Summary
यहाँ हम cyanobacteria के autofluorescence को कम करने के लिए एक photobleaching विधि का वर्णन करते हैं । photobleaching के बाद, stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी cyanobacterial FtsZ अंगूठी के तीन आयामी सुपर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
Abstract
सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से कई जीवों में प्रोटीन बातचीत और सेलुलर संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । संश्लेषक जीवों में, हालांकि, सुपर संकल्प इमेजिंग के पार्श्व संकल्प केवल ~ १०० एनएम है । कम संकल्प मुख्य रूप से उच्च तीव्रता पराबैंगनीकिरण है कि सुपर संकल्प इमेजिंग, जैसे stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के लिए आवश्यक है की वजह से संश्लेषक कोशिकाओं की उच्च autofluorescence पृष्ठभूमि के कारण है । यहां, हम एक photobleaching-सहायता स्टॉर्म विधि जो हाल ही में इमेजिंग समुद्री picocyanobacterium Prochlorococcusके लिए विकसित किया गया था का वर्णन । photobleaching के बाद, Prochlorococcus के autofluorescence प्रभावी ढंग से कम है ताकि तूफान ~ 10 एनएम के एक पार्श्व संकल्प के साथ किया जा सकता है । इस विधि का प्रयोग, हम vivo में तीन आयामी (3-डी) FtsZ प्रोटीन के संगठन का अधिग्रहण और Prochlorococcusके सेल चक्र के दौरान चार अलग FtsZ अंगूठी morphologies की विशेषता है । विधि हम यहां का वर्णन अंय संश्लेषक जीवों के सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए अपनाया जा सकता है ।
Introduction
सुपर संकल्प माइक्रोस्कोप्स प्रकाश की विवर्तन सीमा को तोड़ने और उप-विवर्तन प्रस्तावों (< २०० एनएम) के भीतर छवियों को प्रदान कर सकते हैं । वे कई जीवों में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है प्रोटीन स्थानीयकरण और सेलुलर संरचनाओं का अध्ययन । प्रमुख सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी विधियों संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम), प्रेरित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (STED), तूफान, और photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) शामिल हैं । तंत्र और इन सुपर संकल्प सूक्ष्मदर्शी के आवेदनों की समीक्षा की गई है कहीं और1,2।
तूफान के रूप में उच्च के रूप में एक संकल्प प्राप्त कर सकते है 10 स्थानिक जुदाई3,4द्वारा एनएम । तूफान के लिए, एक विवर्तन-सीमित क्षेत्र के भीतर केवल एक अणु ("पर") सक्रिय है और अणुओं के बाकी निष्क्रिय रखा जाता है ("बंद") । तेजी से स्विच का एक संचय करके-पर और एक अणुओं के बंद, एक "विवर्तन-असीमित" छवि उत्पंन किया जा सकता है3। इस बीच, कार्बनिक रंजक और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कई प्रकार के तूफान में लागू होते हैं, नियमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी5,6के लिए एक आसान उन्नयन की अनुमति ।
