Summary
Om upprättande av en stabil cellinje överuttryck av en gen av intresse att studera geners funktion kan göras genom stabila transfection-plockning enstaka kloner efter transfecting dem via retrovirala infektion. Här visar vi att HT29-DR3 cellinjer som genereras på detta sätt belysa de mekanismer genom vilka död receptor 3 (DR3) bidrar till antimitotics-inducerad apoptos.
Abstract
Studera funktionen av en gen av intresse kan uppnås genom att manipulera sin nivå till uttryck, såsom minska sitt uttryck med knockdown cellinjer eller öka sitt uttryck med överuttryck cellinjer. Övergående och stabil transfection är två metoder som ofta används för exogena genuttryck. Övergående transfection är endast användbar för kortsiktiga uttryck, medan stabil transfection tillåter exogena gener ska integreras i den mottagande cell arvsmassan där det kontinuerligt kommer att uttryckas. Därför används vanligen stabil transfection för forskning i långsiktiga genetiska regleringen. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att generera en stabil cellinje överuttryck märkta död receptor 3 (DR3) att utforska DR3 funktion. Vi plockade enda kloner efter en retrovirala infektion för att upprätthålla den homogenitet och renhet av stabil cellinjer. De stabila cellinjer som genereras med hjälp av detta protokoll återges DR3-brist HT29 celler känsliga för Mitoshämmande läkemedel, således beredning apoptotiska svaret i HT29 celler. Dessutom flagga etiketten på DR3 kompenserar för avsaknaden av bra DR3 antikropp och underlättar biokemiska studier av den molekylära mekanismen genom vilken Mitoshämmande agenter inducera apoptos.
Introduction
Heterologa genuttryck är ofta anställd att studera funktionen hos gener av intresse. Två metoder, övergående och stabil transfection, används huvudsakligen i celler och molekylärbiologi för att infoga ett segment av DNA eller RNA i en mottagande cell1,2. Övergående transfekterade DNA eller RNA kan inte överföras till dotterceller, så den genetiska förändringen kan endast bevaras under en kort tid. Däremot, i stabilt transfekterade celler, är exogena gener integrerade i mottagande cell genomet, upprätthålla sitt uttryck i cellinje. Stabil transfection är alltså en metod som är vanligtvis reserverad för forskning om långsiktiga genetiska regleringen. Den stabila cellinje kan också transplanteras som xenograft i musmodeller för in vivo studie3. Stabil transfection kan delas in i två kategorier: virus- och nonviral. Jämfört med nonviral transfection, kan virusinfektion överföra gener till ett bredare utbud av mänskliga celler med en högre effektivitet4,5,6,7. Dessutom erbjuder en stabil cellinje från en enda klon fördelen av homogenitet och klonal renhet.
Okontrollerad celltillväxt och delning är de mest utmärkande dragen av cancer. I kliniska inställningar är Mitoshämmande agenter de primära behandlingarna för många typer av tumörer8. Dock kan inte vissa betydande begränsningar av Mitoshämmande agenter ignoreras. Första dessa kemoterapier kan också döda normala celler tillsammans med oönskad cancerceller, och således kan resultera i allvarliga biverkningar8. Andra, antitubulin läkemedel är inte effektiva mot alla typer av tumörer, trots tubulin's allestädes närvarande uttryck i en mängd olika vävnader som ett cytoskeletal protein9,10. Det är oklart varför antitubulin agenter visade lovande effekt mot äggstockscancer, lungcancer och hematologiska cancerformer i klinisk behandling, men inte i njure, kolon eller pankreas cancer11. Slutligen kan även patienter med samma typ av tumör svarar att antimitotics olika på ett oförutsägbart sätt. Det kan finnas en nyckel effektor-molekyl som påverkar känsligheten hos olika patienter till Mitoshämmande ombud, vilket resulterar i varierande resultaten ses i klinisk behandling12. Således, de potentiella differentiell känslighet av patienter till Mitoshämmande behandling bör beaktas för att optimera terapeutiska interventioner13.
