Summary
يمكن أن يتم إنشاء خط خلية مستقرة overexpressing مورثة اهتمام لدراسة وظيفة الجينات باستنساخ واحدة تعداء-الانتقاء مستقرة بعد ترانسفيكتينج لهم عن طريق العدوى للفيروس. هنا نظهر أن خطوط الخلايا HT29-DR3 التي تم إنشاؤها بهذه الطريقة توضيح الآليات بالموت التي تسهم مستقبلات 3 (DR3) المبرمج المستحثة أنتيميتوتيكس.
Abstract
ويمكن تحقيق دراسة وظيفة الجينات التي تهم عن طريق التلاعب في مستواه في التعبير، مثل تخفيض في التعبير مع خطوط الخلايا ضربة قاضية أو زيادة في التعبير مع خطوط الخلايا أوفيريكسبريشن. تعداء العابرة والمستقرة هي اثنين من الأساليب التي غالباً ما تستخدم للتعبير الجيني خارجية. تعداء عابر يفيد فقط للتعبير قصيرة الأجل، بينما يسمح تعداء مستقرة الجينات الخارجية أن تدمج في جينوم الخلية المضيفة حيث سوف تكون بشكل مستمر وأعرب عن. نتيجة لذلك تعداء مستقرة عادة ما يعمل للبحث في التنظيم الجيني طويلة الأجل. هنا يمكننا وصف بروتوكول بسيط لإنشاء خط خلية مستقرة overexpressing مستقبلات الموت المعلمة 3 (DR3) لاستكشاف الدالة DR3. اخترنا استنساخ واحدة بعد إصابة الفيروس من أجل الحفاظ على التجانس والنقاء من خطوط الخلايا مستقرة. خطوط الخلية المستقرة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول تقديم تفتقر إلى DR3 HT29 الخلايا الحساسة للمخدرات أنتيميتوتيك، وبالتالي إعادة تشكيل الاستجابة أبوبتوتيك في الخلايا HT29. وعلاوة على ذلك، العلامة العلم على DR3 يعوض عن عدم توافر حسن DR3 جسم وتيسر الدراسة البيوكيميائية الآلية الجزيئية التي تحفز وكلاء antimitotic المبرمج.
Introduction
غالباً ما يستخدم التعبير الجيني مغايرة لدراسة وظيفة الجينات للفائدة. طريقتين، تعداء العابرة والمستقرة، وتستخدم سائد في الخلايا، والبيولوجيا الجزيئية لإدراج شريحة من الحمض النووي الريبي أو في خلية مضيف1،2. Transfected عابر الحمض النووي الريبي أو لا يمكن أن تنتقل إلى الخلايا الوليدة، حتى التعديل الوراثي يمكن فقط الاحتفاظ بها لفترة قصيرة من الزمن. من ناحية أخرى، في خلايا transfected ثابت، تتكامل الجينات الخارجية جينوم الخلية المضيفة، إدامة تعبيراً عنه في خط الخلية. وهكذا، تعداء مستقرة هو طريقة التي عادة ما تكون محجوزة للبحث في التنظيم الجيني طويلة الأجل. يمكن أيضا يمكن زرعها خط الخلية مستقرة تكثيفها في نماذج الماوس في فيفو دراسة3. تعداء مستقرة يمكن تقسيمها إلى فئتين: الفيروسية وفاجيناليس. بالمقارنة مع تعداء فاجيناليس، يمكن نقل العدوى الفيروسية الجينات إلى مجموعة أوسع نطاقا من الخلايا البشرية بأعلى كفاءة4،5،،من67. وعلاوة على ذلك، يوفر خط خلية مستقر من نسخة واحدة بميزة التجانس والنقاء الاستنساخ.