तूफान व्यापक रूप से संश्लेषक कोशिकाओं में लागू नहीं किया गया है, जैसे cyanobacteria, शैवाल, और chloroplasts के साथ संयंत्र कोशिकाओं7,8, जो इस तथ्य के कारण है कि तूफान photoswitching ड्राइव करने के लिए उच्च लेजर तीव्रता की आवश्यकता है । उच्च तीव्रता लेजर प्रतिकूल संश्लेषक कोशिकाओं में मजबूत autofluorescence पृष्ठभूमि उत्तेजित और स्टॉर्म इमेजिंग में एकल अणु स्थानीयकरण के साथ हस्तक्षेप । आदेश में उपसेलुलर संरचनाओं या संश्लेषक कोशिकाओं में प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए तूफान का उपयोग करने के लिए, हम पृष्ठभूमि autofluorescence9संकेतों को बुझाने के लिए एक photobleaching प्रोटोकॉल विकसित किया । एक नियमित immunofluorescent धुंधला प्रक्रिया में, नमूनों अवरुद्ध कदम है, जो संश्लेषक कोशिकाओं तूफान के लिए आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए autofluorescence को कम करती है के दौरान एक उच्च तीव्रता के सफेद प्रकाश को उजागर कर रहे हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल यह संभव तूफान के साथ pigmented जीवों की जांच करने के लिए बनाता है ।
यहां, हम कोशिकीय picocyanobacterium Prochlorococcusमें FtsZ अंगूठी संगठन छवि के लिए तूफान का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । FtsZ एक उच्च संरक्षित tubulin-तरह cytoskeletal प्रोटीन है जो एक अंगूठी संरचना (एक सेल10 की परिधि के चारों ओर Z अंगूठी) के रूप में polymerizes है और सेल के लिए आवश्यक है विभाजन11। संरक्षित Prochlorococcus कोशिकाओं पहले photobleached एक प्राथमिक विरोधी FtsZ एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि और immunostained को कम करने के लिए कर रहे हैं, और फिर एक माध्यमिक विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) एंटीबॉडी एक संयुग्मित के साथ fluorophore है (उदा. , Alexa Fluor ७५०) । अंततः, तूफान अलग सेल चक्र चरणों के दौरान Prochlorococcus में विस्तृत FtsZ अंगूठी संगठनों का पालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
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Protocol
1. नमूना तैयारी और निर्धारण
- Inoculate axenic Prochlorococcus MED4 के 1 मिलीलीटर के समुद्री जल के 5 मिलीलीटर आधारित Pro99 मध्यम12। ३५ µmol फोटॉनों की तीव्रता के साथ प्रकाश के तहत 23 डिग्री सेल्सियस पर Prochlorococcus संस्कृतियों हो जाना/पांच दिन बाद, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में संस्कृति के 1 मिलीलीटर इकट्ठा ।
नोट: टीका के पांच दिन बाद, Prochlorococcus MED4 देर से लॉग चरण में पहुंच जाएगा, लगभग 108 सेल/एमएल, जो स्टॉर्म इमेजिंग के लिए उपयुक्त है । - संस्कृति को ठीक करने के लिए १.५-एमएल ट्यूब में 25% paraformaldehyde (पीएफए) (डब्ल्यू/वी) और 2 µ एल के ५०% glutaraldehyde से तैयार हौसले से formaldehyde के १०० µ एल जोड़ें । 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में नमूना मशीन ।
नोट: नमूने को निर्धारण के लिए अंधेरे में रखा गया क्योंकि glutaraldehyde हल्का संवेदनशील है. - 1 मिनट के लिए १३,५०० x g पर नमूना नीचे स्पिन; फिर, supernatant निकालें और १०० µ l Pro99 मध्यम12में कक्षों को पुनर्स्थगित । immunostaining तक 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना संग्रहीत ।
2. Polystyrene मोतियों के साथ Coverslip की कोटिंग
नोट: Polystyrene मोती बहाव सुधार के लिए फिड्यूशियल मार्कर के रूप में माना जाता है ।
- भंवर polystyrene मोतियों की मूल शीशी और एक 1:20000 कमजोर पड़ने के साथ काम कर घोल के रूप में ५०% इथेनॉल तैयार करते हैं ।
- गर्म थाली पर बारी, १२० डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान सेट, और गर्म थाली पर coverslips जगह है ।
- प्रत्येक coverslip पर काम कर घोल के १०० µ एल लोड । 10 मिनट के लिए गर्म थाली पर coverslip गर्मी और, तो, ध्यान से कमरे के तापमान पर भंडारण के लिए पेट्री व्यंजन के लिए coverslips हस्तांतरण ।
