Summary
Burada Siyanobakteriler autofluorescence azaltmak için photobleaching yöntemi açıklanmaktadır. Photobleaching sonra Stokastik optik imar mikroskobu siyanobakteriyel FtsZ ringin üç boyutlu Süper çözünürlük fotoğraf elde etmek için kullanılır.
Abstract
Süper çözünürlük mikroskobu protein etkileşimleri ve çoğu canlıda hücre altı yapıları incelemek için yaygın olarak kullanılmış. Fotosentetik canlılar arasında süper kararlılık düşsel yanal çözünürlük sadece 100 ~ be nm. Düşük çözünürlük çok yüksek autofluorescence hücrelerin arka planını Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına) gibi süper kararlılık düşsel için gerekli olan yüksek yoğunluklu lazerler neden fotosentetik kaynaklanmaktadır. Burada, deniz picocyanobacterium Prochlorococcusgörüntüleme için son zamanlarda geliştirilen bir photobleaching destekli fırtına yöntemi açıklanmaktadır. O fırtına ~ 10 yanal çözünürlük ile yapılabilir böylece photobleaching sonra etkili bir şekilde Prochlorococcus autofluorescence azalır nm. Bu yöntemi kullanarak, biz vivo içinde üç boyutlu (3-D) organizasyon FtsZ protein elde etmek ve Prochlorococcushücre döngüsü sırasında dört farklı FtsZ yüzük türleri morfoloji karakterize. Biz burada tarif yöntemi fotosentetik diğer organizmaların süper kararlılık düşsel için kabul edilebilir.
Introduction
Süper çözünürlük microscopies ışığın kırınım sınırını kırmak ve alt kırınım çözünürlükleri (< 200 nm) içinde görüntüler sunar. Bunlar yaygın birçok organizmalarda protein yerelleştirme ve hücre altı yapıları incelemek için kullanılmıştır. Binbaşı Süper çözünürlük mikroskobu yöntemleri arasında yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), uyarılmış emisyonu tükenmesi mikroskobu (STED), fırtına ve photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM). Mekanizmaları ve mikroskoplar olmuştur bu süper çözünürlük uygulamaları başka bir yerde1,2gözden geçirdim.
FIRTINA 10'a kadar yüksek bir çözünürlük elde edebilirsiniz nm uzaysal ayırma3,4. FIRTINA, bir kırınım-sınırlı bölge içinde tek bir molekül ("on") etkinleştirilir ve molekülleri kalan ("uzak") Inaktif tutulur. Bir birikimi hızlı geçiş on ve - off tek moleküller tarafından oluşturulan3"kırınım-sınırsız" bir görüntü olabilir. Bu arada, birçok türde organik boya ve floresan proteinler yüksek çözünürlüklü mikroskobu5,6düzenli floresans mikroskobu kolay bir yükseltme izin fırtınada tabidir.
FIRTINA geniş Siyanobakteriler, yosun, gibi fotosentetik hücrelerdeki uygulanmamış ve bitki hücreleri ile kloroplast7,ki...... fırtına nedeni olan8, sürücü photoswitching için yüksek lazer yoğunluğu gerektirir. Yüksek yoğunluktaki lazer olumsuz ve güçlü autofluorescence arka planda fotosentetik hücreleri heyecanlandıran tek molekül yerelleştirme fırtına görüntülemede etkilemektedir. FIRTINA hücre altı yapıları veya protein etkileşimleri fotosentetik hücrelerdeki araştırmak için kullanmak için arka plan autofluorescence sinyalleri9gidermek için photobleaching iletişim kuralı geliştirilmiştir. Rutin bir immünfloresan boyama işlem içinde numuneler fotosentetik hücrelerinin fırtına gereksinimlerini autofluorescence düşürür engelleme adım sırasında yüksek yoğunluklu beyaz ışığa maruz kalır. Böylece, bu iletişim kuralını fırtına ile pigmentli organizmalar araştırmak için uygun yapar.
