof met een golflengte van de maximale excitatie van ongeveer 750 nm werd gebruikt. Hoewel twee kanalen (750 nm en 650 nm) zijn beschikbaar voor de STORM hier gepresenteerd, Prochlorococcus autofluorescent signalen kunnen nog steeds worden waargenomen na onder een 650-nm laser, zelfs na langdurige photobleaching wordt blootgesteld. Dit is waarschijnlijk omdat 650 nm is één van de belangrijke absorptie golflengten voor Prochlorococcus. Aan de andere kant, sommige Synechococcus en rode algen bevatten phycoerythrin als hun pigment22, die een absorptiespectrum van 488 heeft nm tot 560 nm en een minimale absorptie bij 650 nm23. Daarom is het wellicht haalbaar op een kanaal van 650 nm in plaats van een 750-nm kanaal te bestuderen van de eiwitten binnen deze phycoerythrin-bevattende autotrophs.
Kortom biedt een juiste combinatie van photobleaching en STORM een krachtige aanpak om te begrijpen van de organisatie van de eiwitten in fotosynthetische cellen in detail, die verder hun dynamiek en potentieel functie zal onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Daiying Xu voor haar technische bijstand en de reacties op het manuscript. Deze studie wordt ondersteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (projectnummer 41476147) en de Onderzoeksraad van de speciale administratieve regio Hongkong, China (projectnummers 689813 en 16103414) in verleent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser? Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
