Summary
在这里, 我们描述了一种光漂白方法, 以减少蓝藻的自体荧光。光漂白后, 采用随机光学重建显微镜获得蓝藻 ftsz 环的三维超分辨率图像。
Abstract
超分辨显微镜已被广泛用于研究许多生物体的蛋白质相互作用和亚细胞结构。然而, 在光合生物中, 超分辨率成像的横向分辨率仅为 ~ 100 纳米。低分辨率的主要原因是光合细胞的高自体荧光背景, 这是由高强度激光引起的, 而超强分辨率成像需要这些激光, 如随机光学重建显微镜 (storm)。在这里, 我们描述了一种光浸辅助 storm 方法, 该方法是最近开发的用于海洋皮亚星杆菌的成像。光漂白后, 有效地降低了红球菌的自体荧光, 使 storm 能够在横向分辨率 ~ 10 纳米的情况下进行。利用该方法, 我们获得了 ftsz 蛋白的体内三维 (三维) 组织, 并在红球菌的细胞周期中表征了四种不同的 ftsz 环形态。我们在这里描述的方法可以用于其他光合生物的超分辨率成像。
Introduction
超分辨率显微镜可以打破光的衍射极限, 并在亚衍射分辨率 (& lt; 200 nm) 内提供图像。它们已被广泛用于许多生物体的蛋白质定位和亚细胞结构的研究。主要的超分辨率显微镜方法包括结构照明显微镜 (sim)、受刺激的发射耗尽显微镜 (sted)、storm 和光激活定位显微镜 (palm)。这些超分辨率显微镜的机理和应用在其他地方已经审查了 1,2。
storm 可以通过空间分离3,4实现高达10纳米的分辨率。对于 storm, 只有一个分子在衍射有限的区域内被激活 ("开"), 其余的分子被保持灭活 ("关闭")。通过积累单个分子的快速开关, 可以生成一个 "衍射无限" 的图像 3.同时, storm 中还使用了多种有机染料和荧光蛋白, 使其易于从常规荧光显微镜升级到高分辨率显微镜5,6。
storm 在光合细胞中没有得到广泛的应用, 如蓝藻、藻类和叶绿体7, 8 的植物细胞, 这是因为 storm 需要较高的激光强度来驱动光致敏化。高强度激光在光合细胞中激发强自体荧光背景, 干扰 storm 成像中的单分子定位。为了利用 storm 研究光合细胞中的亚细胞结构或蛋白质相互作用, 我们开发了一种光漂白协议来抑制背景自体荧光信号9。在常规的免疫荧光染色过程中, 标本在封堵步骤中暴露在高强度的白光下, 从而降低光合细胞的自体荧光, 以满足 storm 的要求。因此, 该协议使得用 storm 研究色素生物成为可能。
在这里, 我们描述了使用 storm 来成像 ftsz 环组织在单细胞的五氯球菌的协议。ftsz 是一种高度保守的管状细胞骨架蛋白, 它聚合在细胞10的周长周围形成环状结构 (z 环), 对细胞分裂11至关重要.保鲜的红球菌细胞首先被光导, 以减少自荧光背景和免疫染色与初级抗 ftsz 抗体, 然后继发抗兔 igg (h + l) 抗体与荧光结合 (例如。, 亚历克沙·福鲁尔 750)。最终, storm 被用来观察不同细胞周期阶段的古氯球菌中的详细 ftsz 环组织。
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Protocol
1. 样品制备和固定
- 接种1毫升的轴突性普绿球菌med4 至5毫升的海水原基原发物12。在23°c 的光下生长红球菌培养, 强度为 35μmol photons/m m 2 s. 五天后, 将1毫升培养物收集成 1.5 ml 管。
