Summary
Здесь мы описываем метод Фотообесцвечивание для снижения аутофлюоресценция цианобактерий. После Фотообесцвечивание стохастический оптических реконструкции микроскопии используется для получения изображений трехмерных суперразрешением цианобактерий кольца FtsZ.
Abstract
Супер-резолюции микроскопии широко использовался для изучения взаимодействия протеина и внутриклеточных структур многих организмов. В фотосинтетических организмов, однако, латеральное разрешение суперразрешением изображений является только ~ 100 Нм. Низкое разрешение обусловлено главным образом высоким аутофлюоресценция фон фотосинтезирующих клеток, вызванные лазеров высокой интенсивности, которые необходимы для супер-резолюции изображений, таких как стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм). Здесь мы описываем при содействии Фотообесцвечивание шторм метод который была разработана недавно для изображений морской picocyanobacterium Prochlorococcus. После Фотообесцвечивание, Аутофлюоресценция Prochlorococcus эффективно снижается так что шторм может быть выполнена с латеральное разрешение ~ 10 Нм. С помощью этого метода, мы приобретаем в vivo трехмерной (3-D) Организации FtsZ белка и характеризуют четыре различных FtsZ кольцо морфологии во время цикла клетки Prochlorococcus. Метод, который мы описываем здесь могут быть приняты для супер-резолюции изображений других фотосинтетических организмов.
Introduction
Суперразрешением microscopies может нарушить дифракционный предел света и предоставляют изображения в рамках резолюций Подкомиссии дифракции (< 200 Нм). Они широко используются во многих организмах для изучения белков локализации и внутриклеточных структур. Основные суперразрешением микроскопии методы включают структурированного освещения микроскопии (SIM), стимулировали выбросов истощения микроскопии (интереса), шторм и photoactivated локализации микроскопии (PALM). 1,2обзор других механизмов и применения этих супер-резолюции, которые были микроскопы.
ШТОРМ может достичь резолюции аж 10 Нм, пространственное разделение3,4. Для ШТОРМА только одна молекула в регион дифракционный активируется («по») и остальная часть молекулы хранятся инактивированных («выключено»). Накоплением быстрого переключения на и - офф одной молекулы «дифракционный Безлимитный» изображение может быть сгенерированный3. Между тем многие виды органических красителей и флуоресцентные белки применимы в шторм, что позволяет легко модернизировать от регулярных флуоресцентной микроскопии высокого разрешения микроскопии5,6.
ШТОРМ не применяется широко в фотосинтезирующих клеток, таких как синезеленых водорослей, морских водорослей, и растительных клеток с хлоропластов7,8, которая обусловлена тем, что шторм требует высокой лазерной интенсивности для привода photoswitching. Высокой интенсивности лазерного неблагоприятно возбуждает аутофлюоресценция сильный фон в фотосинтезирующих клеток и препятствует сингл молекула локализации в шторм изображений. Чтобы использовать шторм расследовать внутриклеточных структур или белковых взаимодействий в фотосинтезирующих клеток, мы разработали протокол Фотообесцвечивание чтобы утолить фон аутофлюоресценция сигналы9. В процедуре обычной immunofluorescent окрашивания образцов подвергаются белый свет высокой интенсивности во время блокировки шага, который понижает аутофлюоресценция фотосинтезирующих клеток для удовлетворения требований для ШТОРМА. Таким образом этот протокол делает возможным расследовать пигментированной организмов с ШТОРМОМ.
Здесь мы описываем протокол использовать ШТОРМА для изображений FtsZ кольцо Организации одноклеточных picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ является весьма сохранены тубулин как цитоскелета белком, который polymerizes сформировать структуру кольцо (кольцо Z) по окружности ячейки10 и имеет важное значение для деления клеток11. Сохранились Prochlorococcus клетки первого photobleached уменьшить фон autofluorescent и immunostained с основных анти FtsZ антитела, и затем вторичные антитела IgG (H + L) анти кролик проспряганное с Флюорофор (например , Alexa Fluor 750). В конце концов шторм используется для наблюдать подробную FtsZ кольцо организаций в Prochlorococcus стадии различных клеточного цикла.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Образец подготовки и фиксации
- Прививать 1 мл стерильных Prochlorococcus MED4 до 5 мл на основе морской воды Pro99 средних12. Расти Prochlorococcus культур при 23 ° C под свет с интенсивностью 35 мкмоль фотоны/m2s. пять дней спустя, собирать 1 мл культуры в 1,5 мл.