نمو الخلايا غير المنضبط والشعبة هي السمات المميزة أكثر من السرطان. في إعدادات السريرية، هي عوامل antimitotic العلاجات الأساسية لأنواع عديدة من الأورام8. ومع ذلك، لا يمكن تجاهل بعض القيود الهامة من وكلاء أنتيميتوتيك. أولاً، هذه تشيموثيرابيس أيضا يمكن أن تقتل الخلايا الطبيعية إلى جانب الخلايا السرطانية غير مرغوب فيها، وهكذا، يمكن أن ينتج آثار جانبية حادة8. ثانيا، لتيوبيولين المخدرات ليست فعالة ضد جميع أنواع الأورام، على الرغم من التعبير توبولين في كل مكان في مجموعة متنوعة واسعة من الأنسجة المختلفة بروتين سيتوسكيليتال9،10. من غير الواضح لماذا وكلاء لتيوبيولين أظهرت فعالية واعدة ضد المبيض، الرئة، وسرطان الدم في العلاج السريري، ولكن ليس في الكلي أو القولون أو سرطان البنكرياس11. أخيرا، حتى المرضى الذين يعانون من نفس النوع من الورم يمكن الاستجابة أنتيميتوتيكس بشكل مختلف بطريقة لا يمكن التنبؤ بها. قد يكون هناك جزيء المستجيب رئيسية التي تؤثر على حساسية مختلف المرضى إلى وكلاء أنتيميتوتيك، أسفر عن نتائج متنوعة في العلاج السريري12. وهكذا، الحساسيات التفاضلية المحتملة من المرضى على العلاج أنتيميتوتيك ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار من أجل تحسين التدخلات العلاجية13.
شاشة مكتبة siRNA الجامع-الجينوم الفائق أثبتت أن DR3 ضربة قاضية يمكن أن يجعل حساسية خلايا مقاومة للعقاقير أنتيميتوتيك، تورط بدور ل DR3 في14من المبرمج الناجمة عن العلاج الكيميائي. كعضو من فوق عائلة مستقبلات (تنفر) عامل نخر الورم، أبلغ DR3 للتوسط في الخلية المبرمج في مختلف نظم15،،،من1617،18. وهكذا، شرعنا في إنشاء خطوط الخلايا مستقرة overexpressing DR3 دراسة الآليات الجزيئية التي تحفز المخدرات antimitotic المبرمج. يمكن أن توفرها نموذج خلية مناسبة لدراسة DR3 overexpression خط خلية سرطان القولون البشرية HT29، الذي وجد أن تفتقر إلى DR3. بالإضافة إلى ذلك، في العيادة، سرطان القولون حساس للأدوية أنتيميتوتيك19.
في هذه المقالة، نحن تصف أسلوب الذي يتيح توليد خط HT29-DR3 خلية مستقرة من خلال الإصابة بالفيروس. كذلك نعرض كيفية التحقق من صحة التعبير DR3 في هذه الخلايا باستخدام النشاف الغربية وكيفية تقييم الحساسية لوكلاء أنتيميتوتيك باستخدام الخلية جدوى الفحص والمراقبة المورفولوجية. الخلايا تتضخم من استنساخ واحدة، وهكذا، تتميز بخلفية الوراثية متجانسة. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح العلامة العلم في DR3 لتصور DR3 الخلوية بالفحص المجهري، وتحليل التفاعل البروتين والتعبير الجيني بالنهج البيوكيميائية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون الخلايا إكسينوجرافتيد في الفئران لمواصلة تحليل تطور الورم ردا على أنتيميتوتيكس في فيفو14.
النظام الخليوي HT29-DR3 المعروضة هنا يوفر أداة فعالة لدراسة الآليات الجزيئية لكيفية أنتيميتوتيكس تقتل خلايا السرطان14. منذ أوفيريكسبريسيون وخطوط الخلية ضربة قاضية أدوات مشتركة لدراسة وظيفة الجينات، هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لجينات أخرى من الفائدة أو خطوط الخلايا الأخرى و، وهكذا تحولت إلى نهج المستخدمة على نطاق واسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يرجى ملاحظة أن جميع التجارب الماوس الموصوفة هنا المعتمدة وتنفيذها وفقا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة تشينغهوا.
1-جيل خطوط الخلايا Overexpression DR3
- بناء بلازميد DR3 التعبير (بمكسس-إيريس-DR3-العلم) عن طريق إدراج كامل طول كدنا DR3 مع 3 × العلم في ج-المحطة إلى ناقل للفيروسات الرجعية بمكسس-إيريس-بلاستيسيدين في مواقع التقييد بامهي/إكسهوي.
- تنمو خلايا بلات-A في الأطباق 60 ملم مع 4 مل من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم). وفي اليوم التالي عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80% إلى 90%، ترانسفيكت الخلايا مع 2 ميكروغرام بلازميد بمكسس-آيريس--DR3-العلم استخدام كاشف تعداء (انظر الجدول للمواد) وفقا للشركة المصنعة يدوي20.
- بعد 72 ساعة، جمع المادة طافية، فيلتراتي وسائل الإعلام باستخدام عامل تصفية معقم 0.45 ميكرومتر، وإبقاء تعليق الفيروسية في الظلام في 4 درجات مئوية.