注: 接种五天后,红球菌med4 将达到后期日志阶段, 约 108 细胞, 这适合 storm 成像。 - 将25% 的甲醛 (pfa) (wv) 和50% 戊二醛的2μl 加入 1.5 ml 管中, 将新鲜制备的甲醛切成 100μl, 以固定培养。在室温下在黑暗中孵化样品20分钟。
注: 样品被保存在黑暗中固定, 因为戊二醛是光敏感的。 - 以 13, 500 x克的速度将样品向下旋转 1分钟;然后, 去除上清液, 在 pro99 培养基12的100μl 中重新悬浮细胞。将样品存放在 4°c, 直到免疫染色。
2. 用聚苯乙烯珠预涂覆盖图
注: 聚苯乙烯微珠被认为是漂移校正的基准标记。
- 涡流原来的小瓶聚苯乙烯珠, 并准备1:20000 稀释与50% 乙醇作为工作浆料。
- 打开热板, 将温度设置为 120°c, 并将盖板放置在热板上。
- 将100μl 的工作浆料加载到每个盖板上。将盖板在热盘上加加作用 10分钟, 然后小心地将盖板转移到 petri 培养皿中, 以便在室温下存放。
注: 带有珠子的一侧应朝上, 细胞应连接在同一侧。这些珠子被固定在盖板上, 并用于在 storm 成像过程中实时校正样品漂移。固定珠子后, 盖板不能燃烧。
3. 聚 l-赖氨酸涂覆在珠子涂层覆盖片上
注: 这是为蓝藻细胞的固定化。
- 在盖板的中心添加100μl 的聚 l-赖氨酸 (1 mg/ml), 并将镀珠的一侧朝上。让它在室温下坐30分钟。
- 使用移液器仔细渴望未连接的聚 l-赖氨酸, 并将其转移到 1.5 ml 管。将多 l-赖氨酸保存在4°c 中, 以便重复使用。
- 用10毫升的超滤水在60毫米的 petri 培养皿中冲洗盖板, 然后用纸巾将盖板短暂擦干。
- 将盖板存放在培养皿 (100 毫米) 中, 供以后使用。为了防止盖板附着在盘子上, 用一层副虫将培养皿排成一行。
注: 预先涂上珠子和聚 l-赖氨酸的盖板可在室温下储存至少半年。因此, 强烈建议提前准备一批盖板。
4. 在覆盖上固定细胞
- 将预涂后的盖板转移到底部有副体的新培养皿中, 从今以后将被称为染色盘。将固定样品的100μl 加载在盖板上, 让它坐 30分钟, 以允许细胞附着。
- 把盖板转移到一个12井盘子的井里, 从今以后, 这将被称为洗碗。在井中加入1毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) (10 mLna 2hpo4、1.8 mm kh 2 po 4、137 mmncl 和 2.7 mm kcl, ph 7.4) 来清洗盖板。取出 pbs 缓冲区, 并添加一个新的 pbs 缓冲区, 以再次清洗盖板。
5. 蓝藻细胞的渗透性
- 使用移液器卸下 pbs 缓冲区。在洗涤盘的井中加入1毫升新鲜制备的渗透缓冲液, 其中含有0.05% 的非离子洗涤剂-100 (v/v)、10mm edta、10 mm tris (ph 8.0) 和 0.2 mgml lysozyme。
- 在37°c 下将洗涤盘加氢20分钟。然后, 删除渗透缓冲。
- 加入1毫升的 pbs 缓冲液, 并将洗碗放在振动台上, 将洗碗轻轻摇摇 5分钟. 取出 pbs 缓冲液。重复此步骤3x 来清洗盖板。
6. 叶绿素颜料在阻塞步骤中的光漂白
- 将盖板转移到染色盘。在盖板顶部加入50μl 的阻滞剂, 其中含有 0.2% (v/v) 非离子洗涤剂-100 和 3% (v/v) 山羊血清。
- 将整个染色板放在冰上, 并将其移动到氙气光源下进行至少60分钟的光漂白, 其光强为 1, 800μmol photons/m 2·s.