Burada, tek hücreli picocyanobacterium ProchlorococcusFtsZ yüzük kuruluşta görüntüye fırtına kullanılacak protokol açıklayın. FtsZ hücre10 çevresi halka yapısının (Z halka) oluşturmak için polymerizes ve hücre bölünmesi11için gerekli olan bir son derece korunmuş tübülin benzeri hücre iskeleti proteindir. Prochlorococcus korunmuş hücrelerdir autofluorescent arka plan ve immunostained bir birincil anti-FtsZ antikor ile azaltmak için ilk photobleached ve sonra ikincil bir anti-tavşan (H + L) IgG antikor fluorophore ile Birleşik (Örneğin , Alexa Fluor 750). Sonunda, fırtına Prochlorococcus detaylı FtsZ yüzük kuruluşlarda farklı hücre döngüsü aşamaları sırasında gözlemlemek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. örnek hazırlama ve fiksasyon
- Deniz suyu tabanlı Pro99 orta125 ml axenic Prochlorococcus MED4 1 mL aşılamak. Prochlorococcus kültür ışığı altında 23 ° C'de 35 µmol fotonlar/m2s. bir yoğunluk ile beş gün sonra büyümek, kültür 1 mL 1.5 mL tüp içine toplamak.
Not: Beş gün sonra aşılama ile yaklaşık 108 hücre/mL, geç log fazı olan fırtına görüntüleme için uygun olduğu Prochlorococcus MED4 ulaşacak. - 100 µL % 25 paraformaldehyde (PFA) (w/v) taze hazırlanmış formaldehit ve % 50 oxazolidin 2 µL kültür düzeltmek için 1.5 mL tüp içine ekleyin. Örnek 20 dk için oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya.
Not: oxazolidin ışık olduğundan örnek fiksasyon için karanlıkta hassas tutuldu. - Spin aşağı 13.500 x g 1 dk. için de örnek; ardından, süpernatant kaldırmak ve Pro99 orta12100 µL hücrelerde resuspend. Örnek 4 ° C'de immunostaining kadar saklayın.
2. precoating Coverslip polistren boncuklar ile
Not: Polistiren boncuk drift düzeltme için indirgeme marker olarak kabul edilir.
- Girdap orijinal polistren boncuk şişe ve bir 1:20,000 seyreltme % 50 Etanol ile çalışan bulamaç olarak hazırlayın.
- Sıcak plaka üzerinde açın sıcaklığı 120 ° C için ayarlamak ve coverslips sıcak plaka üzerine yerleştirin.
- Çalışma Bulamaç her coverslip üzerine 100 µL yükleyin. Coverslip 10 dk sıcak plaka üzerinde kuluçkaya ve daha sonra dikkatlice Petri yemekler için depolama oda sıcaklığında coverslips transfer.
Not: Yan bağlı boncuk ile yüzleşmeli ve hücreleri aynı tarafta iliştirilmesi gerekir. Boncuk coverslips üzerinde immobilize ve örnek sürüklenen düzeltmek için kullanılan fırtına görüntüleme sırasında gerçek zamanlı. Boncuk immobilizing sonra coverslips flamed olamaz.
3. Poly-L-lizin boncuk kaplı Coverslip üzerine kaplanması
Not: Bu siyanobakteriyel hücre immobilizasyon için yapılır.
- Poli-L-lizin (1 mg/mL) 100 µL coverslip merkezine boncuk kaplamalı yüzü yukarı bakacak şekilde ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika oturmak izin.
- Bir pipet dikkatle bekâr poli-L-lizin aspire ve 1.5 mL tüp aktarmak için kullanın. Poli-L-lizin 4 ° c yeniden kullanmak üzere kaydedin.
- 60 mm kabında coverslip 10 mL ultra filtre su ile durulayın ve sonra kısa bir süre kuru kağıt havlu üzerinde coverslip.
