Summary
एक स्थिर सेल ब्याज की जीन को व्यक्त करने के जीन समारोह का अध्ययन लाइन की स्थापना स्थिर अभिकर्मक द्वारा किया जा सकता है उंहें retroviral संक्रमण के माध्यम से transfecting के बाद एकल क्लोन उठा । यहां हम बताते है कि HT29-DR3 सेल इस तरह से उत्पंन लाइनों स्पष्ट तंत्र है जिसके द्वारा मौत रिसेप्टर 3 (DR3) antimitotics प्रेरित apoptosis के लिए योगदान देता है ।
Abstract
रुचि के जीन के कार्य का अध्ययन कर अभिव्यक्ति के अपने स्तर में हेर-फेर से प्राप्त किया जा सकता है, जैसे पछाड़ना कोशिका रेखाओं के साथ अपनी अभिव्यक्ति को कम करना या फिर से व्यक्ती कोशिका रेखाओं के साथ अपनी अभिव्यक्ति बढ़ाना. क्षणिक और स्थिर अभिकर्मक दो तरीके है कि अक्सर exogenous जीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । क्षणिक अभिकर्मक केवल अल्पकालिक अभिव्यक्ति के लिए उपयोगी है, जबकि स्थिर अभिकर्मक की अनुमति देता है exogenous जीन मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत किया जा सकता है जहां यह लगातार व्यक्त किया जाएगा । नतीजतन, स्थिर अभिकर्मक आमतौर पर दीर्घकालिक आनुवंशिक विनियमन में अनुसंधान के लिए कार्यरत है । यहां हम एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक स्थिर सेल व्यक्त मौत रिसेप्टर 3 (DR3) DR3 समारोह का पता लगाने के लिए लाइन उत्पंन । हम एक retroviral संक्रमण के बाद एक क्लोन उठाया क्रम में एकरूपता और स्थिर सेल लाइनों की पवित्रता बनाए रखने के लिए । इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न स्थिर सेल लाइनों antimitotic दवाओं के प्रति संवेदनशील DR3 की कमी HT29 कोशिकाओं को रेंडर, इस प्रकार HT29 कोशिकाओं में अपोप्तोटिक प्रतिक्रिया का पुनर्गठन. इसके अलावा, DR3 पर झंडा टैग अच्छा DR3 एंटीबॉडी की उपलब्धता के लिए क्षतिपूर्ति और आणविक तंत्र के जैव रासायनिक अध्ययन की सुविधा है जिसके द्वारा antimitotic एजेंटों apoptosis प्रेरित ।
Introduction
Heterologous जीन अभिव्यक्ति अक्सर ब्याज की जीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए कार्यरत है । दो तरीकों, क्षणिक और स्थिर अभिकर्मक, प्रचलित कोशिकाओं में इस्तेमाल किया और आणविक जीव विज्ञान के लिए एक मेजबान सेल1,2में डीएनए या आरएनए के एक खंड डालने के लिए कर रहे हैं । क्षणिक-transfected डीएनए या आरएनए बेटी कोशिकाओं को पारित नहीं किया जा सकता है, तो आनुवंशिक परिवर्तन केवल समय की एक छोटी अवधि के लिए बनाए रखा जा सकता है । दूसरी ओर, छुरा transfected कोशिकाओं में, exogenous जीन मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत कर रहे हैं, सेल लाइन में अपनी अभिव्यक्ति को बनाए रखने । इस प्रकार, स्थिर अभिकर्मक एक तरीका है कि आम तौर पर दीर्घकालिक आनुवंशिक विनियमन में अनुसंधान के लिए आरक्षित है । स्थिर सेल लाइन भी vivo अध्ययन3 में के लिए माउस मॉडल में xenografts के रूप में प्रत्यारोपण किया जा सकता है । स्थिर अभिकर्मक दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: वायरल और वायरल । वायरल अभिकर्मक की तुलना में, वायरल संक्रमण एक उच्च दक्षता4,5,6,7के साथ मानव कोशिकाओं की एक व्यापक विविधता में जीन हस्तांतरण कर सकते हैं । इसके अलावा, एक एकल क्लोन से एक स्थिर सेल लाइन सजातीयता और क्लोनिंग शुद्धता का लाभ प्रदान करता है ।