Примечание: Через пять дней после прививки, Prochlorococcus MED4 достигнет этапа конца журнала, с приблизительно 108 клеток/мл, который подходит для ШТОРМА изображений. - Добавьте 100 мкл формальдегида, приготовленные из 25% параформальдегида (PFA) (w/v) и 2 мкл глютаральдегид 50% в 1,5 мл пробирку исправить культуры. Инкубируйте образец в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин.
Примечание: Образец хранилась в темноте для фиксации потому что глютаральдегид свет чувствительные. - Спин вниз образца на 13500 x g 1 мин; затем удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 100 мкл Pro99 средних12. Храните образца при температуре 4 ° C до иммуноокрашивания.
2. намывного Coverslip с шарики полистироля
Примечание: Бисер полистирола считаются фидуциальный маркер для коррекции дрейф.
- Вихревой оригинальный флакон из шарики полистироля и подготовить топографической разрежения с 50% этанола как рабочей суспензии.
- Поверните на горячей плите, установите температуру до 120 ° C и место coverslips на горячей пластине.
- Загрузите 100 мкл рабочего раствора на каждом coverslip. Инкубировать coverslip на горячей плите за 10 мин и, затем, тщательно передать coverslips Петри для хранения при комнатной температуре.
Примечание: На стороне с бисером, прилагается к нему следует лицом вверх, и клетки должны быть прикреплены на одной стороне. Бусины иммобилизованных на coverslips и используется для коррекции дрейфующих образец в режиме реального времени во время ШТОРМА изображений. После иммобилизации бусы, coverslips не пылали.
3. покрытие поли L-лизин на Coverslip шарик покрытием
Примечание: Это делается для иммобилизации цианобактерий клеток.
- Мкл 100 поли L-лизин (1 мг/мл) в центр coverslip с покрытием из бисера, стороной вверх. Пусть это сидеть в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Использование пипетки тщательно aspire неприсоединенной поли L-лизин и его передать 1,5 мл. Сохраните поли L-лизин при 4 ° C для повторного использования.
- Промыть coverslip с 10 мл ультра фильтрации воды в чашку Петри 60-мм и затем кратко сухой coverslip на бумажное полотенце.
- Магазин coverslip в чашке Петри (100 мм) для последующего использования. Чтобы предотвратить вложения coverslip блюдо, линия Петри слоем парафина.
Примечание: Coverslip, ветротурбин с бисером и поли L-лизин, может храниться при комнатной температуре по крайней мере полгода. Поэтому настоятельно рекомендуется заранее подготовить пакет coverslips.
4. Иммобилизация клеток на Coverslip
- Передать новые Петри с парафина в нижней части, которая будет именоваться окрашивание блюдо отныне precoated coverslip. Загрузить 100 мкл фиксированной образца на coverslip и дайте ему сидеть в течение 30 минут, чтобы позволить ячейке вложение.
- Передачи coverslip колодец 12-ну плиты, которая будет именоваться Стиральная блюдо отныне. Добавьте 1 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) (10 мм Na2HPO4, 1.8 мм х2PO4, 137 мм NaCl и 2,7 мм KCl, рН 7,4) хорошо мыть coverslip. Удалить в буфер PBS и добавьте новый буфер PBS мыть coverslip снова.
5. permeabilization цианобактерий клеток
- Удалите в буфер PBS с помощью пипетки. Добавьте 1 мл свежеприготовленный permeabilization буфера также стиральная блюдо, которое содержит 0,05% неионные моющего средства-100 (v/v), 10 мм ЭДТА, 10 трис (рН 8.0) и 0,2 мг/мл лизоцима.