- Coverslip bir Petri (100 mm) daha sonra kullanım için saklayın. Yemek için coverslip ve eki önlemek için Petri kabına parafilm bir tabaka ile satır.
Not: boncuk ve poli-L-lizin, precoated coverslip, oda sıcaklığında en az yarım yıl için saklanır. Bu nedenle, coverslips bir dizi önceden hazırlama önemle önerilir.
4. Coverslip sayfasında bulunan bir hücreler immobilizasyon
- Precoated coverslip ile parafilm boyama tabak olarak bundan sonra sevk edilecek en altındaki yeni Petri kabına aktarın. Coverslip üzerinde sabit örnek 100 µL yük ve hücre ek izin vermek 30 dakika oturmak izin.
- Coverslip çamaşır tabak olarak bundan sonra sevk edilecek bir 12-şey plaka bir kuyu için transfer. Fosfat tamponlu tuz (PBS) (10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl ve 2.7 mM KCl, pH 7,4) 1 mL coverslip yıkamak için kuyuya ekleyin. PBS arabellek kaldırın ve tekrar coverslip yıkamak için yeni bir PBS arabellek ekleyin.
5. permeabilization siyanobakteriyel hücre
- PBS arabelleği bir pipet kullanarak kaldırın. Taze hazırlanmış permeabilization arabellek 1 mL %0,05 non-iyonik deterjan-100 (v/v), 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8.0) ve 0.2 mg/mL lizozim içeren çamaşır bulaşık kuyusu ekleyin.
- 20 dk 37 ° C'de çamaşır bulaşık kuluçkaya. Sonra permeabilization arabellek kaldırın.
- PBS arabellek 1 mL ekleyin ve hangi 5 dk. kaldırmak için PBS arabellek yavaşça çamaşır bulaşık sallıyor bir shaker çamaşır çanak yerleştirin. 3 x coverslip yıkamak için bu adımı yineleyin.
6. Photobleaching klorofil engelleme bir adımda pigmentler
- Coverslip boyama yemek için transfer. 50 µL % 0,2 (v/v) non-iyonik deterjan-100 ve coverslip üst kısmında %3 (v/v) keçi serum içeren engelleme arabelleği ekleyin.
- Plaka buz üzerinde boyama bütün yer ve taşımak için photobleaching en az 60 dakika, xenon ışık kaynağı altında hafif yoğunlukta 1.800 µmol fotonlar/m2·s ile.
- Photobleaching ve engelleme sonra kağıt havlu kenarı ile adsorbing tarafından dikkatli bir şekilde engelleme arabellek çıkarın.
Not: Xenon ışığın şiddetini uygun güneş gözlüğü göz koruması için gerekli yüksek. Bu arada, ışık kaynağı ve göz zarar neden olabilir ışık sızıntı önlemek için alüminyum folyo kullanarak plaka sarın. Coverslip her 15dk coverslip nemli kalır emin olun. Coverslip kuru ise, engelleme arabelleği 50 µL ekleyin.
7. antikor bağlama
- Anti -Anabaena FtsZ antikor su üretici yönergelerine göre 200 µL içinde çözülür.
- Anti-FtsZ antikor engelleme arabelleği 99 µL içine 1 µL sulandırmak. Seyreltilmiş birincil antikor 50 µL üzerinde coverslip ekleyin ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Coverslip çamaşır bulaşık aktarın. PBS arabellek 1 mL ekleyin ve bir shake üzerinde çamaşır çanak yerleştirin. Yavaşça bu adımı coverslip yıkamak için 3 x 5 dk. tekrar çamaşır bulaşık salla.
