Summary
Etablering af en stabil cellelinie overekspression et gen af interesse at studere genfunktion kan gøres ved stabil Transfektion-picking enkelt kloner efter transfecting dem via retroviral infektion. Her viser vi, at HT29-DR3 cellelinjer genereres på denne måde belyse mekanismerne ved hvilken død receptor 3 (DR3) bidrager til antimitotics-induceret apoptose.
Abstract
At studere funktionen af et gen af interesse kan opnås ved at manipulere dens niveau for udtryk, såsom faldende dens udtryk med knockdown cellelinjer eller øge sit udtryk med overekspression cellelinjer. Forbigående og stabil Transfektion er to metoder, der bruges ofte til eksogene genekspression. Forbigående Transfektion er kun nyttig til at kortsigtede udtryk, mens stabil Transfektion tillader udefrakommende gener skal integreres i vært celle genom hvor det vil være løbende udtrykt. Som et resultat, er stabil Transfektion normalt ansat for forskning i langsigtede genetiske regulering. Her beskriver vi en enkel protokol for at generere en stabil cellelinie overekspression tagged død receptor 3 (DR3) at udforske DR3 funktion. Vi tog enkelt kloner efter en retroviral infektion for at opretholde ensartethed og renhed af de stabile cellelinjer. De stabile cellelinjer genereret ved hjælp af denne protokol render DR3-mangelfuld HT29 celler følsomme over for antimitotic stoffer, dermed erstatningsgodtgørelse apoptotiske svar i HT29 celler. Desuden, koden FLAG på DR3 kompenserer for utilgængelighed god DR3 antistof og letter biokemiske studier af den molekylære mekanisme som antimitotic agenter inducerer apoptose.
Introduction
Heterolog Gen-ekspression er ofte ansat til at studere funktionen af gener af interesse. To metoder, forbigående og stabil Transfektion, bruges mest i celler og molekylær biologi til at indsætte et segment af DNA eller RNA i en vært celle1,2. Forbigående transfekteret DNA eller RNA kan ikke blive videregivet til datterceller, så den genetiske ændring kan kun opbevares i en kort periode. På den anden side i stabilt transfekteret celler, er udefrakommende gener integreret i vært celle genom, fastholde sit udtryk i cellelinie. Stabil Transfektion er således en metode, der er normalt reserveret til forskning i langsigtede genetiske regulering. Den stabile cellelinie kan også transplanteres, som xenografts i musemodeller for in-vivo undersøgelse3. Stabil Transfektion kan opdeles i to kategorier: viral og nonviral. I forhold til nonviral Transfektion, kan virusinfektion overføre gener til en bredere vifte af menneskelige celler med en højere effektivitet4,5,6,7. Desuden tilbyder en stabil cellelinie fra en enkelt klon fordel af homogenitet og klonede renhed.
Ukontrolleret cellevækst og division er de mest karakteristiske træk ved kræft. I kliniske indstillinger er antimitotic agenter de primære behandlinger for mange typer af tumorer8. Imidlertid kan ikke nogle væsentlige begrænsninger af antimitotic agenter ignoreres. Først, disse kemoterapier kan også dræbe normale celler sammen med uønskede kræftceller, og således kan resultere i alvorlige bivirkninger8. Andet, antitubulin narkotika er ikke effektive mod alle typer af tumorer, trods tubulin's allestedsnærværende udtryk i en bred vifte af forskellige væv som en cytoskeletal proteiner9,10. Det er uklart, hvorfor antitubulin agenter viste lovende effekt mod æggestokkene, lunge-, og hematological kræft i klinisk behandling, men ikke i nyrerne, tyktarmen eller pancreascancer11. Endelig, selv patienter med den samme type af tumor kan reagere på antimitotics anderledes på en uforudsigelig måde. Der kan være en afgørende effektor molekyle, der påvirker følsomheden af forskellige patienter til antimitotic agenter, hvilket resulterer i de forskellige resultater set i kliniske behandling12. Således, de potentielle differential følsomheder af patienter til antimitotic behandling bør tages i betragtning for at optimere terapeutiske indgreb13.
