Summary
Aqui nós descrevemos um método fotobranqueamento para reduzir a autofluorescência de cianobactérias. Depois fotobranqueamento, microscopia de reconstrução óptica estocástico é usada para obter imagens tridimensionais de super-resolução do anel FtsZ cianobactérias.
Abstract
Microscopia de super-resolução tem sido amplamente utilizada para o estudo das interações da proteína e estruturas subcelulares em muitos organismos. Em organismos fotossintéticos, no entanto, a resolução lateral da imagem latente de super-resolução é apenas ~ 100 nm. A baixa resolução é principalmente devido à alta autofluorescência fundo das células fotossintéticas causada por lasers de alta intensidade que são necessários para a imagem latente de super-resolução, tais como a microscopia de reconstrução óptica estocástico (Tempestade). Aqui, descrevemos um assistida fotobranqueamento tempestade método que foi desenvolvido recentemente para o picocyanobacterium marinho ficobilinasde imagem. Após fotobranqueamento, a autofluorescência de ficobilinas efetivamente é reduzida assim que a tempestade pode ser realizada com uma resolução lateral de ~ 10 nm. Usando este método, podemos adquirir a organização na vivo tridimensional (3D) da proteína FtsZ e caracterizar quatro diferentes morfologias de anel FtsZ durante o ciclo celular de ficobilinas. O método que descrevemos aqui pode ser adotado para o tratamento de imagens de super-resolução de outros organismos fotossintéticos.
Introduction
Microscopies de super-resolução podem quebrar o limite de difração de luz e fornecer imagens dentro de resoluções de difração sub (< 200 nm). Eles têm sido amplamente utilizados em muitos organismos para estudar a localização da proteína e estruturas subcelulares. Major Super-resolução microscopia métodos incluem iluminação estruturada microscopia (SIM), estimulou a microscopia de depleção de emissão (STED), tempestade e microscopia de localização fotoativados (PALM). Os mecanismos e aplicações destes super-resolução microscópios foram revisaram em outro lugar1,2.
TEMPESTADE pode alcançar uma resolução tão alta quanto 10 nm por separação espacial3,4. Para tempestade, somente uma molécula dentro de uma região de difração limitada é ativada ("on") e o resto das moléculas são mantidas inactivada ("off"). Pelo acúmulo de ligar rápido e - fora de moléculas simples, uma imagem "difração-ilimitado" pode ser gerado3. Entretanto, muitos tipos de corantes orgânicos e proteínas fluorescentes são aplicáveis na tempestade, permitindo uma atualização fácil de microscopia de fluorescência regular para microscopia de alta resolução5,6.
TEMPESTADE não tem sido amplamente aplicada em células fotossintéticas, como cianobactérias, algas, e células vegetais com cloroplastos7,8, que é devido ao fato de que a tempestade requer intensidade elevada do laser para unidade photoswitching. O laser de alta intensidade desfavoravelmente excita autofluorescência forte fundo nas células fotossintéticas e interfere com a localização do único-molécula em imagem de tempestade. Para usar a tempestade para investigar as estruturas subcelulares ou interações da proteína nas células fotossintéticas, desenvolvemos um protocolo de fotobranqueamento para saciar o fundo autofluorescência sinais9. Em um procedimento de coloração imunofluorescente rotina, amostras são expostas a luz branca de alta intensidade durante a etapa de bloqueio, o que reduz a autofluorescência de células fotossintéticas para cumprir as exigências para a tempestade. Assim, este protocolo torna viável para investigar organismos pigmentados com tempestade.
Aqui, descrevemos o protocolo para usar a tempestade a imagem da organização de anel FtsZ no picocyanobacterium unicelular ficobilinas. FtsZ é uma proteína do citoesqueleto altamente conservada de tubulina, como que se polimeriza para formar uma estrutura em anel (o anel Z) em torno da circunferência de uma célula10 e é essencial para a divisão celular11. Preservado ficobilinas células são primeira foto para reduzir a autofluorescent fundo e immunostained com um anticorpo primário anti-FtsZ, e em seguida um anticorpo de IgG (H + L) de antisecundário coelho é conjugado com um fluoróforo (por exemplo, , Alexa Fluor 750). Eventualmente, a tempestade é usado para observar as organizações de anel FtsZ detalhadas em ficobilinas durante fases do ciclo celular diferente.