नोट: इसके साथ संलग्न मोतियों के साथ साइड को फेस करना चाहिए, और कोशिकाओं को एक ही तरफ से अटैच किया जाना चाहिए. मोतियों को coverslips पर मैटीरियल लगाया जाता है और तूफान इमेजिंग के दौरान वास्तविक समय में नमूने को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है । मोतियों को मैटीरियल करने के बाद coverslips की लौ नहीं जा सकती ।
3. पाली की कोटिंग-एल-मनका-लेपित Coverslip पर lysine
नोट: यह cyanobacterial कोशिकाओं के स्थिरीकरण के लिए किया जाता है ।
- जोड़ें १०० µ पाली के एल-एल-lysine (1 मिलीग्राम/एमएल) मनका के साथ coverslip के केंद्र के लिए लेपित पक्ष का सामना करना पड़ । यह कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए बैठते हैं ।
- एक पिपेट का उपयोग करने के लिए सावधानी से संलग्न पाली-L-lysine आकांक्षा और यह एक १.५-एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । पुनः प्रयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पाली-एल-lysine सहेजें ।
- एक ६० मिमी पेट्री पकवान में अल्ट्रा फ़िल्टर्ड पानी की 10 मिलीलीटर के साथ coverslip कुल्ला और फिर संक्षेप में एक कागज तौलिया पर coverslip सूखी ।
- एक पेट्री डिश में coverslip (१०० mm) बाद में उपयोग के लिए स्टोर । डिश के लिए coverslip के लगाव को रोकने के लिए, parafilm की एक परत के साथ पेट्री पकवान लाइन ।
नोट: coverslip, मोती और पाली-एल-lysine के साथ कोट, कम से डेढ़ साल के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है । इसलिए, पहले से coverslips के एक बैच की तैयारी अत्यधिक अनुशंसित है ।
4. Coverslip पर कोशिकाओं के स्थिरीकरण
- नीचे parafilm के साथ एक नए पेट्री डिश के लिए एक कोट coverslip हस्तांतरण, जो बाद में धुंधला पकवान के रूप में भेजा जाएगा । coverslip पर निश्चित नमूना का लोड १०० µ एल और इसे 30 मिनट के लिए बैठने के लिए सेल लगाव की अनुमति देते हैं ।
- coverslip को 12-वेल प्लेट की एक अच्छी तरह से ट्रांसफर करें, जो कि बाद में वाशिंग डिश के रूप में भेजा जाएगा । फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 1 मिलीलीटर (10 मिमी ना2HPO4, १.८ मिमी KH2पीओ4, १३७ मिमी NaCl, और २.७ मिमी KCl, पीएच ७.४) जोड़ने के लिए अच्छी तरह से coverslip धोने के लिए । पंजाबियों बफर निकालें और coverslip फिर से धोने के लिए एक नया पंजाबियों बफर जोड़ें ।
5. Cyanobacterial कोशिकाओं का Permeabilization
- एक पिपेट का उपयोग कर पंजाबियों बफर निकालें । धोने पकवान है, जो ०.०५% गैर ईओण डिटर्जेंट-१०० (वी/वी), 10 मिमी EDTA, 10 मिमी Tris (पीएच ८.०), और ०.२ मिलीग्राम/एमएल lysozyme शामिल है की अच्छी तरह से तैयार permeabilization बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
- 20 मिनट के लिए ३७ ° c पर वाशिंग डिश मशीन । उसके बाद, permeabilization बफ़र को निकालें ।
- पंजाबियों बफर की 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक शेखर जो धीरे 5 मिनट के लिए धोने पकवान हिलाता है पर धोने पकवान जगह है । पंजाबियों बफर निकालें । coverslip को धोने के लिए 3x इस चरण को दोहराएँ ।
6. एक अवरुद्ध कदम में क्लोरोफिल pigments के Photobleaching
- coverslip के लिए दाग पकवान स्थानांतरण । बफर अवरुद्ध है, जो ०.२% (v/v) गैर ईओण डिटर्जेंट-१०० और 3% (वी/वी) बकरी सीरम, coverslip के शीर्ष पर शामिल है ५० µ एल जोड़ें ।