- 光漂白和阻塞后, 用纸巾边缘吸附, 小心地去除封堵缓冲液。
注: 光的强度非常高, 需要一副合适的太阳镜来保护眼睛。同时, 用铝箔包裹光源和板材, 避免光线泄漏, 以免造成眼睛损伤。每15分钟检查一次盖板, 以确保盖板保持湿润。如果盖液干燥, 请添加50μl 的阻滞剂。
7. 抗体结合
- 根据制造商的说明, 在200μl的水中溶解抗 anabaena ftsz 抗体。
- 将1μl 抗 ftsz 抗体稀释为99μl 的阻滞剂。在盖板上加入50μl 稀释的初级抗体, 在室温下孵育30分钟。
- 把被单转移到洗碗上。加入1毫升的 pbs 缓冲液, 并将洗碗放在摇匀上。轻轻摇洗洗盘 5分钟. 重复此步骤3x 清洗盖板。
- 将盖板转移到染色盘。将二级抗体的1μl 稀释为500μl 的阻滞剂。在盖板上加入50μl 稀释的二级抗体, 在室温下在黑暗中孵育30分钟。
- 把被单转移到洗碗上。用1毫升的 pbs 缓冲液清洗振动台。轻轻摇摇洗碗 5分钟, 用铝纸将洗碗包起来, 使其防光。重复此步骤3x。
- 将4% 的甲醛 (pfa) (w v) 新鲜制备的甲醛加入井中500μl。在室温下在黑暗中孵化盖板15分钟。
- 取出甲醛并重复清洗步骤3x。
- 将盖板存放在4°c 的 pbs 缓冲液中, 直到成像。
8. storm 成像缓冲器的制备
- 根据表 1准备1毫升的成像缓冲区, 紧接 storm 成像之前。
注: 由于成像缓冲器的保质期约为 2小时, 请在使用前准备好新鲜的。在添加葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶后, 避免涡旋。
注意: 甲基维柴油是有毒物质。请特别小心地处理这件事。环孢克泰酯被列为致癌物质猫。1种化学物质。请避免吸入和皮肤接触, 并在化学罩中制作环甲酸盐的库存溶液和成像缓冲液。
9. storm 数据的图像采集
- 在装载室中加载盖板 (图 1)。将新鲜制备的成像缓冲液轻轻装入室内, 以避免洗掉蓝藻细胞。将矩形盖板放置在成像缓冲器的顶部, 以防止其与空气中的氧气发生反应。避免在盖板下捕获气泡。
- 打开相机、led 灯和激光。打开 storm 软件, 用于图像采集、质心位置确定和样品漂移校正13。
- 在镜头顶部加入半滴浸入式油。加载腔内, 并确保目标的镜头与盖板接触。
- 用750纳米激光检查信号。
注: 始终包括第二个抗体-微小染色阴性控制, 以确保自身荧光减少。 - 确定同时包含单元格和基准标记的示例区域。启动软件, 进行漂移校正示例。
注: 一般情况下, 理想的样品区域包含10-30 细胞。同时, 细胞应很好地分离, 以避免任何重叠的细胞。 - 获取一个广域图像作为参考, 相机电子乘法 (em) 增益为 300, 曝光时间为30毫秒 (图 2 a)。
- 将750纳米激发激光强度提高到更高的功率, 约 4.5 kwcm2。一旦荧光体过渡到稀疏闪烁模式, 通过以 33 hz 收集 10, 000 帧来获取一个超分辨率图像 (图 2b)。
注: 如果荧光体不是孤立的, 请等待几分钟, 直到更多的荧光体切换到暗态, 分离的单个分子依次闪烁。此处描述的帧数适用于我们的示例, 需要针对其他目标结构进行优化。
10. 重建原始数据中的超分辨率图像
- 在 imagej 中使用一个名为"快速 palm ( 材料表")14的插件来重建三维颜色超分辨率图像。
注: 将出现一个初步的彩色图像 (图 2c) 以及彩色编码的刻度条 (图 2c)。颜色表示 z 轴上的深度。 - 为了演示视频中的三维结构, 请使用快速 palm14 每10纳米构造一叠带有 z 轴分割的超分辨率图像。调整堆栈的亮度并复制一个目标单元格的堆栈。在 imagej 中使用名为3d 查看器(材料表)15的插件生成单元格的三维图像。记录三维结构的旋转, 以便进行演示。
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Representative Results