En høj overførselshastighed hele-genom siRNA Biblioteksskærmen demonstreret at DR3 knockdown kunne gøre følsomme celler resistente antimitotic medicin, implicere en rolle for DR3 i kemoterapi-induceret apoptose14. Som medlem af tumor nekrose faktor receptor (TNFR) superfamilien, er DR3 blevet rapporteret at mægle celle apoptose i forskellige systemer15,16,17,18. Således, vi satte sig for at etablere stabile cellelinjer overekspression DR3 for at studere de molekylære mekanismer, hvorved antimitotic narkotika inducerer apoptose. En passende celle model til at studere DR3 overekspression kan være fastsat af menneskelige colon cancer cellelinie HT29, der fandtes for at være DR3-mangelfuld. Derudover i klinikken, kolon kræft er ufølsom over for antimitotic narkotika19.
I denne artikel vil beskrive vi en metode, som giver mulighed for generation af en HT29-DR3 stabil cellelinie gennem retroviral infektion. Yderligere viser vi hvordan du validere DR3 udtryk i disse celler ved hjælp af western blotting og at vurdere følsomhed over for antimitotic agenter ved hjælp af en celle levedygtighed assay og morfologiske observation. Cellerne er amplificeret fra enkelt kloner, og således har fordel af en homogen genetiske baggrund. Desuden, tilladt koden FLAG på DR3 for visualisering af cellulære DR3 ved mikroskopi og analyse af gen expression og protein interaktion af biokemiske metoder. Cellerne kan endvidere være xenografted i mus til yderligere analysere tumor progression i svar til antimitotics i vivo14.
HT29-DR3 celle systemet præsenteres her tilbudt et effektivt redskab til at studere de molekylære mekanismer af hvordan antimitotics dræbe kræft celler14. Da overekspression og knockdown cellelinjer er fælles værktøjer til at studere genfunktion, kan denne protokol nemt tilpasses andre gener af interesse eller andre cellelinjer og, dermed, forvandlet til en udstrakt grad anvendte tilgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk venligst at alle mus eksperimenter beskrevet her blev godkendt og udført i overensstemmelse med den institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Tsinghua University.
1. generation af DR3 overekspression cellelinjer
- Konstruere plasmid for DR3 udtryk (pMXs-IRES-DR3-FLAG) ved at indsætte fuld længde DR3 cDNA med 3 x FLAG på C-terminus i retroviral vektor pMXs-IRES-Blasticidin på lokaliteter, begrænsning af BamHI/XhoI.
- Vokse Plat-A celler i 60 mm retter med 4 mL af Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM). Den næste dag, når cellerne når 80-90% sammenløb, transfect celler med 2 μg af plasmidet pMXs-IRES-DR3-FLAG ved hjælp af Transfektion reagens (Se Tabel af materialer) ifølge producentens manuel20.
- Efter 72 h, indsamle supernatanten, filtratet medierne ved hjælp af en 0,45 μm sterile filter og holde den viral suspension i mørke ved 4 ° C.
- Vokse HT29 celler i DMEM i en 60 mm parabol og inkuberes celler ved 37 ° C med 5% CO2.
- Den næste dag, når cellerne kommer 30-50% sammenløb, inficere celler med 2 mL af viral suspension i nærværelse af 8 μg af 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide per milliliter af viral suspension. Efter 4-6 h inkubation ved 37 ° C, Opsug den virale suspension, tilsættes 4 mL frisk DMEM og returnere skålen til rugemaskine.
- Kassér medier fra retter 24 timer efter infektion og omhyggeligt vaske cellerne med 2 mL af forvarmet PBS. Der tilsættes 1 mL af trypsin-EDTA til cellerne og inkuberes ved 37 ° C i 3 min.
- Efter at have observeret under et mikroskop ved 10 X forstørrelse, at de fleste af cellerne er skilt, stop trypsinization med 2 mL af komplet DMEM indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS). Indsamle cellesuspension i en 15 mL tube og centrifugeres celler på 200 x g i 5 min. ved stuetemperatur (RT).
- Fjern supernatanten og celle resuspenderes i 10 mL af DMEM. Bland godt ved forsigtigt pipettering op og ned. Fortyndes cellerne af faktorer af 30, 100 og 300. Frø celler i 150 mm retter med 20 mL af DMEM indeholdende 1 µg/mL blasticidin. Der inkuberes ved 37 ° C kuvøse med 5% CO2 ~ 1-2 uger.
- I denne periode, observere kolonierne hver dag med en inverteret mikroskop ved 10 X forstørrelse. Markere de godt isolerede kolonier i bunden af fadet, når koloni diameter er omkring 1-2 mm.