- बर्फ पर पूरे दाग थाली प्लेस और यह photobleaching के लिए क्सीनन प्रकाश स्रोत के तहत कम से ६० मिनट के लिए कदम, १,८०० µmol फोटॉनों पर एक प्रकाश की तीव्रता के साथ/
- photobleaching और अवरुद्ध करने के बाद, ध्यान से यह एक कागज तौलिया के किनारे के साथ adsorbing द्वारा अवरुद्ध बफर हटा दें ।
नोट: क्सीनन प्रकाश की तीव्रता इतनी अधिक है कि उचित धूप का चश्मा की एक जोड़ी नेत्र सुरक्षा के लिए आवश्यक है । इस बीच, प्रकाश स्रोत और प्लेट एल्यूमीनियम पंनी का उपयोग करने के लिए प्रकाश के रिसाव से बचने के लिए, जो आंख नुकसान का कारण हो सकता लपेटो । coverslip हर 15 मिनट सुनिश्चित करें कि coverslip नम रहता है बनाने के लिए जांच करें । coverslip शुष्क है, तो ५० µ l ब्लॉकिंग बफ़र की जोड़ें ।
७. एंटीबॉडी बंधनकारक
- विच्छेदन विरोधीAnabaena FtsZ एंटीबॉडी में निर्माता के निर्देशों के अनुसार पानी की २०० µ l ।
- विरोधी के 1 µ एल पतला FtsZ एंटीबॉडी ९९ µ में बफर अवरुद्ध के एल । coverslip पर पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के ५० µ एल जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर यह मशीन ।
- coverslip को वाशिंग डिश में ट्रांसफर करें । पंजाबियों बफर की 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक शेक पर वाशिंग डिश जगह है । धीरे 5 मिनट के लिए धोने पकवान शेक इस कदम 3x दोहराने के लिए coverslip धो लो ।
- coverslip के लिए दाग पकवान स्थानांतरण । एक द्वितीयक एंटीबॉडी के 1 µ l को पतला करना बफ़र को अवरुद्ध करने के ५०० µ l में । coverslip पर पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के ५० µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए यह मशीन ।
- coverslip को वाशिंग डिश में ट्रांसफर करें । यह एक शेखर पर पंजाबियों बफर की 1 मिलीलीटर के साथ धो लो । धीरे से 5 मिनट के लिए धोने पकवान शेक एल्यूमीनियम कागज के साथ कपड़े धोने के लिए यह प्रकाश प्रूफ बनाने लपेटो । 3x इस चरण को दोहराएँ ।
- ५०० µ l को अच्छी तरह से 4% paraformaldehyde (पीएफए) (w/v) से तैयार formaldehyde के जोड़ें । कमरे के तापमान पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए coverslip की मशीन ।
- formaldehyde निकालें और दोहराएं धुलाई चरण 3x ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब के बफर में coverslip की दुकान अंधेरे में इमेजिंग तक ।
8. तूफान इमेजिंग बफर की तैयारी
- इमेजिंग बफ़र के 1 मिलीलीटर तालिका 1के अनुसार, तुरंत पहले स्टॉर्म इमेजिंग के लिए तैयार करें ।
नोट: के रूप में इमेजिंग बफर की शेल्फ जीवन के बारे में 2 घंटे है, यह ताजा, उपयोग करने से पहले सही तैयार । ग्लूकोज oxidase और catalase के अलावा के बाद भंवर से बचें ।
सावधानी: मिथाइल viologen जहरीला पदार्थ है । कृपया इसे विशेष देखभाल के साथ संभाल । Cyclooctatetraene को एक यलो कैट के रूप में वर्गीकृत किया गया है । 1 रासायनिक । साँस लेना और त्वचा से संपर्क करें और एक रासायनिक डाकू में cyclooctatetraene स्टॉक समाधान और इमेजिंग बफर बनाने कृपया ।
9. तूफान डेटा के छवि अधिग्रहण
- लोडिंग चैंबर में coverslip लोड (चित्रा 1) । कक्ष में धीरे से तैयार इमेजिंग बफर लोड cyanobacterial कोशिकाओं से धोने से बचने के लिए । हवा में ऑक्सीजन के साथ इसकी प्रतिक्रिया को रोकने के लिए इमेजिंग बफर के शीर्ष पर एक आयताकार coverslip रखें । coverslip के नीचे हवा के बुलबुले फँसाने से बचें.