storm 通过随机激活单个可光敏荧光体来实现超分辨率成像。记录每个荧光体的位置, 然后根据这些位置构建一个超分辨率图像4。因此, 荧光体定位的精度对于超分辨率图像重建具有重要意义。在447 纳米和680纳米的峰值和在波长大于700纳米16时, 普罗氯球菌的吸收光谱具有最低吸收.然而, 当暴露在750纳米激光的极高强度 (图 3a) 中时, pro氯球菌med4 细胞仍然会发出较高的自体荧光, 这是 storm 成像所必需的。因此,高自体荧光背景的原球菌细胞严重干扰超分辨率成像。
为了利用 storm 研究红球菌中的蛋白质组织, 我们开发了一种光漂白方法。在暴露于高强度的白光30分钟后, pro氯球菌med4 细胞的自体荧光减少 (图 3b), 但仍检测到几个具有自体荧光的细胞。我们进一步延长了光漂白时间到 60分钟, 发现大多数细胞失去了自体荧光 (图 3c)。这些结果表明, 我们开发的光漂白方法可以大大降低光合生物的自体荧光。
光漂白后, 我们能够使用 storm 来可视化原生球菌 med4 细胞中的细胞分裂蛋白 ftsz。原蓝菌是地球上最小、最丰富的光合生物.原球菌细胞的直径只有 500-700 nm 18.在细胞尺寸如此小的情况下, 使用传统的广域荧光显微镜无法直观地显示procl球菌细胞中的 ftsz 环组织 (图 2a)。但是, storm 在 xy 平面上的空间分辨率为 9.6 nm, 在 z 轴上的空间分辨率为 41.6 nm。使用 storm, 我们能够揭示在普氯球菌中ftsz 环的详细形态 (图 2b和4)。通过旋转三维 storm 图像, 我们确定了四种不同类型的 ftsz 环形态: 集群 (图 4a,电影 s1), 一个不完整的环 (图 4A,电影 s2), 一个完整的环 (图 4A,电影 s3) 和双环 (图 4d,电影 s4)。在前列腺球菌的完整 ftsz 环中观察到了差距 (图 4c,电影 s3), 这与在红杆菌19中发现的缝隙相似。这四种类型的 ftsz 环形态显示了产品群球菌细胞周期中 ftsz 环的组装过程, 这项研究帮助我们了解了 ftsz 环在红球菌细胞分裂过程中的作用9个。
图 1: 装载室和组装室的组件, 带有 storm 成像的盖板和成像缓冲器.与样品的盖板首先被放置在底部部分的凹槽上。然后, 上半部分被小心地拧紧到底部。成像缓冲器被添加到装载室, 然后小心地覆盖一个方形的覆盖物。应避免气泡, 以最大限度地减少任何可能影响测量精度的运动。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: pro氯球菌 med4 中 ftsz 的代表性广域、2-d storm 和三维色 storm 图像.这些图像是使用常规 (a) 广域显微镜、(b) 二维 storm 和 (c) 三维颜色 storm 从同一视野中拍摄的。面板 c 中的颜色表示 z 轴上荧光信号的深度。c组中的数字表示感兴趣的单元格。刻度条 = 1μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3:前列腺球菌 med4的光漂白.固定的前列腺球菌med4 细胞 (a)未被光浸出, 或者被光浸出30分钟和 (c) 60分钟。xenon 氙气光的强度为 1800μmom2·s. 细胞被 750纳米激光激发, 强度与 storm 成像相同。用 storm 中使用的相同滤光片对自能荧光进行了成像, 以确保存在最小的自体荧光来影响 storm。刻度条 = 2μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 四个 ftsz 环形态的代表性 storm 图像.在普绿球菌中观察到四种不同的 ftsz 环形态: (a) 簇, (b) 不完全环, (c) 一个完整的环, 和 (d) 双环。对于同一细胞, 显示了 (i) 广域荧光显微镜、(ii) xy 平面上的 storm 和 (iii) 旋转后的 storm 图像。与面板a、 b、 c和d中的单元格相对应的三维影片分别显示在 "电影 s1"、"s2"、"s3" 和 "s4" 中。刻度柱 = 500 纳米。请点击这里查看此图的较大版本.