अनियंत्रित कोशिका वृद्धि और विभाजन कैंसर की सबसे विशिष्ठ विशेषताएं हैं । नैदानिक सेटिंग्स में, antimitotic एजेंटों ट्यूमर8के कई प्रकार के लिए प्राथमिक उपचार कर रहे हैं । हालांकि, antimitotic एजेंट्स की कुछ महत्वपूर्ण सीमाओं को अनदेखा नहीं किया जा सकता । सबसे पहले, इन chemotherapies भी अवांछित कैंसर कोशिकाओं के साथ सामान्य कोशिकाओं को मार सकते हैं और, इस प्रकार, गंभीर साइड इफेक्ट में परिणाम कर सकते हैं8. दूसरा, antitubulin दवाओं ट्यूमर के सभी प्रकार के खिलाफ प्रभावी नहीं हैं, एक cytoskeletal प्रोटीन9,10के रूप में विभिंन ऊतकों की एक विस्तृत विविधता में tubulin सर्वव्यापी अभिव्यक्ति के बावजूद । यह स्पष्ट नहीं है क्यों antitubulin एजेंटों डिंबग्रंथि, फेफड़े, और नैदानिक उपचार में रक्त कैंसर, लेकिन गुर्दे, बृहदांत्र, या अग्नाशय के कैंसर11में नहीं के खिलाफ आशाजनक प्रभावकारिता दिखाया । अंत में, ट्यूमर के एक ही प्रकार के साथ भी रोगियों को एक अप्रत्याशित तरीके से अलग antimitotics का जवाब कर सकते हैं । वहां एक प्रमुख प्रभाव अणु कि antimitotic एजेंटों के लिए विभिंन रोगियों की संवेदनशीलता को प्रभावित करता है, विविध नैदानिक उपचार12में देखा परिणामों में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है । इस प्रकार, antimitotic उपचार के लिए रोगियों के संभावित अंतर संवेदनशीलता को ध्यान में रखा जाना चाहिए ताकि चिकित्सीय हस्तक्षेप13को ऑप्टिमाइज़ किया जा सके ।
एक उच्च प्रवाह पूरे जीनोम सिरना पुस्तकालय स्क्रीन का प्रदर्शन किया है कि DR3 पछाड़ना संवेदनशील antimitotic दवाओं के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं, रसायन चिकित्सा में DR3 के लिए एक भूमिका फंसाने-प्रेरित apoptosis14प्रदान सकता है । ट्यूमर परिगलन कारक रिसेप्टर (TNFR) superfamily के एक सदस्य के रूप में, DR3 विभिन्न प्रणालियों15,16,17,18में मध्यस्थता सेल apoptosis के लिए सूचित किया गया है. इस प्रकार, हम बाहर सेट के लिए स्थिर कोशिका DR3 व्यक्त करने के लिए आणविक तंत्र है जिसके द्वारा antimitotic दवाओं apoptosis प्रेरित अध्ययन लाइनों की स्थापना । DR3 एक्सप्रेस का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त सेल मॉडल मानव बृहदांत्र कैंसर सेल लाइन HT29, जो DR3 की कमी होना पाया गया द्वारा प्रदान किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, क्लिनिक में, बृहदांत्र कैंसर antimitotic ड्रग्स के लिए असंवेदनशील है19।
इस लेख में, हम एक विधि जो retroviral संक्रमण के माध्यम से एक HT29-DR3 स्थिर सेल लाइन की पीढ़ी की अनुमति देता है का वर्णन । हम आगे कैसे पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर इन कोशिकाओं में DR3 अभिव्यक्ति को मांय करने के लिए और कैसे एक सेल व्यवहार्यता परख और रूपात्मक अवलोकन का उपयोग करके antimitotic एजेंटों के लिए संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए दिखा । कोशिकाओं को एक क्लोन से परिलक्षित होते है और, इस प्रकार, एक सजातीय आनुवंशिक पृष्ठभूमि का लाभ है । इसके अलावा, DR3 पर झंडा टैग माइक्रोस्कोपी और जैव रासायनिक दृष्टिकोण से जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण द्वारा सेलुलर DR3 के दृश्य के लिए अनुमति दी । इसके अलावा, कोशिकाओं को चूहों में xenografted जा सकता है आगे vivo14में antimitotics के जवाब में ट्यूमर प्रगति का विश्लेषण ।
HT29-DR3 सेल प्रणाली यहां प्रस्तुत कैसे antimitotics कैंसर कोशिकाओं को मारने के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी उपकरण की पेशकश14। के बाद से व्यक्त और पछाड़ना सेल लाइनों जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए आम उपकरण हैं, इस प्रोटोकॉल ब्याज या अंय सेल लाइनों के अंय जीनों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है और, इस प्रकार, एक बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण में बदल गया ।