- تنمو خلايا HT29 في دميم في صحن 60 ملم واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
- وفي اليوم التالي عندما تصل الخلايا إلى التقاء 30-50%، تصيب الخلايا مع 2 مل تعليق الفيروسية حضور 8 ميكروغرام من 1، 5-ثنائي ميثيل-1، 5-ديازاونديكاميثيليني بوليميثوبروميدي في المليلتر من تعليق الفيروسية. بعد 4-6 ح الحضانة عند 37 درجة مئوية، نضح تعليق الفيروسية وإضافة 4 مل دميم الطازجة، والعودة الطبق إلى الحاضنة.
- تجاهل وسائل الإعلام من بوستينفيكتيون ح 24 الأطباق وتغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني بريوارميد بعناية. إضافة 1 مل من التربسين أدتا إلى الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- وبعد مراقبة تحت مجهر بتكبير X 10 أن فصل معظم الخلايا، وقف تريبسينيزيشن مع 2 مل من دميم كاملة تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS). جمع تعليق خلية في أنبوب 15 مل والطرد المركزي الخلايا في 200 x غ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل دميم. مزيج جيد من قبل بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً. تمييع الخلايا بعوامل من 30 و 100 و 300. بذور الخلايا في أطباق 150 مم مع 20 مل دميم التي تحتوي على 1 ميكروغرام/مل بلاستيسيدين. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ~ 1-2 أسابيع.
- وخلال هذه الفترة، مراقبة المستعمرات كل يوم مع مجهر مقلوب في 10 X التكبير. علامة المستعمرات المعزولة جيدا في الجزء السفلي من الطبق عندما يكون القطر مستعمرة حوالي 1-2 مم.
- نضح المتوسطة وغسل الخلايا مع 3 مل من برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً. إضافة 2 ملليلتر من التربسين-يدتا في صحن 60 ملم. استخدام الملقط المعقم لالتقاط يعقم اسطوانات الاستنساخ العقيمة، ووضعها في الطبق 60 ملم. التقاط الاسطوانات التي تحتوي على التربسين-يدتا ووضعها بلطف على المستعمرات ملحوظ. تأكد من أن كل اسطوانة الاستنساخ فقط يحتوي على مستعمرة واحدة، وتجنب التلوث مع المستعمرات القريبة.
- العودة الطبق إلى الحاضنة لمدة 3 دقائق.
- وبعد 3 دقائق، فحص الخلايا تحت المجهر بتكبير X 10 لترى ما إذا كانت فصل. عندما قد رفعت الخلايا، إضافة ميكروليتر 70 من الثقافة المتوسطة لكل اسطوانة لإلغاء تنشيط التربسين. مزيج تعليق خلية بلطف مع 200 ميكروليتر ماصة. تأكد من عدم تحريك الاسطوانة أثناء هذه العملية.
- نقل تعليق خلية من كل مستعمرة لاثنين 24-جيدا لوحات تحتوي على 1 مل دميم في البئر. إضافة 30 ميكروليتر من تعليق الخلية الواحدة وكذلك في لوحة أ وميكروليتر 70 في المقابل الآبار في لوحة التسمية ب اللوحات بشكل صحيح ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.
2. تحقق خط خلية Overexpression DR3
- عندما تكون الخلايا الموجودة في لوحة ب في التقاء 90%، قم بإزالة الوسائط وتغسل بعناية الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. تماما إزالة برنامج تلفزيوني والخلايا مع 50 ميكروليتر من 1 × تحميل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المخزن المؤقت. نقل ليساتيس الخلية من لوحة 24-جيدا إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي ويغلي عينات لمدة 10 دقائق عند 100 درجة مئوية.
- تشغيل العينات على الصوديوم 10% دوديسيل كبريتات (SDS) جل في جهد مستمر من 80 الخامس لمدة 15 دقيقة، ومن ثم، في 120 الخامس ح 1.
- نقل البروتين إلى غشاء فلوريد (PVDF) الفينيليدن بنقل الرطب في تيار مستمر من 400 mA ح 2.
- اختبار تعبير DR3 في النسخ المختلفة مع العلم المضادة الأجسام المضادة، باستخدام الخلايا HT29 البرية من نوع كعنصر سلبي (الشكل 1). تضعف جسم الأولية بعامل 5,000 في 5% الحليب الخالي أن يتم حله في تبست (تريس مخزنة المالحة التي تحتوي على 0.1% توين-20). احتضان الغشاء مع العلم جسم عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- يغسل الغشاء مع تبسة بالهز على شاكر ديكولورينج 200 لفة في الدقيقة في تحديث الرايت تبسة كل 5 دقائق لمجموعة الغسيل وقت لمدة 15 دقيقة.