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Protocol
1. preparação e fixação da amostra
- Inocule 1 mL de axénica MED4 ficobilinas para 5 mL do baseado em água do mar Pro99 médio12. Cultivar culturas ficobilinas a 23 ° C, sob a luz com uma intensidade de 35 µmol fótons/m2s. cinco dias depois, coletar 1 mL da cultura para um tubo de 1,5 mL.
Nota: Cinco dias após a inoculação, ficobilinas MED4 atingirá a fase tardia do log, com aproximadamente 108 células/mL, que é apropriado para a imagem latente de tempestade. - Adicione 100 µ l de formol recentemente preparada de 25% paraformaldeído (PFA) (p/v) e 2 µ l de 50% de glutaraldeído no tubo de 1,5 mL para corrigir a cultura. Incube a amostra no escuro à temperatura ambiente por 20 min.
Nota: A amostra foi mantida no escuro para fixação porque o glutaraldeído é luz sensível. - Girar a amostra a 13.500 x g por 1 min; em seguida, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 100 µ l do médio Pro9912. Armazene a amostra a 4 ° C até immunostaining.
2. precoating da lamela com esferas de poliestireno
Nota: Grânulos de poliestireno são considerados como o Marcador fiducial para correção de deriva.
- Vórtice original frasco de esferas de poliestireno e preparar uma diluição de 1: 20.000 com 50% de etanol como da pasta de trabalho.
- Vire o prato quente, regule a temperatura de 120 ° C e coloque as lamelas na chapa quente.
- Carrega 100 µ l de pasta de trabalho no sentido cada lamela. Incubar a lamela na chapa quente por 10 min e, em seguida, transferir com cuidado as lamelas para placas de Petri para armazenamento à temperatura ambiente.
Nota: O lado com os grânulos anexado a ele deveria enfrentar, e as células devem ser conectadas no mesmo lado. Os grânulos são imobilizados nas lamelas e usados para corrigir a amostra-à deriva em tempo real durante a imagem latente de tempestade. Depois imobilizando as contas, as lamelas não podem ser inflamadas.
3. revestimento de poli-L-lisina no sentido do lamela grânulo-revestido
Nota: Isto é feito para a imobilização de células de cianobactérias.
- Adicione 100 µ l de poli-L-lisina (1 mg/mL) para o centro da lamela com a grânulo-revestido virados para cima. Deixe descansar por 30 min à temperatura ambiente.
- Use uma pipeta para cuidadosamente aspire o poli-L-lysine desanexado e transferir para um tubo de 1,5 mL. Salve o poli-L-lisina a 4 ° C para reutilização.
- Enxágue a lamela com 10 mL de água ultrafiltrada em uma placa de Petri 60mm e seque brevemente a lamela sobre papel absorvente.
- Armazene a lamela em uma placa de Petri (100 mm) para uso posterior. Para evitar que o acessório da lamela ao prato, linha da placa de Petri com uma camada de parafilme.
Nota: A lamela, revestida com grânulos e poli-L-lisina, pode ser armazenada em temperatura ambiente pelo menos meio ano. Portanto, preparar um lote de lamelas com antecedência é altamente recomendado.
4. imobilização de células em lamela
- Transferi uma lamela pré-revestido para uma nova placa de Petri com parafilm na parte inferior, o qual será referido como o prato de coloração de agora em diante. Carregar 100 µ l da amostra fixa na lamela e deixe descansar por 30 min permitir a fixação da célula.
- Transferi a lamela para um poço de uma placa de 12 poços, que será referido como o prato de lavar daqui em diante. Adicione 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) (10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl e 2,7 mM KCl, pH 7,4) ao poço para lavar a lamela. Retire o tampão PBS e adicionar um novo buffer de PBS para lavar a lamela novamente.