- कैमरा, एलईडी लाइट, और लेजर चालू करें । छवि अधिग्रहण, केन्द्रक स्थिति दृढ़ संकल्प, और13सुधार बहती नमूना के लिए खुला तूफान सॉफ्टवेयर ।
- लेंस के शीर्ष पर विसर्जन तेल की आधी एक बूंद जोड़ें । चैंबर लोड और सुनिश्चित करें कि उद्देश्य के लेंस coverslip के साथ संपर्क बनाता है ।
- एक ७५०-एनएम लेजर के साथ संकेत की जांच करें ।
नोट: हमेशा एक दूसरे एंटीबॉडी-ऋण-धुंधला नकारात्मक नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए कि autofluorescence कम है शामिल हैं । - एक नमूना क्षेत्र है जिसमें दोनों कक्ष और फिड्यूशियल मार्करों की पहचान करें । नमूना बहती सुधार के लिए सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें ।
नोट: सामान्य रूप में, आदर्श नमूना क्षेत्र में 10-30 कक्ष होते हैं. इस बीच, कोशिकाओं को अच्छी तरह से अलग किया जाना चाहिए किसी भी अतिव्यापी कोशिकाओं से बचने के लिए । - एक संदर्भ के रूप में एक व्यापक क्षेत्र छवि प्राप्त, कैमरा इलेक्ट्रॉन गुणा (EM) ३०० पर लाभ और 30 ms (चित्रा 2a) के एक जोखिम समय के साथ ।
- एक उच्च शक्ति के लिए ७५०-एनएम उत्तेजना लेजर तीव्रता बढ़ाएं, लगभग ४.५ किलोवाट/ एक बार fluorophores एक विरल निमिष पैटर्न में संक्रमण हो गया है, ३३ हर्ट्ज (चित्रा बी) पर १०,००० फ्रेम इकट्ठा करके एक सुपर संकल्प छवि प्राप्त ।
नोट: यदि fluorophores अलग नहीं हैं, तो कुछ मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि अधिक fluorophores करने के लिए अंधेरी स्थिति और पृथक एकल अणुओं फ़्लिक क्रमिक रूप से बंद हैं । यहाँ वर्णित फ्रेम की संख्या हमारे नमूने के लिए उपयुक्त है और अन्य लक्षित संरचनाओं के लिए अनुकूलित करने की जरूरत है ।
10. कच्चे डेटा से सुपर संकल्प छवियों का पुनर्निर्माण
- एक 3-डी रंग सुपर संकल्प छवि को फिर से संगठित करने के लिए ImageJ में QuickPALM (सामग्री तालिका)14 नामक प्लगइन का उपयोग करें ।
नोट: एक प्रारंभिक रंगीन छवि (चित्रा 2c) के साथ एक रंग कोडित स्केल बार (चित्रा 2c) दिखाई देगा. रंग z-अक्ष पर गहराई का प्रतिनिधित्व करता है । - एक वीडियो में 3-डी संरचना प्रदर्शित करने के लिए, z-अक्ष के साथ सुपर संकल्प छवियों के ढेर का निर्माण हर 10 QuickPALM14एनएम का उपयोग कर समुद्री मील की धारा । स्टैक की चमक समायोजित करें और एक लक्ष्य कक्ष के स्टैक की डुप्लिकेट बनाएं । एक प्लगइन का प्रयोग करें 3 डी दर्शक (सामग्री की मेज) ImageJ में15 सेल के 3-डी छवि उत्पंन करने के लिए बुलाया । प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए 3-डी संरचना के रोटेशन रिकॉर्ड ।
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Representative Results