- احتضان الغشاء مع الماوس المضادة جسم الثانوي المخفف بعامل 10,000 في 5% الحليب الخالي في 4 درجات مئوية عن ح 5-6.
- يغسل الغشاء مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 2، 5.
- الكشف عن علم التعبير باستخدام الركيزة تشيميلومينيسسينسي الغربية المعززة (القامة) وصورة الغشاء مع نظام توثيق هلام (انظر الجدول للمواد). تحديد المستنسخين معربا عن DR3 كاستنساخ إيجابية.
- نقل الحيوانات المستنسخة في لوحة A التي تتوافق مع الحيوانات المستنسخة الإيجابية في لوحة ب لوح 6-جيدا والاستمرار في تضخيم الخلايا حتى تنمو لهم في أطباق 10 سم. جعل الأرصدة المجمدة من الخلايا تنمو من استنساخ إيجابية وتخزينها في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
3-تقييم Apoptotic استجابة الخلايا لوكلاء أنتيميتوتيك
ملاحظة: ديازوناميدي هو فئة جديدة من المنتجات الطبيعية البحرية له نشاط ملحوظ في تثبيط نمو الخلايا السرطان، الذي يعكس أخرى عوامل زعزعة الاستقرار توبولين21. ومع ذلك، أسلوب العمل لا يزال غير واضح. لاختبار استجابة الخلايا الخلوية لوكلاء أنتيميتوتيك، واستخدمت باكليتاكسيل وديازوناميدي لعلاج البرية من نوع HT29 الخلايا والخلايا HT29-DR3. المخدرات تم حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) لجعل الأرصدة 10 ملم، وثم، كذلك تضعف بتركيزات مختلفة: 30 نانومتر، 100 نانومتر، 300 نانومتر، 1,000 شمال البحر الأبيض المتوسط، 3,000 شمال البحر الأبيض المتوسط، و 000 10 نانومتر في [دمس].
- جمع الخلايا HT29 و HT29-DR3 تريبسينيزيشن. قياس كثافة الخلية استخدام عداد تلقائي خلية. ثم البذور الخلايا في لوحات 12-جيدا في دميم في كثافة 3 × 104 خلايا كل بئر. إضافة 10 نانومتر ديازوناميدي في اليوم التالي، واستخدام [دمس] 1% كعنصر سلبي. بعد 48 ساعة علاج، صورة الخلايا تحت مجهر بتكبير X 10 (الشكل 2).
- البذور HT29 و HT29-DR3 الخلايا في لوحات 96-جيدا في دميم في كثافة الخلايا 3 × 103 كل بئر والسماح لهم بالنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. ثم قم بإضافة جرعة تصاعد تركيزات ديازوناميدي 0.3 نانومتر، 1 نانومتر، 3 نانومتر، 10 نانومتر، 30 نانومتر، و 100 نانومتر لكل بئر، استخدام 1% [دمس] كعنصر سلبي.
- بعد 48 ساعة علاج، قياس صلاحية الخلية استخدام عدة فحص صلاحية خلية على أساس التﻷلؤ وفقا للدليل الخاص بالشركة المصنعة.
- إخراج لوحة 96-جيدا من الحاضنة والسماح لها الوقوف على RT لحوالي 30 دقيقة. ثم إضافة 50 ميليلتر من الكواشف المقايسة لكل بئر، اهتز اللوحة على RT لمدة 2 دقيقة الخلايا، واحتضان اللوحة على RT للحد الأدنى 10 آخر يحدد التﻷلؤ من كل بئر باستخدام قارئ ميكروسكوبية (الشكل 3).
ملاحظة: صلاحية خلية يمثل كثافة التﻷلؤ النسبي لكل جيدا إلى أن تحكم معاملة جيدة مع [دمس] 1%.
- إخراج لوحة 96-جيدا من الحاضنة والسماح لها الوقوف على RT لحوالي 30 دقيقة. ثم إضافة 50 ميليلتر من الكواشف المقايسة لكل بئر، اهتز اللوحة على RT لمدة 2 دقيقة الخلايا، واحتضان اللوحة على RT للحد الأدنى 10 آخر يحدد التﻷلؤ من كل بئر باستخدام قارئ ميكروسكوبية (الشكل 3).