- Инкубируйте блюдо стирки при 37 ° C в течение 20 мин. Затем удалите буфера permeabilization.
- Добавьте 1 mL PBS буфера и поместите блюдо стирки на шейкер, который мягко качает Стиральная блюдо для 5 минут удалить буфер PBS. Повторите этот шаг 3 x мыть coverslip.
6. Фотообесцвечивание хлорофилл пигменты в блокировки шаг
- Передача coverslip окрашивание блюдо. Добавьте 50 мкл блокирующий буфер, который содержит 0,2% (v/v) неионных моющего средства-100 и 3% (v/v) козьего сыворотки, на вершине coverslip.
- Поместите весь пятнать пластины на льду и переместить его под ксенон источник света для Фотообесцвечивание по крайней мере 60 мин, с интенсивностью освещения на 1800 мкмоль фотоны/m2·s.
- После Фотообесцвечивание и блокирование осторожно удалите блокирующий буфер путем поглощения с краем бумажным полотенцем.
Примечание: Интенсивность света ксенон настолько высока, что необходима пару надлежащего очки для защиты глаз. Тем временем оберните источника света и пластине с помощью алюминиевой фольгой, чтобы избежать утечки света, который может привести к повреждению глаз. Проверьте coverslip каждые 15 минут, чтобы убедиться, что coverslip остается влажным. Если coverslip сухой, добавьте 50 мкл блокировки буфера.
7. антитела связывая
- Растворите анти -Анабена FtsZ антител в 200 мкл воды согласно инструкциям производителя.
- Разбавьте 1 мкл антител анти FtsZ в 99 мкл блокировки буфера. Добавьте 50 мкл разбавленного основное антитело на coverslip и проинкубируйте его при комнатной температуре за 30 мин.
- Передача coverslip стирки блюдо. Добавьте 1 mL PBS буфера и поместите блюдо стирки на встряхнуть. Осторожно встряхните Стиральная блюдо для 5 минут повторите этот шаг 3 x мыть coverslip.
- Передача coverslip окрашивание блюдо. Разбавьте 1 мкл вторичное антитело в 500 мкл блокировки буфера. Добавьте 50 мкл разбавленного вторичное антитело на coverslip и Инкубируйте 30 мин в темноте при комнатной температуре.
- Передача coverslip стирки блюдо. Промойте его с 1 мл буфера PBS на шейкер. Осторожно встряхните Стиральная блюдо для 5 минут обернуть Стиральная блюдо с алюминиевой бумаги, чтобы сделать его свет доказательство. Повторите этот шаг 3 x.
- 500 мкл формальдегида, приготовленные из параформальдегида 4% (PFA) (w/v), колодец. Инкубируйте coverslip 15 мин в темноте при комнатной температуре.
- Удалите формальдегида и повторите шаг 3 x стиральная.
- Магазин coverslip в буфере PBS на 4 ° C в темноте до изображений.
8. Подготовка шторм визуализации буфера
- Готовим 1 мл визуализации буфера согласно таблице 1, непосредственно перед ШТОРМОМ изображения.
Примечание: Как срок хранения изображений буфера составляет около 2 ч, подготовьте его свежие, прямо перед использованием. Избегайте vortexing после добавления глюкозооксидазы и каталазы.
Предупреждение: Метил viologen-ядовитые материал. Пожалуйста, обрабатывать ее с особой осторожностью. Cyclooctatetraene классифицирован как канцероген Cat. 1 химического. Просьба избегать вдыхания и контакт с кожей и сделать Стоковый раствор cyclooctatetraene и визуализации буфера в химические вытяжки.
9. изображение приобретение данных шторм
- Загрузите coverslip в камере загрузки (рис. 1). Загрузите свежеприготовленные буфера визуализации мягко в камеру, чтобы избежать смывания цианобактерий клетки. Место прямоугольной coverslip на вершине буфере визуализации для предотвращения его реакции с кислородом в воздухе. Избегайте треппинга пузырьков воздуха под coverslip.