- Opsug mediet og cellerne vaskes med 3 mL pre varmede PBS. Tilsættes 2 ml trypsin-EDTA i en 60 mm parabol. Brug steril pincet til at afhente autoklaveres sterile kloning cylindre, og placere dem i 60 mm parabol. Afhente flasker der indeholder trypsin-EDTA og anbring dem forsigtigt over de markerede kolonier. Sørg for hver kloning cylinder kun indeholder én koloni og undgå forurening med nærliggende kolonier.
- Vende fadet til rugemaskine i 3 minutter.
- Efter 3 min, se celler under mikroskop ved 10 X forstørrelse at se, om de er skilt. Når cellerne har løftet op, skal du tilføje 70 μL af næringssubstratet til hver cylinder til at inaktivere trypsin. Forsigtigt blandes cellesuspension med 200 μl pipette. Sørg for ikke at flytte cylinderen under denne proces.
- Overføre cellesuspension fra hver koloni til to 24-godt plader der indeholder 1 mL DMEM pr. brønd. Tilsæt 30 μL af cellesuspension pr. brønd i plade A og 70 μL i de tilsvarende brønde i plade B. etiket pladerne ordentligt og læg dem tilbage i inkubatoren.
2. kontrol af DR3 overekspression cellelinje
- Når cellerne i plade B er på 90% confluence, fjerne medier og omhyggeligt vaske cellerne med 1 mL PBS. Helt fjerne PBS og lyse celler med 50 μL 1 x SDS-PAGE loading bufferen. Overføre cellelysater fra 24-godt plade til 1,5 mL centrifugeglas og kog prøver i 10 min. ved 100 ° C.
- Køre prøverne på 10% natrium dodecyl sulfat (SDS) gel med en konstant spænding på 80 V i 15 min og derefter på 120 V på 1 h.
- Overføre proteinet til en polyvinylidene fluorid (PVDF) membran af våde overførsel på en konstant strøm af 400 mA for 2 h.
- Teste DR3 udtryk i forskellige kloner med anti-FLAG antistof, ved hjælp af wild-type HT29 celler som en negativ kontrol (figur 1). Fortynd den primære antistof med en faktor på 5.000 i 5% nonfat mælk, der er opløst i TBST (Tris-bufferet saltvand indeholder 0,1% Tween-20). Inkuber membran med FLAG antistof ved 4 ° C natten over.
- Vask membran med TBST ved at ryste det på en decoloring shaker på 200 rpm på RT. Refresh TBST hvert 5 min i alt vask tid af 15 min.
- Inkuber membranen med anti-mus sekundær antistof fortyndet med en faktor på 10.000 i 5% nonfat mælk ved 4 ° C i 5-6 h.
- Vask membran igen som beskrevet i trin 2,5.
- Opdage FLAG udtryk ved hjælp af vestlige forbedret kemiluminescens (ECL) substrat og billed membran med en gel dokumentationssystem (Se Tabel af materialer). Identificere kloner at udtrykke DR3 som de positive kloner.
- Overføre de kloner i plade A, der svarer til positive kloner i plade B til en 6-godt plade og fortsætte med at forstærke cellerne indtil vokser dem i 10 cm retter. Gøre frosne bestande af celler vokser fra positive kloner og gemme dem på-80 ° C til fremtidig brug.
3. vurdering af de apoptotiske svar af celler til Antimitotic agenter
Bemærk: Diazonamide er en ny klasse af marine naturlige produkt, der har bemærkelsesværdige aktivitet i at hæmme kræft cellevækst, som afspejler andre tubulin-destabiliserende agenter21. Dets virkningsmekanisme er dog fortsat uklart. For at teste den cellulære reaktion af celler til antimitotic agenter, blev paclitaxel og diazonamide brugt til at behandle vildtype HT29 celler og HT29-DR3 celler. Narkotika blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) at gøre 10 mM bestande og derefter fortyndes yderligere til forskellige koncentrationer: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3.000 nM, og 10.000 nM i DMSO.