- استخدام الفئران عارية بالب/ج أنثى عمرها ستة أسابيع في فيفو دراسة14.
ملاحظة: تم الإبقاء على الفئران تحت شروط معينة خالية من مسببات الأمراض.- تريبسينيزي HT29 و HT29-DR3 خلية، ومن ثم قم بإيقاف تريبسينيزيشن استخدام دميم بريوارميد عند 37 درجة مئوية. جمع تعليق خلية في أنبوب 50 مل والطرد المركزي الخلايا 1,000 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في الرايت تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط دميم دون FBS. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى وريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني.
- عد الخلايا باستخدام عداد خلية تلقائياً وتمييع الخلايا بتركيز 2.5 × 107 خلايا/مل باستخدام برنامج تلفزيوني. توليد الأورام عن طريق حقنه تحت الجلد من 200 ميكروليتر من تعليق خلية HT29 أو HT29-DR3 في الجناح الأيسر من كل الماوس (5 × 106 خلايا/الماوس)22.
- قياس حجم الورم (التلفزيون) باستخدام الفرجار كل 2 (د) بعد زرع الأعضاء. حساب التلفزيون باستخدام الصيغة التالية: تلفزيون = 1/2 لتر x العرض x العمق x العرض x العمق (هنا، عرض ورم w: l: طول الورم). عندما يصل حجم الورم متوسط حوالي 100 مم3، بطريقة عشوائية الفئران إلى عنصر التحكم أو مجموعة المعالجة (n = 6 كل مجموعة)، والبدء في العلاج.
- إعداد الحل باكليتاكسيل على النحو التالي. أولاً، حل باكليتاكسيل تماما في الإيثانول في 5% الحجم الإجمالي، وثم إضافة زيت الخروع 5% الحجم النهائي بوليوكسيل 35 مهدرج. وأخيراً، يشكلون 90 في المائة المتبقية من وحدة التخزين مع D5W (5% سكر العنب في الماء، ودرجة الحموضة 7.4).
- حقن باكليتاكسيل عن طريق الوريد في جرعة 20 ملغ/كغ 3 x أسبوعيا لمدة أسبوعين. قياس ورم في حجم ووزن الجسم 3 × أسبوع14. إنهاء التجربة و euthanize الحيوانات إذا كان إنقاص وزن الجسم بمقدار 20% أو حجم الورم تصل إلى حوالي 2,000 مم3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد وصف للخلايا HT29 ستابلي الإعراب عن DR3 في الشكل 1. المستنسخين التعبير عن مستويات متفاوتة من DR3، بينما لا تظهر الخلايا البرية من نوع، والتي تكون بمثابة عنصر سلبي، التعبير الجيني خارجية. هنا نعرض فقط استنساخ خمسة، منها استنساخ 1 و 5 التعبير عن أعلى مستوى ل DR3. لقد اخترنا استنساخ 1 و 5 للتجارب التالية.
ولاحظ مورفولوجيا الخلايا HT29 و HT29-DR3 بعد إقامة ديازوناميدي مجهر مقلوب في 10 X التكبير في الشكل 2. بعد علاج ح 48 مع 10 نانومتر ديازوناميدي، HT29-DR3 أظهرت المبرمج واضحة، مع كسر غشاء الخلية والخلية الحطام (أسفل اللوحة). ومع ذلك، أظهرت HT29 فقط اعتقال الانقسامية مع خلايا سليمة نستعرض شكل خلية مجمله (اللوحة العلوية).
صلاحية خلية من الخلايا HT29 و HT29-DR3 بعد العلاج مع ديازوناميدي ويرد في الشكل 3. بعد 48 ساعة معاملة مع 3 ديازوناميدي شمال البحر الأبيض المتوسط، ما يزيد على 80% موت الخلية عثر عليها في HT29-DR3 الخلايا (المنحنى الأحمر). بيد أن الخلايا HT29 الأبوية أظهرت استجابة طفيفة فقط إلى ديازوناميدي في شكل اعتقال الانقسامية (المنحنى الأزرق). وهكذا، أعيد overexpression DR3 في مسار apoptotic الناجمة عن ديازوناميدي في هذه الخلايا.