- Включите камеру, светодиодный свет и лазер. Открытое программное обеспечение ШТОРМА для захвата изображений, определение тяжести положения и образец дрейфующих коррекции13.
- Добавьте половину каплю масла погружения на вершине объектива. Загрузить камеры и убедитесь, что объектив цели делает контакт с coverslip.
- Проверьте сигнал с 750-Нм лазер.
Примечание: Всегда включайте второй Пятнать антитела минус отрицательный контроль для обеспечения что аутофлюоресценция уменьшается. - Определите область образца, который содержит клетки и фидуциальный маркеров. Запустите программное обеспечение для образца, дрейфующих коррекции.
Примечание: В общем, идеальный образец содержит 10-30 ячеек. Тем временем клетки должны быть разделены так, чтобы избежать любого дублирования клетки. - Приобрести один-поля изображения как ссылка, с камеры электрона умножения (EM) получить на 300 и выдержка 30 мс (рисунок 2A).
- Увеличьте интенсивность лазерного возбуждения 750-Нм до более высокой мощности, примерно 4,5 кВт/см2. После флуорофоров перешли в разреженных мигающий шаблон, приобрести один из супер-разрешение изображения, собирая 10000 кадров на 33 Гц (рис. 2B).
Примечание: Если флуорофоров, не изолированы, подождите пару минут, пока больше флуорофоров перешли в состояние темно и изолированных молекул одного мерцание последовательно. Количество кадров, описанные здесь подходит для нашего образца и должна быть оптимизирована для других целевых структур.
10. Реконструкция суперразрешением изображений из необработанных данных
- Используйте плагин называется QuickPALM (Таблица материалов)14 в ImageJ реконструировать суперразрешением 3-D цветного изображения.
Примечание: Предварительные хроматической изображения (рис. 2 c) наряду с цветом линейки (рис. 2 c) будет отображаться. Глубина на оси z представляет цвет. - Чтобы продемонстрировать 3-D структуры в конструкцию видео, стек суперразрешением изображения с z-axis секционного каждые 10 Нм, используя QuickPALM14. Отрегулируйте яркость стеков и дублировать стек одной целевой ячейки. Используйте плагин называется трехмерного просмотра (Таблица материалов)15 в ImageJ для создания 3-D изображение клетки. Запись вращение 3-D структуры для демонстрационных целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шторм достигает суперразрешением изображений путем активации отдельных фотопереключаемых флуорофоров ковшах. Расположение каждого Флюорофор записывается и супер-разрешение изображения затем строится на основе этих мест4. Таким образом точность местоположения Флюорофор имеет важное значение для восстановления изображения суперразрешением. Спектры поглощения Prochlorococcus пик на 447 Нм и 680 нми Prochlorococcus имеет минимальное поглощение на длинах волн выше 700 Нм16. Однако Prochlorococcus MED4 клетки по-прежнему излучаемого высокой аутофлюоресценция при контакте с чрезвычайно высокой интенсивности 750-Нм лазер (Рисунок 3А), который необходим для ШТОРМА изображений. Таким образом высокая аутофлюоресценция фон Prochlorococcus клеток сильно мешает с суперразрешением изображений.
Для того чтобы использовать шторм расследовать организаций белка в Prochlorococcus, мы разработали метод Фотообесцвечивание. После воздействия белого света высокой интенсивности для 30 мин аутофлюоресценция Prochlorococcus MED4 клеток снизился (рис. 3B), хотя по-прежнему были обнаружены несколько клеток с аутофлюоресценция. Мы далее удлиненные Фотообесцвечивание время до 60 мин и обнаружил, что большинство клеток потерял их аутофлюоресценция (рис. 3 c). Эти результаты показывают, что метод Фотообесцвечивание, который мы разработали здесь может значительно уменьшить аутофлюоресценция в фотосинтетических организмов.