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Protocol
कृपया ध्यान दें कि यहां वर्णित सभी माउस प्रयोगों को अनुमोदित किया गया था और Tsinghua विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुसार किया गया था ।
1. DR3 एक्सप्रेस सेल लाइनों की जनरेशन
- DR3 अभिव्यक्ति के लिए प्लाज्मिड का निर्माण (pMXs-आयरेस-DR3-झंडा) पर 3x ध्वज के साथ पूर्ण लंबाई DR3 सीडीएनए डालने के द्वारा सी-टर्मिनस में retroviral वेक्टर pMXs-आयरेस-Blasticidin BamHI के प्रतिबंध स्थलों पर/XhoI ।
- बढ़ती बेनी-Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 4 मिलीलीटर के साथ ६० mm व्यंजन में एक कोशिकाओं । अगले दिन, जब कोशिकाएं ८०%-९०% संगम तक पहुंचती हैं, तो transfect कोशिकाओं को 2 μg के साथ प्लाज्मिड pMXs-आयरेस-DR3-अभिकर्मक का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के मैनुअल20के अनुसार फ्लैग करें ।
- ७२ एच के बाद, supernatant इकट्ठा, एक ०.४५ माइक्रोन बाँझ फिल्टर का उपयोग कर मीडिया को छानने का, और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में वायरल निलंबन रखने के लिए ।
- एक ६० mm डिश में DMEM में HT29 कोशिकाओं को विकसित करने और 5% CO2के साथ ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन ।
- अगले दिन, जब कोशिकाएं 30%-५०% संगम तक पहुंचती हैं, वायरल सस्पेंशन के 8 μg की उपस्थिति में 2 एमएल के 1, 5-Dimethyl-1, 5-diazaundecamethylene polymethobromide के प्रति milliliter के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के 4-6 एच के बाद, वायरल निलंबन महाप्राण, ताजा DMEM के 4 मिलीलीटर जोड़ें, और मशीन के लिए पकवान वापस ।
- व्यंजन 24 ज postinfection से मीडिया को त्यागें और सावधानी से गरम पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । trypsin-EDTA की 1 मिलीलीटर कोशिकाओं को जोड़ें और 3 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
- 10x आवर्धन पर एक खुर्दबीन के नीचे देख रहा है कि कोशिकाओं के सबसे अलग है के बाद, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त पूर्ण DMEM के 2 मिलीलीटर के साथ trypsinization बंद करो । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए और कमरे के तापमान (आरटी) में 5 मिनट के लिए २०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
- supernatant निकालें और DMEM के 10 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । धीरे से ऊपर और नीचे pipetting से अच्छी तरह मिलाएं । 30, १००, और ३०० के कारकों से कोशिकाओं को पतला । 1 µ g/मिलि blasticidin युक्त DMEM के 20 मिलीलीटर के साथ १५० मिमी के व्यंजन में कोशिकाओं को बीज । 5% CO2 के साथ एक ३७ ° c मशीन पर मशीन ~ 1-2 सप्ताह के लिए ।
- इस अवधि के दौरान, हर दिन कालोनियों का निरीक्षण 10x आवर्धन पर एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ । डिश के तल पर अच्छी तरह से पृथक कालोनियों मार्क जब कॉलोनी व्यास के बारे में 1-2 मिमी है ।
- मध्यम महाप्राण और पूर्व गर्म पंजाबियों के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । ६० mm डिश में trypsin-EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें । autoclaved बाँझ क्लोनिंग सिलेंडर लेने के लिए बाँझ संदंश का प्रयोग करें, और उन्हें ६० mm डिश में जगह है । trypsin-EDTA युक्त सिलेंडर उठाओ और धीरे उंहें चिह्नित कालोनियों पर जगह है । सुनिश्चित करें कि हर क्लोनिंग सिलेंडर में केवल एक कॉलोनी होती है और आसपास की कालोनियों के साथ संदूषण से बचना चाहिए ।