وقد أظهرت النتائج للتجارب إكسينوجرافت ورم في فيفو في ورقة سابقة14. نسبة نجاح غرس الورم HT29 و HT29-DR3 هو 100%. الأورام إكسينوجرافت تقدما كذلك في مراقبة المركبات؛ ومع ذلك، عرض تكثيفها HT29-DR3 الانحدار الورم أسرع من تكثيفها HT29 عندما تعامل مع باكليتاكسيل بجرعة 20 ملغ/كغ. ملاحظتنا للاستجابة بصورة أفضل للأورام HT29-DR3 باكليتاكسيل عن HT29 الأورام في فيفو أكد كذلك أن تعبير حمل خارج الرحم من DR3 يجعل الخلايا السرطانية أكثر حساسية أنتيميتوتيكس.
الشكل 1 : تحليل التعبير DR3 في استنساخ مختلف. تم تحليل مستويات التعبير DR3 من النشاف الغربية مع العلم المضادة (اللوحة العلوية) والأجسام المضادة بيتا-أكتين (اللوحة السفلية، كرقابة داخلية). واستخدمت كعنصر سلبي الأبوية HT29 الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحليل مورفولوجيا الخلايا HT29 و HT29-DR3 بعد العلاج مع ديازوناميدي- HT29 (أعلى اللوحة) ويعاملون HT29-DR3 (أسفل اللوحة) مع 10 ديازوناميدي شمال البحر الأبيض المتوسط ح 48. أشرطة مقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : منحنيات الاستجابة للجرعة من الخلايا HT29 و HT29-DR3 إلى ديازوناميدي- وتم قياس جدوى الخلية بعد 48 ساعة معاملة مع تركيزات المسلسل من ديازوناميدي. أشرطة الخطأ = الانحراف المعياري (SD) من تريبليكاتيس التجريبية. دا = ديازوناميدي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المخطوطة، يصف لنا طريقة لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة HT29-DR3. الخلايا HT29-DR3 توفر نموذجا لدراسة الآليات الجزيئية التي يساهم DR3 المبرمج الناجمة عن عوامل أنتيميتوتيك. وهذا النهج مرنة وقابلة للتكرار. لضمان نجاح هذا الإجراء، يلزم أربع خطوات رئيسية للبروتوكول بالنظر فيها. أولاً، من أجل إنتاج عالية كافية عيار الفيروس، ينصح بأداء تعداء الحمض النووي عندما تكون الخلايا بلات-A في التقاء 80% إلى 90%. وثانيا، يجب تخزين تعليق الفيروسية عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد على أسبوعين، وتغطي من الضوء. ثالثا، عند تقسيم الخلايا المصابة إلى 150 مم الأطباق، من المستحسن القيام بتخفيف المسلسل للحصول على مستعمرات جيدا المنفصلين عن ذويهم، كما تختلف كفاءة العدوى في خلايا مختلفة. وأخيراً، عند التقاط مستعمرة واحدة، لا ينبغي وجود أي تلوث مع المستعمرات المحيطة بها.
هذا البروتوكول يعمل جيدا مع معظم خطوط الخلايا ولكن يمكن أن يكون أمرا عسيرا للخلايا التي لا تميل إلى تشكيل مستعمرات واحدة. وفي مثل هذه الحالات، ستكون هناك حاجة أخرى تقنيات الفرز الخلية، مثل المضادات الحيوية جنبا إلى جنب مع تنشيط fluorescence الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)،.
تعداء مستقر يتضمن أساليب فيروسية وغير فيروسية على حد سواء. في هذا البروتوكول، استخدمنا عدوى فيروسات النسخ العكسي لتوليد الخلايا overexpressing DR3، متعللة بأن الوسائل المادية، مثل انهانسر، أكثر سمية للخلايا أساليب23 والكيميائية، مثل تعداء الحمض الدهني بوساطة، ومستوى منخفض الكفاءة في العديد من أنواع الخلايا والمحتملة الآثار خارج الهدف24،،من2526.
التعبير حمل خارج الرحم وسيلة مباشرة وفعالة لتوضيح وظائف الجينات. ولذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الجزيئات المستهدفة الأخرى. وعلاوة على ذلك، ضربة قاضية الجينات مهم أيضا في الدراسات الفنية، ومن الممكن أن البروتوكول يمكن تكييفها وفقا لأنظمة الجينات ضربة قاضية. الجينات طريقة الكبس والمغلوب النهج الأخرى، مثل كريسبر-Cas9، بالمقارنة مع البروتوكول المعروضة هنا سهلة التطبيق وبأسعار معقولة لجميع المختبرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بإعلان.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل منح 53110000117 (إلى غيغاواط) و 043222019 (إلى X.W.) من جامعة تشينغهوا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q.
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R.
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