5. permeabilização de células de cianobactérias
- Retire o tampão PBS com uma pipeta. Adicione 1 mL de tampão de permeabilização preparadas para o poço do lavar um prato, que contém 0.05% não-iónicos detergente-100 (v/v), 10 mM de EDTA, 10mm Tris (pH 8.0) e lisozima 0,2 mg/mL.
- Incube o lavar prato a 37 ° C por 20 min. Em seguida, remova o buffer de permeabilização.
- Adicionar 1 mL de tampão PBS e coloque o prato de lavar um agitador que treme delicadamente o prato de lavagem por 5 min. Retire o tampão PBS. Repita este passo 3 x para lavar a lamela.
6. fotobranqueamento da clorofila pigmentos em uma etapa de bloqueio
- Transferi a lamela para o prato de coloração. Adicione 50 µ l de tampão de bloqueio, que contém detergente não-iônico de 0,2% (v/v)-100 e 3% (v/v) de soro de cabra, na parte superior da lamela.
- Coloque toda a mancha placa no gelo e movê-lo sob a fonte de luz de xenônio para fotobranqueamento pelo menos 60 min, com uma intensidade de luz em 1.800 µmol fótons/m2·s.
- Depois fotobranqueamento e bloquear, remova cuidadosamente o tampão de bloqueio fixando-o com a borda de uma toalha de papel.
Nota: A intensidade de luz de xenônio é tão alta que um par de óculos adequados é necessário para a proteção de olho. Enquanto isso, enrole a fonte de luz e a placa usando papel alumínio para evitar o vazamento de luz, que pode causar lesões oculares. Verificar a cada 15 min lamela para certificar-se que a lamela permanece úmida. Se a lamela é seca, adicione 50 µ l de tampão de bloqueio.
7. anticorpo ligação
- Dissolva anti -Anabaena FtsZ anticorpo em 200 µ l de água de acordo com as instruções do fabricante.
- Dilua 1 µ l de anticorpo anti-FtsZ em 99 µ l de tampão de bloqueio. Adicionar 50 µ l de anticorpo primário diluído na lamela e incube-lo em temperatura ambiente por 30 min.
- Transferi a lamela ao lavar prato. Adicionar 1 mL de tampão PBS e coloque o prato de lavagem em um milk-shake. Agite suavemente o prato de lavagem 5 min. Repita este passo 3x para lavar a lamela.
- Transferi a lamela para o prato de coloração. Dilua 1 µ l de um anticorpo secundário em 500 µ l de tampão de bloqueio. Adicionar 50 µ l de anticorpo secundário diluído no sentido do lamela e incube-lo por 30 min no escuro à temperatura ambiente.
- Transferi a lamela ao lavar prato. Lave-a com 1 mL de tampão PBS um agitador. Agite delicadamente o prato de lavagem 5 min. Wrap o lavar prato com papel de alumínio para torná-lo opaco. Repita este passo 3 x.
- Adicione 500 µ l de formol recentemente preparada de paraformaldeído 4% (PFA) (p/v) para o poço. Incube a lamela por 15 min no escuro à temperatura ambiente.
- Remover o formaldeído e repita a etapa de lavagem 3 x.
- Armazene a lamela em tampão PBS a 4 ° C, no escuro até a imagem.
8. preparação da tempestade Buffer de imagem
- Prepare-se 1 mL de reserva de acordo com a tabela 1, imediatamente antes da imagem de tempestade de imagem.
Nota: Como a vida de prateleira do buffer de imagem é cerca de 2 h, prepará-lo fresco, antes do uso. Evite a utilização do Vortex após a adição de glicose oxidase e catalase.
Cuidado: Metil viologênio é material venenoso. Por favor, manipulá-lo com especial cuidado. Ciclooctatetraeno é classificado como uma substância cancerígena gato. 1 química. Por favor evitar a inalação e contacto com a pele e fazer o buffer de imagem e solução ciclooctatetraeno em uma capa de química.