- 3 मिनट के लिए मशीन के लिए डिश लौटें ।
- 3 मिनट के बाद, 10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करने के लिए देखना है कि क्या वे अलग है । जब कोशिकाओं को उठा लिया है, trypsin को निष्क्रिय करने के लिए प्रत्येक सिलेंडर के लिए संस्कृति माध्यम के ७० μL जोड़ें । धीरे एक २०० μL पिपेट के साथ सेल निलंबन मिश्रण । इस प्रक्रिया के दौरान सिलेंडर नहीं ले जाने के लिए सुनिश्चित करें ।
- प्रत्येक कॉलोनी से २ २४-अच्छी तरह से DMEM के प्रति 1 मिलीलीटर युक्त प्लेटों के लिए सेल सस्पेंशन स्थानांतरण । सेल सस्पेंशन के 30 μL को प्लेट ए में अच्छी तरह से जोड़ें और प्लेट बी में इसी कुएं में ७० μL प्लेट्स को ठीक से लेबल करें और उन्हें वापस मशीन में डाल दें ।
2. DR3 एक्सप्रेस सेल लाइन का सत्यापन
- जब प्लेट बी में कोशिकाओं ९०% संगम पर हैं, मीडिया को हटा दें और ध्यान से कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर के साथ धो लें । पूरी तरह से पंजाबियों को हटाने और 1x एसडीएस के ५० μL के साथ कोशिकाओं लाइसे-पृष्ठ लोड हो रहा है बफर । 24-खैर प्लेट से १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों के लिए सेल lysates स्थानांतरण और १०० डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूने फोड़ा ।
- 15 मिनट के लिए ८० वी के एक स्थिर वोल्टेज पर 10% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) जेल पर नमूने चलाने के लिए और, फिर, १२० वी पर 1 एच के लिए ।
- 2 ज के लिए ४०० mA के एक निरंतर वर्तमान में गीला हस्तांतरण द्वारा एक polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली को प्रोटीन स्थानांतरण ।
- विरोधी ध्वज एंटीबॉडी के साथ अलग क्लोन में DR3 अभिव्यक्ति का परीक्षण, एक नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 1) के रूप में जंगली प्रकार HT29 कोशिकाओं का उपयोग कर । ५,००० के एक कारक द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी पतला 5% नोनफेट दूध है कि TBST में भंग कर रहा है में (Tris-20 ०.१% के बीच युक्त खारा) । रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर झंडा एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की मशीन ।
- TBST के साथ यह आर टी में २०० rpm पर एक फीका करना शेखर पर मिलाते हुए झिल्ली धो लो TBST ताज़ा 15 मिनट की कुल धुलाई समय के लिए हर 5 मिनट ।
- विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की मशीन 5% नोनफेट दूध में १०,००० के एक कारक द्वारा पतला 4 डिग्री सेल्सियस पर 5-6 एच के लिए ।
- चरण २.५ में वर्णित के रूप में फिर से झिल्ली धो लें ।
- एक जेल प्रलेखन प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पश्चिमी बढ़ाया chemiluminescence (ECL) सब्सट्रेट और छवि झिल्ली का उपयोग फ्लैग अभिव्यक्ति का पता लगाने । सकारात्मक क्लोन के रूप में DR3 व्यक्त क्लोन की पहचान करें ।
- प्लेट में क्लोन एक है कि प्लेट बी में सकारात्मक क्लोनों के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली के अनुरूप स्थानांतरण और कोशिकाओं बढ़ाना जारी रखें जब तक उंहें 10 सेमी व्यंजन में बढ़ रही है । सकारात्मक क्लोन से बढ़ रही कोशिकाओं के जमे हुए शेयरों बनाओ और उंहें दुकान पर-८० ° c भविष्य के उपयोग के लिए ।
3. Antimitotic एजेंटों के लिए कोशिकाओं की अपोप्तोटिक प्रतिक्रिया का आकलन