- Coverslip boyama yemek için transfer. İkincil bir antikor engelleme arabelleği 500 µL içine 1 µL sulandırmak. Seyreltilmiş ikincil antikor coverslip üzerine 50 µL ekleyin ve karanlık oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- Coverslip çamaşır bulaşık aktarın. PBS arabelleği bir shaker üzerine 1 mL ile yıkayın. Yavaşça 5 dk. şal için çamaşır bulaşık çamaşır bulaşık ışık geçirmez yapmak için alüminyum kağıt ile sallamak. 3 x bu adımı yineleyin.
- 500 µL % 4 paraformaldehyde (PFA) (w/v) taze hazırlanmış formaldehit kuyuya ekleyin. 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında coverslip kuluçkaya.
- Formaldehit kaldırmak ve 3 x çamaşır adımı yineleyin.
- Coverslip görüntüleme kadar PBS arabellek karanlıkta 4 ° C'de depolayın.
8. arabellek Imaging fırtına hazırlanması
- Tablo 1göre arabellek hemen önce fırtına görüntüleme görüntüleme 1 mL hazırlayın.
Not: görüntüleme arabellek raf ömrü yaklaşık 2 h olduğu gibi taze, kullanımdan önce hazır olun. Vortexing glikoz oksidaz ve katalaz eklenmesinden sonra kaçının.
Dikkat: Metil viologen zehirli malzemedir. Lütfen özel dikkat ile başa. Cyclooctatetraene bir kanserojen kedi sınıflandırılır. 1 kimyasal. İnhalasyon önlemek temas ten ve cyclooctatetraene hisse senedi çözüm ve görüntüleme tampon kimyasal bir mahallede olun.
9. resim alma fırtına veri
- Coverslip yükleme odasında (Şekil 1) yükleyin. Taze hazırlanmış görüntüleme tampon yavaşça odasına siyanobakteriyel hücreleri dışına yıkama önlemek için yüklemek. Havadaki oksijen ile onun reaksiyonu önlemek için görüntüleme tampon üstüne bir dikdörtgen coverslip yerleştirin. Bindirme hava kabarcıkları coverslip altında kaçının.
- Kamera, LED ışık ve lazer açın. Resim alma, centroid konum belirleme ve düzeltme13sürüklenen örnek için açık fırtına yazılım.
- Objektifin üst kısmında Daldırma yağ yarım bir damla ekleyin. Odası yük ve amacın objektif emin olun coverslip ile temas.
- Sinyal 750-nm lazer ile inceleyin.
Not: Her zaman autofluorescence azalır emin olmak için ikinci antikor eksi boyama negatif denetimini içerir. - Hücreleri ve indirgeme işaretleri içeren bir örnek alanı tanımlayın. Yazılım düzeltme sürüklenen örnek için başlatın.
Not: genel olarak, 10-30 hücre ideal örnek alanı var. Bu arada, hücreleri de herhangi bir çakışan hücrelerde önlemek için ayrılmalıdır. - Bir referans olarak bir geniş-alan görüntü elde etmek, 300 ve bir çekim hızı 30 ms (Şekil 2A) fotoğraf makinesi elektron çarpma (EM) ile kazanmak.
- 750-nm uyarma lazer yoğunluğu yüksek bir güç, yaklaşık 4,5 kW/cm2için artırın. Bir kez fluorophores seyrek bir yanıp sönen kalıp içine geçiş, bir süper çözünürlüklü görüntü 33 Hz değerinde (Şekil 2B) 10.000 çerçeveler toplayarak elde etmek.
Not: Eğer fluorophores izole değildir, birkaç dakika kadar daha fazla fluorophores karanlık durumuna geçiş yaptı ve sıralı olarak izole tek moleküllerin titreşim için bekleyin. Burada açıklanan çerçeve sayısı bizim örnek için uygundur ve hedeflenen diğer yapıları için optimize edilmiş olması gerekiyor.
10. Süper çözünürlük fotoğraf ham verilerden inşası
- QuickPALM (Tablo reçetesi)14 ImageJ içinde bir eklenti bir 3-b rengi süper çözünürlüklü görüntü yeniden oluşturmak için kullanın.