9. imagem aquisição de dados de tempestade
- Carrega a lamela na câmara de carga (Figura 1). Carrega o buffer de imagem recentemente preparado suavemente na câmara para evitar lavar as células de cianobactérias. Coloque uma lamela retangular na parte superior o buffer de imagem para evitar que sua reação com o oxigênio do ar. Evite as bolhas de ar de armadilhagem debaixo da lamela.
- Ligue a câmera, a luz de LED e o laser. Software aberto de tempestade para aquisição de imagens, determinação de posição do centroide e amostra deriva de correção13.
- Adicione meia gota de óleo de imersão sobre a lente. Carregar a câmara e verifique se a lente do objectivo entra em contato com a lamela.
- Examine o sinal com um laser de 750 nm.
Nota: Sempre incluem um segundo controle negativo-negativo-mancha do anticorpo para garantir que a autofluorescência é diminuída. - Identifica uma área de amostra que contém células e marcadores fiduciais. Inicie o software por exemplo correção de deriva.
Nota: em geral, a área de amostra ideal contém células de 10-30. Entretanto, as células devem ser separadas para evitar quaisquer células sobrepostas. - Adquirir uma imagem de campo amplo, como referência, com a multiplicação de elétron de câmera (EM) ganho em 300 e um tempo de exposição de 30 ms (Figura 2A).
- Aumente a intensidade do laser de 750 nm de excitação a um poder superior, aproximadamente 4,5 kW/cm2. Uma vez que o fluorophores ter transferida em um padrão piscante esparso, adquira uma super resolução de imagem através da recolha de 10.000 quadros a 33 Hz (Figura 2B).
Nota: Se o fluorophores não são isolados, espere alguns minutos até mais fluorophores são comutados ao estado escuro e as moléculas isoladas de única piscam sequencialmente. O número de quadros descrito aqui é apropriado para nossa amostra e precisa ser otimizado para outras estruturas alvo.
10. reconstrução de imagens de super-resolução de dados brutos
- Use um plugin chamado QuickPALM (Tabela de materiais)14 no ImageJ para reconstruir uma imagem de super-resolução cor 3-d.
Nota: Uma preliminar cromática imagem (Figura 2) junto com uma barra de código de cores de escala (Figura 2) aparecerá. A cor representa a profundidade sobre o eixo z. - Para demonstrar o 3-d estrutura em uma construção de vídeo, uma pilha de super-resolução imagens com eixo z seccionado cada 10 nm, utilizando QuickPALM14. Ajustar o brilho das pilhas e duplicar a pilha de célula de um alvo. Use um plugin chamado visualizador 3D (Tabela de materiais)15 no ImageJ para gerar a imagem em 3D da célula. Recorde a rotação da estrutura 3-d para fins de demonstração.
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Representative Results
TEMPESTADE atinge imagem super-resolução ativando photoswitchable individuais fluorophores estocàstica. A localização de cada fluoróforo é registrada e uma imagem de super-resolução então é construída com base nestes locais4. Portanto, a precisão da localização fluoróforo é importante para a reconstrução de imagem super resolução. Os espectros de absorção de ficobilinas um pico de 447 nm e 680 nme ficobilinas tem uma absorção mínima em comprimentos de onda acima de 700 nm16. No entanto, ficobilinas MED4 células ainda emitido autofluorescência alta quando expostas a uma intensidade extremamente alta do laser 750 nm (Figura 3A), que é necessário para a imagem latente de tempestade. Assim, o plano de fundo de alta autofluorescência de ficobilinas células fortemente interfere com super resolução.
Para utilizar a tempestade para investigar organizações proteína em ficobilinas, desenvolvemos um método de fotobranqueamento. Após a exposição a uma luz branca de alta intensidade por 30 min, a autofluorescência de ficobilinas MED4 células diminuída (Figura 3B), apesar de várias células com autofluorescência ainda foram detectadas. Nós ainda mais alongado o fotobranqueamento tempo de 60 min e encontrado que a maioria das células perdeu sua autofluorescência (Figura 3). Estes resultados indicam que o método de fotobranqueamento que desenvolvemos aqui pode diminuir consideravelmente a autofluorescência em organismos fotossintéticos.