नोट: Diazonamide समुद्री प्राकृतिक उत्पाद का एक नया वर्ग है कि कैंसर कोशिका विकास, जो अंय tubulin-स्थिर एजेंटों21दर्पण को रोकते में उल्लेखनीय गतिविधि है । हालांकि, कार्रवाई की अपनी विधा अस्पष्ट बनी हुई है । antimitotic एजेंटों के लिए कोशिकाओं के सेलुलर प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए, paclitaxel और diazonamide जंगली प्रकार HT29 कोशिकाओं और HT29-DR3 कोशिकाओं के इलाज के लिए इस्तेमाल किया गया । दवाओं 10 मिमी शेयरों बनाने के लिए dimethyl sulfoxide (DMSO) में घुल गया था और, तो, आगे अलग सांद्रता को पतला: 30 एनएम, १०० एनएम, ३०० एनएम, १,००० एनएम, ३,००० एनएम, और DMSO में १०,००० एनएम ।
- HT29 और HT29-DR3 कोशिकाओं को trypsinization करके लीजिए. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिका घनत्व को मापने । फिर, DMEM में 12-अच्छी तरह से प्लेटों में 3 x 104 कोशिकाओं के प्रति एक घनत्व पर बीज कोशिकाओं । अगले दिन, 10 एनएम diazonamide जोड़ें और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 1% DMSO का उपयोग करें । उपचार के ४८ एच के बाद, छवि 10x आवर्धन (चित्रा 2) पर एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं ।
- बीज HT29 और HT29-DR3 कोशिकाओं में अच्छी तरह से DMEM में 3 एक्स 103 कोशिकाओं के प्रति एक घनत्व पर प्लेटें और उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने की अनुमति । फिर, खुराक-बढ़ते diazonamide सांद्रता ०.३ एनएम, 1 एनएम, 3 एनएम, 10 एनएम, 30 एनएम, और १०० एनएम के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 1% DMSO का उपयोग कर जोड़ें ।
- उपचार के ४८ ज के बाद, कोशिका व्यवहार्यता एक luminescence-आधारित सेल व्यवहार्यता परख किट का उपयोग कर निर्माता के मैनुअल के अनुसार उपाय ।
- बाहर ले ९६-मशीन से अच्छी तरह से थाली और यह लगभग 30 मिनट के लिए आर टी पर खड़े हो जाओ । फिर, एक अच्छी तरह से ५० µ परख के एल जोड़ने के लिए, 2 मिनट के लिए आर टी पर प्लेट मिलाने के लिए कोशिकाओं लाइसे, और एक और 10 मिनट के लिए आरटी पर थाली मशीन । एक अच्छी तरह से एक microplate रीडर (चित्रा 3) का उपयोग कर के luminescence निर्धारित करते हैं ।
नोट: कोशिका व्यवहार्यता के सापेक्ष luminescence तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है कि नियंत्रण के लिए अच्छी तरह से 1% DMSO के साथ इलाज किया ।
- बाहर ले ९६-मशीन से अच्छी तरह से थाली और यह लगभग 30 मिनट के लिए आर टी पर खड़े हो जाओ । फिर, एक अच्छी तरह से ५० µ परख के एल जोड़ने के लिए, 2 मिनट के लिए आर टी पर प्लेट मिलाने के लिए कोशिकाओं लाइसे, और एक और 10 मिनट के लिए आरटी पर थाली मशीन । एक अच्छी तरह से एक microplate रीडर (चित्रा 3) का उपयोग कर के luminescence निर्धारित करते हैं ।
- vivo स्टडी14 में एक के लिए छह सप्ताह पुरानी महिला बालब/
नोट: चूहों विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त शर्तों के तहत बनाए रखा गया था ।- Trypsinize HT29 और HT29-DR3 सेल और, फिर, ३७ डिग्री सेल्सियस पर trypsinization का उपयोग कर DMEM बंद करो । एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए और आरटी पर 10 मिनट के लिए १,००० rpm पर कोशिकाओं को छोड़ । supernatant त्यागें और DMEM माध्यम में सेल गोली FBS बिना resuspend । कोशिकाओं को फिर से केंद्रापसारक और पंजाब में सेल गोली resuspend ।
- एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और २.५ x 107 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को पतला/ HT29 या HT29-DR3 सेल निलंबन के २०० μL के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से ट्यूमर उत्पन्न प्रत्येक माउस के दाहिने पार्श्व में (5 x 106 कोशिकाओं/
- प्रत्यारोपण के बाद कैलिपर्स हर 2 डी का उपयोग कर ट्यूमर की मात्रा (टीवी) को मापने । निंनलिखित सूत्र का उपयोग कर टीवी की गणना: टी वी = 1/2L एक्स डब्ल्यू एक्स डब्ल्यू (यहां, डब्ल्यू: ट्यूमर चौड़ाई, एल: ट्यूमर लंबाई) । जब औसत ट्यूमर मात्रा के बारे में १०० mm3तक पहुंच जाता है, या तो नियंत्रण या इलाज समूह (n = 6 प्रति समूह) में चूहों यादृच्छिक और उपचार शुरू ।
- paclitaxel समाधान निम्नानुसार तैयार करें । सबसे पहले, कुल मात्रा के 5% से कम इथेनॉल में पूरी तरह से paclitaxel भंग और, तो, polyoxyl ३५ हाइड्रोजनीकृत अरंडी के तेल के अंतिम मात्रा के 5% जोड़ें । अंत में, D5W के साथ मात्रा का शेष ९०% (पानी में 5% डेक्सट्रोज, पीएच ७.४) बनाते हैं ।
- दो सप्ताह के लिए प्रति सप्ताह 20 मिलीग्राम/किलो 3x की एक खुराक पर नसों में paclitaxel सुई । ट्यूमर की मात्रा और शरीर के वजन को मापने 3x एक सप्ताह14। प्रयोग समाप्त और जानवरों euthanize अगर शरीर के वजन 20% से कम हो जाती है या ट्यूमर की मात्रा के बारे में २,००० mm3तक पहुंचता है ।
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Representative Results
HT29 छुरा DR3 व्यक्त की कोशिकाओं का एक लक्षण चित्र 1में दिखाया गया है । क्लोन DR3 के स्तर अलग व्यक्त करते हैं, जबकि जंगली प्रकार की कोशिकाओं है, जो एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा, exogenous जीन अभिव्यक्ति मत दिखाओ । यहां हम केवल पांच क्लोन, जो बीच में 1 क्लोन और 5 DR3 के उच्चतम स्तर एक्सप्रेस दिखाओ । हम क्लोन 1 और 5 निंनलिखित प्रयोगों के लिए चुना है ।
diazonamide के प्रशासन के बाद HT29 और HT29-DR3 कोशिकाओं की आकृति विज्ञान चित्रा 2में 10x आवर्धन पर एक औंधा माइक्रोस्कोप द्वारा मनाया गया था. 10 एनएम diazonamide के साथ एक ४८ एच उपचार के बाद, HT29-DR3 स्पष्ट apoptosis दिखाया, एक टूटी हुई कोशिका झिल्ली और कोशिका मलबे (नीचे पैनल) के साथ । हालांकि, HT29 केवल बरकरार एक दौर अप सेल आकार (शीर्ष पैनल) का प्रदर्शन कोशिकाओं के साथ mitotic गिरफ्तारी दिखाया ।
diazonamide के साथ उपचार के बाद HT29 और HT29-DR3 कोशिकाओं की कोशिका व्यवहार्यता चित्रा 3में दिखाया गया है । 3 एनएम diazonamide के साथ उपचार के ४८ एच के बाद, ८०% से अधिक कोशिका मृत्यु HT29-DR3 कोशिकाओं (लाल वक्र) में पाया गया था । हालांकि, पैतृक HT29 कोशिकाओं केवल mitotic गिरफ्तारी (नीली वक्र) के रूप में diazonamide के लिए एक मामूली प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया । इस प्रकार, DR3 के व्यक्त इन कोशिकाओं में diazonamide-प्रेरित अपोप्तोटिक मार्ग का पुनर्गठन किया ।
vivo में ट्यूमर xenograft प्रयोगों के लिए परिणाम एक पिछले पेपर14में दिखाया गया है । दोनों HT29 और HT29-DR3 के लिए ट्यूमर आरोपण की सफलता दर १००% है । xenograft ट्यूमर वाहन नियंत्रण में इसी तरह प्रगति; हालांकि, HT29-DR3 xenografts की एक खुराक पर xenografts के साथ इलाज किया जब HT29 paclitaxel से तेजी से ट्यूमर प्रतिगमन प्रदर्शित 20 मिलीग्राम/किग्रा । HT29 की एक बेहतर प्रतिक्रिया के हमारे अवलोकन-DR3 ट्यूमर से paclitaxel में HT29 ट्यूमर की तुलना में vivo आगे की पुष्टि की है कि अस्थानिक की एक DR3 अभिव्यक्ति ट्यूमर कोशिकाओं antimitotics के लिए और अधिक संवेदनशील renders.