Not: Bir ön kromatik görüntü (Şekil 2C) ile birlikte bir renk kodlu ölçek çubuğu (Şekil 2C)-ecek gözükmek. Renk derinliğini z ekseni üzerinde gösterir. - 3-b yapı video, bir yapı içinde a yığın-in süper çözünürlük göstermek için her 10 z ekseni görüntülerle kesitli QuickPALM14kullanarak nm. Yığınlar parlaklığını ayarlayın ve bir hedef hücre yığını çoğaltın. 3B görüntüleyici (Tablo reçetesi)15 ImageJ içinde bir eklenti hücre 3 boyutlu görüntü oluşturmak için kullanın. Kayıt Gösterim amacıyla 3 boyutlu yapısı döndürme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FIRTINA süper kararlılık düşsel bireysel photoswitchable fluorophores stochastically harekete geçirerek elde eder. Her fluorophore konumunu kaydedilir ve bir süper çözünürlüklü görüntü sonra bu mekanlar4üzerinde dayalı inşa edilmiştir. Bu nedenle, fluorophore konumu duyarlığını Süper çözünürlük görüntü yeniden yapılanma için önemlidir. Prochlorococcus emme spectra zirve 447 nm ve 680 nmve Prochlorococcus dalga boylarında 700 nm16yukarıda, en az bir emme vardır. Ancak, Prochlorococcus MED4 hücreler hala fırtına görüntüleme için gerekli olan 750-nm lazer (Şekil 3A), son derece yüksek bir yoğunluk maruz yüksek autofluorescence yayılan. Böylece, yüksek autofluorescence hücrelerin arka planını Prochlorococcus ağır süper kararlılık düşsel ile etkilemektedir.
FIRTINA Prochlorococcusprotein kuruluşlarda araştırmak için kullanmak için bir photobleaching yöntemi geliştirdi. Autofluorescence ile birkaç hücreyi hala tespit edildi, ancak yüksek yoğunluklu 30 dk için beyaz bir ışığa maruz kaldıktan sonra Prochlorococcus MED4 hücre autofluorescence (Şekil 3B), azalmıştır. Biz daha fazla 60 dk photobleaching zaman uzamış ve hücreleri çoğunluğu kendi autofluorescence (Şekil 3 c) kayıp bulundu. Bu sonuçlar burada geliştirdiğimiz photobleaching yöntemi autofluorescence fotosentetik organizmalarda önemli ölçüde kısaltıp gösterir.
Photobleaching sonra biz fırtına hücre bölünmesi protein FtsZ Prochlorococcus içinde görselleştirmek için kullanmak başardık MED4 hücreleri. Cyanobacterium Prochlorococcus küçüğüdür ve en bol fotosentetik organizma dünya17. Prochlorococcus hücre çapı sadece 500-700 nm18olduğunu. Böyle bir küçük hücre boyutu ile geleneksel geniş alanlı floresans mikroskobu (Şekil 2A) kullanarak Prochlorococcus hücre FtsZ yüzük kuruluşta görselleştirmek imkansız. Ancak, fırtına 9,6 kayma bir çözünürlüğe sahip nm z ekseni xy düzlemi ve 41.6 Nm. FIRTINA kullanarak, biz Prochlorococcus (Şekil 2B ve 4) FtsZ ringde detaylı bir morfoloji ortaya çıkarmak başardık. 3-b fırtına görüntüler döndürerek, biz dört farklı FtsZ yüzük türleri morfoloji tespit: kümeleri (Şekil 4A, Film S1), tamamlanmamış bir yüzüğü (Şekil 4B, Film S2), tam bir yüzük (4 C rakam, Film S3) ve çift yüzük (4 D bulmak, Film S4). Boşlukları Prochlorococcus (Şekil 4 c, Film S3), tam FtsZ Yüzükler hangi Caulobacter cresentus19' bulduğu benzer tespit edildi. FtsZ yüzük türleri morfoloji dört bu tür Prochlorococcushücre döngüsü sırasında derleme işlemi FtsZ yüzük gösterdi ve bu çalışma Prochlorococcus hücre bölünmesi sırasında FtsZ yüzük rolünü anlamak için bize yardımcı 9.