- Indsamle HT29 og HT29-DR3 celler ved trypsinization. Måle celle tætheden ved hjælp af en automatisk celle counter. Derefter, seed celler i 12-godt plader i DMEM med en tæthed på 3 x 104 celler pr. brønd. Den næste dag, tilføje 10 nM diazonamide og anvende 1% DMSO som negativ kontrol. Efter 48 h af behandling, billede cellerne under et mikroskop ved 10 X forstørrelse (figur 2).
- Frø HT29 og HT29-DR3 celler i 96-brønd plader i DMEM med en tæthed på 3 x 103 celler pr. brønd og tillade dem at vokse natten over ved 37 ° C. Tilføj derefter, dosis-eskalerer diazonamide koncentrationer af 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, og 100 nM for hver brønd, ved hjælp af 1% DMSO som en negativ kontrol.
- Efter 48 h af behandling, måle celle levedygtighed ved hjælp af en luminescence-baserede celle levedygtighed assay kit ifølge producentens manual.
- Tag den 96-brønd plade fra rugemaskinen og lad det stå på RT for ca 30 min. Derefter, tilsæt 50 µL af analysereagenserne til hver brønd, ryste pladen på RT for 2 min til lyse celler, og Inkuber plade på RT for en anden 10 min. Bestem luminescence i hver brønd med en mikrotiterplade læser (figur 3).
Bemærk: Cellernes levedygtighed repræsenterer relative luminescence intensiteten af hver godt til, i kontrolelementet godt behandlet med 1% DMSO.
- Tag den 96-brønd plade fra rugemaskinen og lad det stå på RT for ca 30 min. Derefter, tilsæt 50 µL af analysereagenserne til hver brønd, ryste pladen på RT for 2 min til lyse celler, og Inkuber plade på RT for en anden 10 min. Bestem luminescence i hver brønd med en mikrotiterplade læser (figur 3).
- Bruge seks uger gamle kvindelige BALB/c nøgen mus til en i vivo undersøgelse14.
Bemærk: Mus blev opretholdt under specifikt patogenfrie betingelser.- Trypsinize HT29 og HT29-DR3 celle og derefter stoppe trypsinization ved hjælp af DMEM forvarmet ved 37 ° C. Indsamle cellesuspension i en 50 mL tube og centrifugeres celler ved 1000 rpm i 10 min på RT. udsmid supernatanten og resuspenderes celle i DMEM medium uden FBS. Centrifugeres cellerne igen og resuspenderes celle i PBS.
- Tælle celler ved hjælp af en automatisk celle counter og fortyndes celler til en koncentration af 2,5 x 107 celler/mL ved hjælp af PBS. Generere tumorer gennem en subkutan injektion af 200 μl af HT29 eller HT29-DR3 cellesuspension i den højre flanke af hver mus (5 x 106 celler/mus)22.
- Måle tumor volumen (TV) med calipre hver 2 d efter transplantation. Beregne ved hjælp af følgende formel: TV = 1 / 2L x W x W (her, W: tumor bredde, L: tumor længde). Når den gennemsnitlige tumor volumen når omkring 100 mm3, randomisere musene i enten kontrolelementet eller den behandlede gruppe (n = 6 pr. gruppe) og indlede behandlingen.
- Forberede paclitaxel løsning som følger. Først, opløse paclitaxel helt i ethanol på 5% af det samlede volumen, og derefter tilføje 5% af det endelige rumfang af polyoxyl 35 hydrogeneret ricinusolie. Endelig udgør de resterende 90% af mængden med D5W (5% dextrose i vand, pH 7,4).
- Injicere paclitaxel intravenøst ved en dosis på 20 mg/kg 3 x pr uge for to uger. Måle tumor volumen og kropsvægt 3 x en uge14. Opsige eksperimentet og aflive dyrene hvis kropsvægten falder med 20% eller tumor volumen når omkring 2.000 mm3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En Karakteristik af HT29 celler stabilt udtrykker DR3 er vist i figur 1. Klonerne express varierende niveauer af DR3, mens wild-type celler, der tjener som en negativ kontrol, ikke viser udefrakommende genekspression. Her viser vi kun fem kloner, blandt hvilke klon 1 og 5 udtrykke det højeste niveau af DR3. Vi valgte klon 1 og 5 for de følgende eksperimenter.
Morfologi af HT29 og HT29-DR3 celler efter indgift af diazonamide blev observeret af en inverteret mikroskop ved 10 X forstørrelse i figur 2. Efter en 48 h behandling med 10 nM diazonamide viste HT29-DR3 indlysende apoptose, med en brækket cellemembranen og celle debris (nederste panel). HT29 viste imidlertid kun mitotiske anholdelse med intakt celler udstiller en runde-up celle figur (toppanelet).