После Фотообесцвечивание, мы смогли использовать ШТОРМА для визуализации клеточного деления белка FtsZ в Prochlorococcus MED4 клетки. Цианобактерии Prochlorococcus является самым маленьким и самым обильным фотосинтетических организмов на земле17. Диаметр ячейки Prochlorococcus является только 500-700 Нм18. С такой маленькой камере размером невозможно визуализировать организацию кольцо FtsZ в Prochlorococcus клеток с использованием обычных широкий поле флуоресцентной микроскопии (рисунок 2A). Однако, шторм имеет пространственное разрешение 9.6 Нм в плоскости xy и 41,6 Нм в оси z. С помощью шторм, мы смогли выявить подробную морфология FtsZ кольца в Prochlorococcus (цифры 2B и 4). Вращая 3-D шторм изображения, мы определили четыре различных типа FtsZ кольцо морфологии: кластеры (рис. 4A, Кино S1), неполное кольцо (рис. 4б, Кино S2), полное кольцо (рис. 4 C, Кино S3) и двойные кольца (рис. 4 D, Кино S4). Пробелы были замечены в полной FtsZ кольца Prochlorococcus (рис. 4 c, Кино S3), который похож на, в Caulobacter cresentus19. Эти четыре типа FtsZ кольцо морфологии показал процесс сборки FtsZ кольца во время клеточного цикла Prochlorococcus, и это исследование помогает нам понять роль FtsZ кольца во время разделения клетки Prochlorococcus 9.
Рисунок 1: компоненты загрузки камеры и собраны камеры с coverslips и визуализации буфера для ШТОРМА воображения. Coverslip, с образец был сделан на выступ в нижней части сначала. Верхняя часть была затем тщательно болтами на нижней части. Визуализации буфер был добавлен в камере загрузки и затем тщательно покрывается квадратных coverslip. Чтобы свести к минимуму любое движение, которое может повлиять на точность измерения следует избегать пузыри. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель-поля, STORM 2-D и 3-D цвет шторм изображения FtsZ в Prochlorococcus MED4. Изображения были взяты из той же поле зрения с помощью регулярных микроскопия поля (A), шторм 2-D (B) и (C) 3-D цвет ШТОРМА. Цвета в панель C показывают глубину флуоресцентные сигналов на оси z. Числа в группе C указывают клетки интереса. Масштаб баров = 1 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Фотообесцвечивание Prochlorococcus MED4. Исправлена Prochlorococcus MED4 клетки были (A) не photobleached, или они photobleached для (B) 30 мин и (C) 60 мин. XD-300 Ксеноновый свет был использован на интенсивность 1800 мкмоль/m2·s. клетки были рады к 750-Нм лазер на той же интенсивностью, как был использован для ШТОРМА изображений. Autofluorescences были образы с те же фильтры используется в шторм для того чтобы убедиться в том, что наличие минимальной аутофлюоресценция повлиять на шторме. Масштаб баров = 2 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель шторм изображения четырех морфологии кольцо FtsZ. В Prochlorococcusбыли замечены четыре различных FtsZ кольцо морфологии: кластеры (A), (B) неполного кольцо, (C) полное кольцо и (D) двойной кольца. Для той же ячейке были показаны изображения (i)-поля флуоресцентной микроскопии, (ii) шторм на плоскости xy и (iii) шторм после поворота. 3-D фильмы, соответствующие ячейки в панели A, B, Cи D показаны в фильмах S1, S2, S3 и S4, соответственно. Масштаб баров = 500 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Химические вещества | Стоковый раствор | Конечная концентрация |
| глюкоза | Н/Д | 10% (w/v) |
| Трис Cl (pH 8.0) | 0.5 М | 50 мм |
| Аскорбиновая кислота | 100 мм | 1 мм |
| Метил viologen | 100 мм | 1 мм |
| Cyclooctatetraene | 200 мм | 2 мм |
| TCEP | 0.5 М | 25 мм |
| Глюкозооксидаза | 56 мг/мл | 0,56 мг/мл |
| Каталаза | 4 мг/мл | 40 мкг/мл |
Таблица 1: Рецепт для визуализации буфера.