Şekil 1: bileşenlerini yükleme odası ve fırtına görüntüleme için arabellek coverslips ve görüntüleme ile birleştirilmiş odası. Örnek ile coverslip alt kısmında oluk ilk yerleştirildi. Üst kısmı o zaman dikkatli üstünde-e doğru alt kısmı biter. Görüntüleme arabellek yükleme odasında eklendi ve daha sonra dikkatlice bir kare coverslip ile kaplı. Kabarcıklar ölçüm doğruluğunu etkileyebilir herhangi bir hareket en aza indirmek için kaçınılmalıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Temsilcisi geniş alanlı, 2-B fırtına ve 3-b renk FtsZ Prochlorococcus MED4 içinde fırtına görüntüler. Görüntüleri aynı düzenli(a)geniş alanlı mikroskobu, (B) 2-B fırtına ve (C) kullanarak görüş alanı alındı 3-b rengi fırtına. C panelindeki renkleri z ekseni üzerinde floresan sinyallerini derinliğini gösterir. C panelinde numaraları hücreler ilgi gösterir. Ölçek çubukları 1 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Photobleaching, Prochlorococcus MED4. Prochlorococcus MED4 sabit hücreleri (A) değil photobleached ya da photobleached (B) olduklarını 30 dk ve (C) 60 dak. XD-300 xenon ışık kullanılan 1.800 µmol/m2·s. bir yoğunluk hücreleri aynı yoğunlukta bir 750-nm lazer tarafından kullanılan gibi heyecan vardı fırtına görüntüleme için. Autofluorescences fırtına fırtına etkileyecek en az autofluorescence varlığı emin olmak için kullanılan aynı filtrelerle görüntüsü. Ölçek çubukları 2 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: dört FtsZ yüzük türleri morfoloji temsilcisi fırtına görüntüler. Dört farklı FtsZ yüzük türleri morfoloji Prochlorococcusiçinde gözlendi:(a)kümeleri, (B) tamamlanmamış (C) tam bir çember ve (D) çift yüzük. Aynı hücre için (i) geniş alanlı floresans mikroskobu, xy düzlemi fırtınası (II) ve (III) fırtına döndürme sonra görüntüleri gösterildi. Paneller Ahücrelerde karşılık gelen 3 boyutlu filmler, B, Cve D film S1, S2, S3 ve S4, sırasıyla gösterilir. Ölçek çubukları = 500 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Kimyasallar | Hisse senedi çözüm | Son konsantrasyonu |
| glikoz | N/A | % 10 (w/v) |
| Tris-Cl (pH 8.0) | 0,5 M | 50 mM |
| Askorbik asit | 100 mM | 1 mM |
| Metil viologen | 100 mM | 1 mM |
| Cyclooctatetraene | 200 mM | 2 mM |
| TCEP | 0,5 M | 25 mM |
| Glikoz oksidaz | 56 mg/ml | 0,56 mg/ml |
| Katalaz | 4 mg/ml | 40 µg/ml |
Tablo 1: Tarifi görüntüleme arabelleği için.
Film S1: kümeleri FtsZ proteinlerin gözlenen Prochlorococcus MED4 hücreleri. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Film S2: eksik bir yüzüğü FtsZ proteinlerin gözlemlenen Prochlorococcus MED4 hücreleri. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Film S3: tam bir yüzük FtsZ proteinlerin gözlemlenen Prochlorococcus MED4 hücreleri. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Film S4: bir çift yüzük FtsZ proteinlerin gözlemlenen Prochlorococcus MED4 hücreleri. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için biz cyanobacterium Prochlorococcus (Şekil 3 c) autofluorescence önemli ölçüde azaltmak için bir prosedür açıklanan ve daha sonra immunostain 3-b FtsZ çalışmaya fırtına kullanmak için bize etkin hücre proteinleri Yüzük türleri morfoloji olarak Prochlorococcus (Şekil 4). Bu iletişim kuralı için süper kararlılık düşsel fotosentetik diğer organizmalarda kabul.