| 化学品 | 库存解决方案 | 最终浓度 |
| 葡萄糖 | n a | 10% (w) |
| Tris-Cl (ph 值 8.0) | 50万米 | 50 mm |
| 抗坏血酸 | 100 mm | 1米 |
| 维洛芬甲酯 | 100 mm | 1米 |
| cyclocattraene | 200 mm | 2米 |
| tcep | 50万米 | 25米 |
| 葡萄糖氧化酶 | 56 mg/ml | 0.56 毫米/毫升 |
| 过氧化氢 酶 | 4 mg/ml | 40μml |
表 1: 成像缓冲区的配方。
电影 s1: 在前列腺癌球菌med4 细胞.请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
电影 s2: 在前列腺癌球菌med4 细胞.请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
电影 s3: 在前列腺癌球菌med4 细胞.请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
电影 s4: 在前列腺癌球菌med4 细胞.请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
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Discussion
在该协议中, 我们描述了一个程序, 以显著减少原蓝菌的自体荧光 (图 3c), 然后, 免疫抑制细胞中的蛋白质, 使我们能够利用 storm 来研究三维 ftsz在古氯球菌环形态(图 4)。该协议可用于其他光合生物的超分辨率成像。
以往对光合生物的研究主要是使用 sim 卡实现超分辨率成像, 因为 sim 不需要高强度的激光。然而, sim 的空间分辨率只有 ~ 100 nm 1,比 storm 低得多。在本研究中, storm 图像的空间分辨率在氧平面上可以达到9.6 纳米, 在 z 轴9中可以达到 41.6 nm。光漂白和 storm 成像提供的改进分辨率使研究人员能够以前所未有的细节研究光合生物。
storm 之前的光漂白是一个关键的步骤, 使研究人员能够观察蛋白质在自身荧光生物中的位置和动态。除蓝藻外, 我们还证明了开花植物拟南芥的自体荧光也可以在光漂白9的60分钟后淬火。光漂白已被广泛使用, 例如, 提高信噪比和多个生物标志物的按顺序20的可视化。研究还表明, 在拉曼光谱21下观察自体荧光样品时, 成像前的光漂白是有利的。因此, 应用这种光漂白方法来减少其他光合生物的自体荧光, 包括真核藻类、维管植物以及含有蛋白血孔酶和细菌叶绿素的生物体。
光合生物含有不同的色素, 具有不同的吸收光谱;因此, 有机染料和荧光蛋白需要谨慎选择。例如, 在这项研究中, 使用了最大激发波长约为750纳米的染料。尽管这里介绍的 storm 有两个通道 (750 纳米和650纳米), 但即使在长时间的光漂白下, 即使在650纳米激光下暴露, 也仍然可以观察到普通球菌自动荧光信号。这可能是因为650纳米是古氯球菌的主要吸收波长之一。另一方面, 一些棘球球菌和红藻含有植物菊酯作为其色素22, 其吸收光谱从488纳米到560纳米, 最低吸收为650纳米23。因此, 使用650纳米通道而不是750纳米通道来研究这些含有植物菊酯自养的蛋白质可能是可行的。
总之, 光漂白和 storm 的适当结合为详细了解光合细胞中的蛋白质组织提供了一种强有力的方法, 这将进一步揭示它们的动力学和潜在功能。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢徐黛英对手稿的技术援助和评论。这项研究得到了中国国家自然科学基金 (项目编号 41476147) 和中国香港特别行政区研究资助局 (项目编号689813和 16103414) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
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