चित्रा 1 : अलग क्लोन में DR3 अभिव्यक्ति का विश्लेषण । DR3 अभिव्यक्ति स्तर विरोधी झंडा (शीर्ष पैनल) और विरोधी बीटा-actin एंटीबॉडी (नीचे पैनल, एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में) के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया । पैरेंटल HT29 कक्षों का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : diazonamide के साथ उपचार के बाद HT29 और HT29-DR3 कोशिकाओं के आकृति विज्ञान विश्लेषण । HT29 (टॉप पैनल) और HT29-DR3 (बॉटम पैनल) के साथ 10 एनएम diazonamide के लिए ४८ एच का इलाज किया गया । स्केल सलाखों = १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : खुराक-प्रतिक्रिया घटता HT29 और HT29-DR3 कोशिकाओं diazonamide करने के लिए. कोशिका व्यवहार्यता diazonamide के धारावाहिक सांद्रता के साथ उपचार के ४८ ज के बाद मापा गया था । त्रुटि पट्टियों प्रयोगात्मक triplicates के मानक विचलन (एसडी) = । दा = diazonamide । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस पांडुलिपि में, हम HT29-DR3 स्थिर सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन । HT29-DR3 कोशिकाओं आणविक तंत्र है जिसके द्वारा DR3 antimitotic एजेंटों द्वारा प्रेरित apoptosis के लिए योगदान के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रदान करते हैं । यह दृष्टिकोण बहुमुखी और दोहराया जा रहा है । इस प्रक्रिया की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटोकॉल के चार प्रमुख कदम पर विचार करने की आवश्यकता है । सबसे पहले, एक उच्च पर्याप्त वायरस titer का उत्पादन करने के लिए, यह डीएनए अभिकर्मक प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है जब बेनी-एक कोशिकाओं ८०%-९०% संगम पर हैं । दूसरा, वायरल निलंबन 4 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं अब 2 सप्ताह, प्रकाश से आच्छादित के लिए संग्रहित किया जाना चाहिए । तीसरा, जब संक्रमित कोशिकाओं को १५० mm व्यंजन में बांटना, यह अच्छी तरह से अलग कालोनियों पाने के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने की सिफारिश की है, के रूप में संक्रमण दक्षता अलग कोशिकाओं में बदलता है । अंतत: जब एक भी कॉलोनी उठा तो आसपास की कालोनियों के साथ कोई भी प्रदूषित नहीं होना चाहिए ।
यह प्रोटोकॉल अधिकांश कक्ष रेखाओं के साथ अच्छी तरह कार्य करता है लेकिन संभावित रूप से उन कक्षों के लिए कठिन हो सकता है जो एकल कालोनियां बनाने के लिए नहीं होते । ऐसे मामलों में, अंय कोशिका छंटाई तकनीक, जैसे प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के साथ संयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं की जरूरत होगी ।
स्थिर अभिकर्मक वायरल और गैर वायरल दोनों तरीकों में शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम DR3 व्यक्त कोशिकाओं को उत्पंन करने के लिए एक retroviral संक्रमण का इस्तेमाल किया, तर्क है कि भौतिक तरीकों, जैसे electroporation, अधिक कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं23 और रासायनिक तरीके, लिपिड के रूप में-मध्यस्थता डीएनए-अभिकर्मक, एक कम है कई प्रकार के सेल में दक्षता और संभावित बंद लक्ष्य प्रभाव24,25,26।
अस्थानिक अभिव्यक्ति जीन कार्यों को स्पष्ट करने का प्रत्यक्ष और कारगर तरीका है. इसलिए, इस प्रोटोकॉल अंय लक्ष्य अणुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, जीन पछाड़ना भी कार्यात्मक अध्ययन में महत्वपूर्ण है, और यह संभव है कि प्रोटोकॉल जीन पछाड़ना प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । अंय जीन में दस्तक की तुलना में और नॉक आउट दृष्टिकोण, जैसे CRISPR-Cas9, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए आसान है और सभी प्रयोगशालाओं के लिए सस्ती है ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है.
Acknowledgments
इस काम के लिए अनुदान ५३११००००११७ (गिनीकृमि) और ०४३२२२०१९ (Tsinghua विश्वविद्यालय से X.W.) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
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