Fotosentetik canlılar üzerinde önceki çalışmalarda SIM SIM yüksek yoğunluklu lazerler gerektirmediğinden Süper çözünürlük görüntüleme elde etmek için kullanılan başlıca. Ancak, SIM Uzaysal Çözünürlük çok fırtına daha düşük olduğu sadece 100 ~ nm1' dir. Bu çalışmada, fırtına görüntülerin uzaysal çözünürlük 9,6 ulaşabilir xy düzlemi ve 41.6 Nm z ekseni9nm. Photobleaching ve fırtına görüntüleme tarafından sağlanan geliştirilmiş çözünürlük araştırmacılar fotosentetik canlılar arasında benzersiz detay çalışma sağlar.
Photobleaching fırtına öncesinde araştırmacılar protein autofluorescent organizmalarda dinamikleri ve konumunu gözlemlemek sağlayan kritik bir adımdır. Siyanobakteriler yanı sıra, bu autofluorescence çiçekli bitki Arabidopsis thaliana de photobleaching960 dk sonra su göstermiştir. Photobleaching yaygın olarak, örneğin sinyal-gürültü oranı ve birden çok biyolojik görselleştirme ardışık olarak iyileştirmek için kullanılmış olan20. Aynı zamanda görüntüleme Raman spektroskopisi21altında bir autofluorescence örnek gözlem avantajlıdır önce o photobleaching gösterdi. Bu nedenle, ökaryotik algler, Vaskular bitkiler ve proteorhodopsin ve bacteriochlorophyll içeren organizmalar da dahil olmak üzere diğer fotosentetik canlılar autofluorescence azaltmak için bu photobleaching yöntemi uygulamak için uygun olabilir.
Fotosentetik canlılar farklı soğurma spektrumları var farklı pigmentler içerir; Bu nedenle, organik boya ve floresan proteinler ihtiyatlı seçilmesi gerekir. Örneğin, bu çalışmada bir boya ile maksimum uyarma dalga boyu yaklaşık 750 nm kullanıldı. Her ne kadar iki kanal (750 nm ve 650 nm) fırtına için kullanılabilir sunulmaktadır burada, Prochlorococcus autofluorescent sinyalleri hala 650 nm lazer altında varlık maruz sonra bile uzun süre photobleaching sonra gözlenen. Çünkü bu 650 nm Prochlorococcusbüyük emilimi dalgaları biridir. Öte yandan, bazı Synechococcus ve kırmızı algler içeren phycoerythrin olarak bir emme spektrum 488 üzerinden olan onların pigment22, nm için 560 nm ve en az bir emme 650 nm23. Bu nedenle, proteinler bu phycoerythrin içeren Ototrofların içinde çalışmaya 750-nm kanal yerine bir 650 nm kanalını kullanmak için uygun olabilir.
Özet olarak, uygun bir arada photobleaching ve fırtına daha da-ecek açığa vurmak onların dinamiği ve potansiyel işlevi ayrıntılı fotosentetik hücrelerdeki protein organizasyon anlamak için güçlü bir yaklaşım sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Daiying Xu onun teknik yardım ve el yazması üzerine yorum için teşekkür ederiz. Bu çalışmada, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, Çin'den (proje numarası 41476147) hibe ve araştırma hibe Konseyi, Hong Kong özel idari bölgesi, Çin (proje numaraları 689813 ve 16103414) tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
References
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy - Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus - a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser? Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