तूफान व्यक्तिगत photoswitchable fluorophores stochastically सक्रिय द्वारा सुपर संकल्प इमेजिंग प्राप्त करते हैं । हर fluorophore का स्थान दर्ज है और एक सुपर संकल्प छवि तो इन स्थानों के आधार पर निर्माण किया है4. इसलिए, fluorophore स्थान की शुद्धता सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि पुनर्निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है । ४४७ एनएम और ६८० एनएम पर Prochlorococcus चोटी के अवशोषण स्पेक्ट्रा,और Prochlorococcus ७०० एनएम16के ऊपर तरंग दैर्ध्य में एक ंयूनतम अवशोषण है । हालांकि, Prochlorococcus MED4 कोशिकाओं को अभी भी उच्च autofluorescence उत्सर्जित जब ७५०-एनएम लेजर (चित्रा 3ए) है, जो स्टॉर्म इमेजिंग के लिए आवश्यक है की एक अत्यंत उच्च तीव्रता से अवगत कराया । इस प्रकार, Prochlorococcus कोशिकाओं के उच्च autofluorescence पृष्ठभूमि भारी सुपर संकल्प इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप ।
आदेश में Prochlorococcusमें प्रोटीन संगठनों की जांच करने के लिए तूफान का उपयोग करने के लिए, हम एक photobleaching विधि विकसित की है । 30 मिनट के लिए उच्च तीव्रता के एक सफेद प्रकाश के लिए जोखिम के बाद, Prochlorococcus MED4 कोशिकाओं के autofluorescence में कमी आई (बी चित्र), हालांकि autofluorescence के साथ कई कोशिकाओं को अभी भी पता चला रहे थे । हम आगे ६० मिनट के लिए photobleaching समय लंबी और पाया कि कोशिकाओं के बहुमत अपने autofluorescence (आंकड़ा 3सी) खो दिया है । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि photobleaching विधि हम यहाँ विकसित संश्लेषक जीवों में autofluorescence बहुत कम कर सकते हैं.
photobleaching के बाद, हम Prochlorococcus MED4 कोशिकाओं में सेल डिवीजन प्रोटीन FtsZ कल्पना करने के लिए तूफान का उपयोग करने में सक्षम थे । cyanobacterium Prochlorococcus 17पृथ्वी पर सबसे छोटा और सर्वाधिक प्रचुर मात्रा में संश्लेषक जीव है । एक Prochlorococcus सेल का व्यास केवल ५००-७०० एनएम18है । इस तरह के एक छोटे से सेल आकार के साथ, यह Prochlorococcus कोशिकाओं में FtsZ अंगूठी संगठन पारंपरिक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2a) का उपयोग कर कल्पना करने के लिए असंभव है । हालांकि, तूफान xy-विमान में ९.६ एनएम के एक स्थानिक संकल्प और z-अक्ष में ४१.६ एनएम है । तूफान का प्रयोग, हम Prochlorococcus में FtsZ अंगूठी की एक विस्तृत आकृति विज्ञान प्रकट करने में सक्षम थे (आंकड़े 2बी और 4) । 3-डी तूफान छवियों घूर्णन द्वारा, हम FtsZ अंगूठी morphologies के चार विभिंन प्रकार की पहचान: क्लस्टर (चित्रा 4a, मूवी एस1), एक अपूर्ण अंगूठी (चित्रा 4B, फिल्म S2), एक पूरी अंगूठी (आंकड़ा 4c, मूवी S3), और डबल रिंगों (चित्रा 4d, मूवी S4) । अंतराल Prochlorococcus (चित्रा 4c, मूवी S3), जो कि Caulobacter cresentus19में पाया के समान है की पूरी FtsZ रिंगों में मनाया गया । इन चार प्रकार की FtsZ रिंग morphologies ने Prochlorococcusके सेल चक्र के दौरान FtsZ रिंग की असेंबली प्रोसेस को दिखाया, और इस अध्ययन से हमें FtsZ के सेल डिविजन के दौरान Prochlorococcus रिंग की भूमिका को समझने में मदद मिली 9.