Depois fotobranqueamento, fomos capazes de usar a tempestade para visualizar a divisão celular proteína FtsZ em ficobilinas MED4 células. A associação ficobilinas é o menor e o organismo fotossintético mais abundante na terra17. O diâmetro de uma célula de ficobilinas é apenas 500-700 nm18. Com um tamanho de pequenas células, é impossível Visualizar a organização de anel FtsZ ficobilinas células usando microscopia de fluorescência convencional de campo amplo (Figura 2A). No entanto, a tempestade tem uma resolução espacial de 9,6 nm no plano xy e 41.6 nm no eixo z. Usando a tempestade, fomos capazes de revelar uma morfologia detalhada do anel FtsZ ficobilinas (figuras 2B e 4). Rodando em 3D imagens de tempestade, identificamos quatro tipos diferentes de morfologias de anel FtsZ: clusters (Figura 4A, S1 de filme), um anel incompleto (Figura 4B, Filme S2), um anel completo (Figura 4 C, Filme S3) e duplo anéis (Figura 4 D, Filme S4). As lacunas foram observadas nos anéis FtsZ completos de ficobilinas (Figura 4, Filme S3), que é semelhante ao encontrado em Caulobacter cresentus19. Estes quatro tipos de morfologias de anel FtsZ mostraram o processo de montagem do anel FtsZ durante o ciclo celular de ficobilinas, e este estudo ajudou-na compreender o papel do anel FtsZ durante a divisão celular de ficobilinas 9.
Figura 1: componentes da câmara de carga e a câmara montada com o buffer de lamelas e de imagem para a imagem latente tempestade. A lamela com a amostra foi colocada na ranhura da parte de baixo primeiro. A parte superior então foi cuidadosamente aparafusada na parte inferior. O buffer de imagem foi adicionado na câmara de carga e então cuidadosamente coberto com uma lamela quadrada. Bolhas devem ser evitadas para minimizar qualquer movimento que pode influenciar a precisão da medição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representante de campo amplo, tempestade 2-D e 3-d colorem imagens de tempestade de FtsZ em MED4 ficobilinas . As imagens foram tiradas do mesmo campo de visão usando regular (A) microscopia de campo amplo, tempestade de 2-D (B) e (C) 3-d cor de tempestade. As cores no painel C indicam a profundidade dos sinais fluorescentes no eixo z. Os números no painel C indicam as células de interesse. As barras de escala = 1 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fotobranqueamento de ficobilinas MED4. Fixo ficobilinas MED4 células foram (A), não a foto, ou eram foto para (B) 30 min e (C) 60 min. A luz de xénon XD-300 foi usada em uma intensidade de 1.800 µmol/m2·s células estavam animadas por um laser de 750 nm na mesma intensidade como foi usado para a imagem latente de tempestade. Os autofluorescences foi fotografadas com os mesmos filtros como usado na tempestade para garantir a presença de autofluorescência mínima para afetar a tempestade. As barras de escala = 2 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagens de tempestade representativa de quatro morfologias de anel FtsZ. Quatro diferentes morfologias de anel FtsZ foram observadas em ficobilinas: clusters de (A), (B) um incompleto anel, anel (C) um completo e duplos anéis (D). Para a mesma cela, foram mostradas imagens de microscopia de fluorescência de campo amplo (i), (ii) a tempestade sobre o plano xy e (iii) a tempestade após a rotação. Os filmes em 3D correspondente às células em painéis A, B, Ce D são mostrados em filmes S1, S2, S3 e S4, respectivamente. As barras de escala = 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Produtos químicos | Solução-mãe | Concentração final |
| glicose | N/A | 10% (p/v) |
| Tris-Cl (pH 8.0) | 0,5 M | 50 mM |
| Ácido ascórbico | 100 mM | 1 mM |
| Metil viologênio | 100 mM | 1 mM |
| Ciclooctatetraeno | 200 mM | 2 mM |
| TCEP | 0,5 M | 25 mM |
| Glicose oxidase | 56 mg/ml | 0,56 mg/ml |
| Catalase | 4 mg/ml | 40 µ g/ml |
Tabela 1: Receita para o buffer de imagem.