Cellernes levedygtighed af HT29 og HT29-DR3 celler efter behandling med diazonamide er vist i figur 3. Efter 48 h af behandling med 3 nM diazonamide, over 80% celledød blev fundet i HT29-DR3 celler (rød kurve). Dog viste de parental HT29 celler kun en lille reaktion på diazonamide i form af mitotiske anholdelse (blå kurve). Således rekonstitueres overekspression af DR3 diazonamide-induceret apoptotiske pathway i disse celler.
Resultater for i vivo tumor xenograft eksperimenter har været vist i en tidligere papir14. Succesraten for tumor implantation for både HT29 og HT29-DR3 er 100%. Xenograft tumorer udviklet sig på samme måde i køretøjet kontrol; HT29-DR3 xenografts vises dog hurtigere tumorregression end HT29 xenografts når de behandles med paclitaxel i en dosis på 20 mg/kg. Vores observation af en bedre reaktion på HT29-DR3 tumorer paclitaxel end HT29 tumorer i vivo yderligere bekræftet at Ektopisk udtryk for DR3 gengiver tumorceller mere følsomme over for antimitotics.
Figur 1 : Analyse af DR3 udtryk i forskellige kloner. DR3 udtryk niveauer blev analyseret ved western blotting med anti-FLAG (toppanelet) og beta-actin antistoffer (nederste panel, som en intern kontrol). Forældrenes HT29 celler blev brugt som en negativ kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Morfologi analyse af HT29 og HT29-DR3 celler efter behandling med diazonamide. HT29 (toppanelet) og HT29-DR3 (nederste panel) blev behandlet med 10 nM diazonamide for 48 h. Skala barer = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Dosis-respons-kurver for HT29 og HT29-DR3 celler til diazonamide. Cellernes levedygtighed blev målt efter 48 h af behandling med seriel koncentrationer af diazonamide. Fejllinjer = standardafvigelse (SD) i eksperimentel tre. DA = diazonamide. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript beskriver vi en metode til at generere HT29-DR3 stabil cellelinjer. HT29-DR3 celler indeholder en model for at studere de molekylære mekanismer, hvorved DR3 bidrager til apoptose induceret af antimitotic agenter. Denne tilgang er alsidig og repeterbare. For at sikre succes i proceduren, skal fire vigtigste trin i protokollen overvejes. Først, for at producere en høj nok virus titer, det anbefales at udføre DNA Transfektion når Plat-A celler er på 80-90% confluence. Andet, viral suspensionen bør opbevares ved 4 ° C for ikke længere end 2 uger, er omfattet af lys. For det tredje, når dividere de inficerede celler i 150 mm retter, det anbefales at gøre serielle fortyndinger for at få vel adskilte kolonier, som infektion effektivitet varierer i forskellige celler. Endelig, når picking up en enkelt koloni, bør der ikke være kontaminering med de omkringliggende kolonier.
Denne protokol fungerer godt med de fleste cellelinjer men potentielt kan være vanskeligt for celler, der ikke har en tendens til at danne indre kolonier. I sådanne tilfælde, andre celle-sortering teknikker, såsom antibiotika kombineret med fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS), vil være behov for.
Stabil Transfektion omfatter både virale og ikke-virale metoder. I denne protokol brugte vi en retroviral infektion at generere celler overekspression DR3, ræsonnement, at fysiske metoder, såsom elektroporation, er mere giftigt for celler23 og kemiske metoder, såsom lipid-medieret DNA-Transfektion, har en lav effektivitet i mange celle typer og har potentielle off target effekter24,25,26.
Ektopisk udtryk er en direkte og effektiv måde at belyse genet funktioner. Denne protokol kan derfor bruges til at studere andre målmolekyler. Desuden gen knockdown er også vigtig i funktionelle studier, og det er muligt, at protokollen kan tilpasses gen knockdown systemer. I forhold til andre gen knock-i og knock-out tilgange, såsom CRISPR-Cas9, er protokollen præsenteres her let at anvende og overkommelig for alle laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud 53110000117 (til GW) og 043222019 (til X.W.) fra Tsinghua University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q.
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R.
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