चित्रा 1: लोडिंग चैंबर के घटकों और तूफान इमेजिंग के लिए coverslips और इमेजिंग बफर के साथ इकट्ठे चैंबर. नमूना के साथ coverslip को पहले नीचे वाले हिस्से की नाली पर रखा गया था । इसके बाद ऊपरी हिस्से को ध्यान से नीचे वाले हिस्से पर कसा गया । इमेजिंग बफ़र लोड हो रहा है कक्ष में जोड़ा गया था और फिर ध्यान से एक वर्ग coverslip के साथ कवर किया गया । बुलबुले की माप की सटीकता को प्रभावित कर सकते हैं कि किसी भी आंदोलन को कम करने के लिए बचा जाना चाहिए. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: प्रतिनिधि वाइड-फील्ड, 2-डी स्टॉर्म, और 3-डी रंग तूफान Prochlorococcus MED4 में FtsZ की छवियां । छवियों को देखने के एक ही क्षेत्र से नियमित रूप से (क) व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी, (ख) 2-डी तूफान, और (ग) 3 डी रंग तूफान का उपयोग कर लिया गया । पैनल सी में रंग z-अक्ष पर फ्लोरोसेंट संकेतों की गहराई से संकेत मिलता है । पैनल सी में संख्या ब्याज की कोशिकाओं का संकेत है । स्केल पट्टियां = 1 µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्र 3: Prochlorococcus MED4 का Photobleaching । फिक्स्ड Prochlorococcus MED4 कोशिकाओं थे (A) photobleached नहीं, या वे के लिए photobleached थे (B) 30 min और (C) ६० min. XD-३०० क्सीनन प्रकाश १,८०० µmol की तीव्रता पर इस्तेमाल किया गया था/एम2· s कोशिकाओं एक ७५० एनएम लेजर एक ही तीव्रता के रूप में स्टॉर्म इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था द्वारा उत्साहित थे । autofluorescences तूफान में इस्तेमाल के रूप में एक ही फिल्टर के साथ छवि बना रहे थे सुनिश्चित करने के लिए ंयूनतम autofluorescence की उपस्थिति के लिए तूफान को प्रभावित करते हैं । स्केल बार्स = 2 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: चार FtsZ अंगूठी morphologies के प्रतिनिधि तूफान छवियों । चार अलग FtsZ अंगूठी morphologies Prochlorococcusमें मनाया गया: (क) क्लस्टर, (ख) एक अधूरी अंगूठी, (ग) एक पूरी अंगूठी, और (घ) डबल बजता है । एक ही सेल के लिए, (i) वाइड क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, (द्वितीय) xy-विमान पर तूफान, और (iii) तूफान रोटेशन के बाद दिखाया गया । पैनल ए, बी, सी, और डी में कोशिकाओं को इसी 3-डी फिल्में क्रमशः एस 1, S2, S3, और S4 फिल्मों में दिखाए जाते हैं । पैमाने सलाखों = ५०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| रसायन | स्टॉक समाधान | अंतिम एकाग्रता |
| ग्लूकोज | N/A | 10% (w/ |
| Tris-सीएल (pH ८.०) | ०.५ मीटर | 50mm |
| Ascorbic एसिड | १०० एमएम | 1 मिमी |
| मिथाइल viologen | १०० एमएम | 1 मिमी |
| Cyclooctatetraene | २०० एमएम | 2 मिमी |
| TCEP | ०.५ मीटर | 25 एमएम |
| ग्लूकोज oxidase | ५६ मिलीग्राम/एमएल | ०.५६ मिलीग्राम/एमएल |
| Catalase | 4 मिलीग्राम/एमएल | ४० µ g/ml |
तालिका 1: इमेजिंग बफ़र के लिए नुस्खा ।
फिल्म s: FtsZ प्रोटीन के समूहों में मनाया Prochlorococcus MED4 कक्ष । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
फिल्म S2: FtsZ प्रोटीन की एक अपूर्ण अंगूठी में मनाया Prochlorococcus MED4 कक्ष । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
मूवी S3: FtsZ प्रोटीन की एक पूरी अंगूठी में मनाया Prochlorococcus MED4 कक्ष । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
मूवी S4: एक डबल FtsZ प्रोटीन की अंगूठी में मनाया Prochlorococcus MED4 कक्ष । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम काफी cyanobacterium Prochlorococcus (चित्रा3 सी) के autofluorescence को कम करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन और, फिर, immunostain कोशिकाओं में प्रोटीन, जो हमें 3 डी FtsZ अध्ययन करने के लिए तूफान का उपयोग करने के लिए सक्षम Prochlorococcus में रिंग morphologies (चित्रा 4) । यह प्रोटोकॉल अंय संश्लेषक जीवों में सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए अपनाया जा सकता है ।