Фильм S1: кластеры белков FtsZ наблюдается в Prochlorococcus Клетки MED4. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Фильм S2: неполная кольцо FtsZ белков наблюдается в Prochlorococcus Клетки MED4. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Фильм S3: полное кольцо FtsZ белков наблюдается в Prochlorococcus Клетки MED4. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Фильм S4: двойной кольцо FtsZ белков наблюдается в Prochlorococcus Клетки MED4. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе, мы описали процедура значительно сократить аутофлюоресценция цианобактерии Prochlorococcus (рис. 3 c) и, затем, имунноконтраст белков в клетках, которые позволили нам использовать шторм для того чтобы изучить 3-D FtsZ кольцо морфологии в Prochlorococcus (рис. 4). Этот протокол может быть принято для супер-резолюции изображений в других фотосинтетических организмов.
Предыдущие исследования на фотосинтетические организмы главным образом используется SIM для достижения суперразрешением воображения потому что SIM не требуют лазеров высокой интенсивности. Однако пространственное разрешение сим является только ~ 100 Нм при1, которая намного ниже, чем у ШТОРМА. В этом исследовании, пространственное разрешение изображений шторм может достигать 9.6 Нм в плоскости xy и 41,6 Нм в оси z9. Улучшение разрешения, предоставляемого Фотообесцвечивание и шторм изображений позволяет исследователям изучить фотосинтетические организмы в беспрецедентных деталях.
Фотообесцвечивание до STORM является важным шагом, который позволяет исследователям наблюдать расположение и динамики белков в autofluorescent организмов. Помимо цианобактерий мы продемонстрировали, что аутофлюоресценция цветковых растений, что Резуховидка также может быть угасает после 60 мин Фотообесцвечивание9. Фотообесцвечивание широко используется, например для улучшения соотношения сигнал шум и визуализация Биомаркеры последовательно20. Было также продемонстрировано что Фотообесцвечивание перед изображений является выгодным при наблюдении аутофлюоресценция образца под Рамановская спектроскопия21. Таким образом было бы целесообразно применять этот метод Фотообесцвечивание, чтобы уменьшить аутофлюоресценция других фотосинтетических организмов, включая эукариотических водорослей, сосудистых растений и организмов, содержащие Бактериохлорофиллы и proteorhodopsin.
Фотосинтетические организмы содержат различные пигменты, которые имеют различные спектров поглощения; Таким образом органических красителей и флуоресцентные белки должны быть разумно выбраны. Например, в этом исследовании, краска с максимальной возбуждения волны около 750 Нм был использован. Хотя два канала (750 нм и 650 Нм) имеющееся для ШТОРМА представлены здесь, Prochlorococcus autofluorescent сигналов может по-прежнему наблюдаться после разоблачения под 650 Нм лазер, даже после длительного Фотообесцвечивание. Это, вероятно, потому, что 650 Нм является одним из основных поглощения волн для Prochlorococcus. С другой стороны, некоторые Synechococcus и красные водоросли содержат фикоэритрин как их пигмент22, который имеет спектр поглощения от 488 нм до 560 Нм и минимальное поглощение 650 Нм23. Таким образом было бы целесообразно использовать канал 650 нм вместо 750-Нм канал для изучения белков внутри этих фикоэритрин содержащих автотрофы.
В резюме правильное сочетание Фотообесцвечивание и шторм обеспечивает мощный подход понять организацию белка в фотосинтезирующих клетках подробно, который далее будет выявить их динамики и потенциал функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Daiying Xu за ее техническую помощь и комментарии на рукопись. Это исследование поддерживается гранты от Фонда национального естественных наук Китая (номер 41476147 проекта) и научно-исследовательских грантов Советом Специального административного района Гонконг, Китай (номера проектов 689813 и 16103414).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser? Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