Filme S1: aglomerados de proteínas FtsZ observaram em Ficobilinas Células MED4. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Filme S2: um anel incompleto de proteínas FtsZ observado em Ficobilinas Células MED4. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Filme S3: um anel completo de proteínas FtsZ observado em Ficobilinas Células MED4. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Filme S4: um anel duplo de proteínas FtsZ observado em Ficobilinas Células MED4. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Neste protocolo, descrevemos um procedimento para reduzir significativamente a autofluorescência da Associação ficobilinas (Figura 3) e, em seguida, delgados das proteínas nas células, que nos permitiram utilizar tempestade para estudar a FtsZ 3D morfologias anel em ficobilinas (Figura 4). Este protocolo pode ser adotado para a imagem latente de super-resolução em outros organismos fotossintéticos.
Estudos anteriores sobre os organismos fotossintéticos usado principalmente SIM conseguir Super-resolução de imagem porque SIM não exige lasers de alta intensidade. No entanto, a resolução espacial do SIM apenas ~ 100 nm1, que é muito menor do que da tempestade. Neste estudo, a resolução espacial das imagens de tempestade pode chegar a 9,6 nm no plano xy e 41.6 nm do eixo z9. A resolução melhorada fornecida pelo fotobranqueamento e tempestade imagem permite aos pesquisadores estudar organismos fotossintéticos em detalhes sem precedentes.
Fotobranqueamento antes da tempestade é um passo crítico que permite que os pesquisadores a observar a localização e dinâmica de proteínas em organismos autofluorescent. Além de cianobactérias, demonstrámos que autofluorescência da planta que Arabidopsis thaliana também poderia ser saciada após 60 min de fotobranqueamento9. O fotobranqueamento tem sido amplamente utilizado, por exemplo para melhorar a relação sinal-ruído e a visualização de vários biomarcadores sequencialmente20. Foi também demonstrado que fotobranqueamento antes de imagiologia é vantajosa quando observar uma amostra de autofluorescência debaixo de Espectroscopia Raman21. Portanto, pode ser viável a aplicação deste método de fotobranqueamento para reduzir a autofluorescência de outros organismos fotossintéticos, incluindo algas eucarióticas, plantas vasculares e organismos contendo proteorhodopsin e bacterioclorofila.
Organismos fotossintéticos contêm pigmentos diferentes que têm diferentes espectros de absorção; Portanto, corantes orgânicos e proteínas fluorescentes precisam ser selecionados de forma prudente. Por exemplo, no presente estudo, uma tintura com um comprimento de onda de excitação máxima de cerca de 750 nm foi usado. Apesar de dois canais (750 nm e 650 nm) estão disponíveis para a tempestade aqui apresentados, ficobilinas autofluorescent sinais ainda poderiam ser observados após ser exposto sob um laser de 650 nm, mesmo depois de fotobranqueamento prolongado. Isto é provavelmente porque 650 nm é um dos comprimentos de onda de absorção importante para ficobilinas. Por outro lado, alguns Synechococcus e algas vermelhas contêm ficoeritrina como seu pigmento22, que tem um espectro de absorção de 488 nm a 560 nm e uma absorção mínima de 650 nm23. Portanto, pode ser viável usar um canal de 650 nm em vez de um canal de 750 nm para estudar as proteínas dentro estes autótrofos ficoeritrina-contendo.
Em resumo, uma combinação adequada de fotobranqueamento e tempestade fornece uma poderosa abordagem para compreender a organização de proteínas nas células fotossintéticas, detalhadamente, o que mais irá revelar sua função dinâmica e potencial.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer Daiying Xu para a assistência técnica e comentários sobre o manuscrito. Este estudo é suportado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais da China (número do projeto 41476147) e Conselho de bolsas de investigação de Hong Kong região administrativa especial, China (números do projeto, 689813 e 16103414).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
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