संश्लेषक जीवों पर पिछले अध्ययन मुख्य रूप से सुपर संकल्प इमेजिंग प्राप्त करने के लिए सिम इस्तेमाल किया क्योंकि सिम उच्च तीव्रता के पराबैंगनीकिरण की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, सिम के स्थानिक संकल्प केवल ~ १०० एनएम1है, जो तूफान की तुलना में बहुत कम है । इस अध्ययन में, तूफान छवियों के स्थानिक संकल्प xy-विमान में ९.६ एनएम और z-अक्ष9में ४१.६ एनएम तक पहुंच सकता है । बेहतर photobleaching और स्टॉर्म इमेजिंग द्वारा प्रदान की संकल्प शोधकर्ताओं अभूतपूर्व विस्तार में संश्लेषक जीवों का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है ।
Photobleaching तूफान से पहले एक महत्वपूर्ण कदम है कि शोधकर्ताओं स्थान और फ्लोरोसेंट जीवों में प्रोटीन की गतिशीलता का पालन करने के लिए सक्षम बनाता है । cyanobacteria के अलावा, हमने यह दर्शाया है कि autofluorescence के फूल वाले पौधे की Arabidopsis थालियाना के ६० मिनट के बाद भी बुझती जासकती है । photobleaching व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, उदाहरण के लिए संकेत करने के लिए शोर अनुपात में सुधार लाने के लिए और एकाधिक के दृश्य क्रमिक रूप से अचिह्नित20। यह भी प्रदर्शित किया गया है कि photobleaching से पहले इमेजिंग लाभप्रद जब रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी21के तहत एक autofluorescence नमूना देख रहा है । इसलिए, यह इस photobleaching विधि eukaryotic शैवाल, संवहनी पौधों, और proteorhodopsin और bacteriochlorophyll युक्त जीवों सहित अन्य संश्लेषक जीवों के autofluorescence को कम करने के लिए लागू करने के लिए व्यवहार्य हो सकता है.
संश्लेषक जीवों अलग pigments कि अलग अवशोषण स्पेक्ट्रा होते हैं; इसलिए, कार्बनिक रंजक और फ्लोरोसेंट प्रोटीन समझदारी से चयनित होने की जरूरत है । उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में, लगभग ७५० एनएम के एक अधिकतम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक डाई इस्तेमाल किया गया था । हालांकि दो चैनल (७५० एनएम और ६५० एनएम) यहां प्रस्तुत तूफान के लिए उपलब्ध हैं, Prochlorococcus फ्लोरोसेंट संकेत अभी भी एक ६५० एनएम लेजर के तहत उजागर किया जा रहा है के बाद देखा जा सकता है, यहां तक कि लंबे समय तक photobleaching के बाद । यह शायद है क्योंकि ६५० एनएम Prochlorococcusके लिए प्रमुख अवशोषण तरंग दैर्ध्य में से एक है । दूसरी ओर, कुछ Synechococcus और लाल शैवाल उनके वर्णक22के रूप में phycoerythrin होते हैं, जो ४८८ एनएम से ५६० एनएम और ६५० एनएम23में एक ंयूनतम अवशोषण के लिए एक अवशोषण स्पेक्ट्रम है । इसलिए, यह इन phycoerythrin-युक्त autotrophs के भीतर प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक ७५० एनएम चैनल के बजाय एक ६५०-एनएम चैनल का उपयोग करने के लिए व्यवहार्य हो सकता है ।
संक्षेप में, photobleaching और तूफान का एक उचित संयोजन के विस्तार में संश्लेषक कोशिकाओं में प्रोटीन संगठन को समझने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो आगे अपनी गतिशीलता और संभावित समारोह प्रकट होगा ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक उसे तकनीकी सहायता और पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए Daiying Xu धंयवाद । यह अध्ययन राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (परियोजना संख्या ४१४७६१४७) और हांगकांग विशेष प्रशासनिक क्षेत्र, चीन (परियोजना संख्या ६८९८१३ और १६१०३४१४) के अनुसंधान अनुदान परिषद से अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
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