En hög genomströmning helgenom-siRNA bibliotek skärm visade att DR3 knockdown kunde återge ljuskänsliga celler resistenta mot Mitoshämmande läkemedel, ifrågasätta en roll för DR3 i kemoterapi-inducerad apoptos14. Som medlem av tumörnekrosfaktor receptor (TNFR) superfamiljen har DR3 rapporterats att medla cell apoptos i olika system15,16,17,18. Således anges vi för att upprätta stabila cellinjer överuttryck DR3 för att studera molekylära mekanismer genom vilka Mitoshämmande läkemedel inducerar apoptos. En cell lämplig modell för att studera DR3 överuttryck kan tillhandahållas av den mänskliga kolon cancer cell linjen HT29, som befanns vara DR3-brist. Dessutom i kliniken, kolon cancer är okänsliga för Mitoshämmande läkemedel19.
I den här artikeln beskriver vi en metod som möjliggör generering av en HT29-DR3 stabil cellinje genom retrovirala infektion. Vidare visar vi hur du validera DR3 uttrycket i dessa celler med western blotting och att bedöma känsligheten för Mitoshämmande agenter med hjälp av en cell lönsamhet analysen och morfologiska observation. Celler förökas från enda kloner och därmed har fördelen av en homogen genetiska bakgrund. Dessutom tillåts taggen flagga på DR3 för visualisering av cellulära DR3 av mikroskopi och analys av gen uttryck och protein interaktion genom biokemiska metoder. Cellerna kan dessutom vara xenografted hos möss att ytterligare analysera tumör progression som svar på antimitotics i vivo14.
HT29-DR3 cellen systemet presenteras här erbjöd ett effektivt verktyg för att studera molekylära mekanismer för hur antimitotics döda cancer celler14. Eftersom överuttryck och knockdown cellinjer är gemensamma verktyg för att studera geners funktion, kan detta protokoll enkelt anpassas efter andra gener av intresse eller andra cellinjer och, således, förvandlas till ett flitigt använt tillvägagångssätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Observera att alla de mus experiment som beskrivs här godkändes och utförs i enlighet med de institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Tsinghua University.
1. generering av DR3 överuttryck cellinjer
- Konstruera plasmiden för DR3 uttryck (pMXs-IRES-DR3-flaggan) genom att infoga fullängds DR3 cDNA med 3 x flagga på C-terminus in retrovirala vektor pMXs-IRES-Blasticidin vid platserna som begränsning av BamHI/XhoI.
- Odla Plat-A cellerna i 60 mm rätter med 4 mL Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM). Nästa dag, när cellerna når 80% - 90% sammanflödet, transfect cellerna med 2 μg av Plasmiden pMXs-IRES-DR3-flaggan med transfection reagens (se Tabell för material) enligt tillverkarens manuell20.
- Efter 72 h, samla supernatanten, filtratet media med 0,45 μm sterila filter och hålla viral suspensionen i mörker vid 4 ° C.
- Växa HT29 celler DMEM i en 60 mm maträtt och inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2.
- Nästa dag, när cellerna når 30% - 50% sammanflödet, infektera cellerna med 2 mL viral suspension i närvaro av 8 μg av 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide per milliliter av viral suspension. Efter 4-6 h inkubation vid 37 ° C, aspirera viral fjädringen, tillsätt 4 mL färsk DMEM och återgå skålen till inkubatorn.
- Ignorera media från den rätter 24 h angripen och noggrant tvätta cellerna med 2 mL förvärmd PBS. Tillsätt 1 mL av trypsin-EDTA till cellerna och inkubera vid 37 ° C i 3 min.
- Efter att ha konstaterat i Mikroskop vid 10 X förstoring som de flesta av cellerna har lossnat, stoppa trypsinization med 2 mL av komplett DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS). Samla cellsuspensionen i en 15 mL rör och centrifugera cellerna vid 200 x g under 5 minuter i rumstemperatur (RT).
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 mL DMEM. Blanda väl genom pipettering försiktigt upp och ner. Späd cellerna av faktorer av 30, 100 och 300. Utsäde cellerna i 150 mm rätter med 20 mL DMEM innehållande 1 µg/mL blasticidin. Inkubera vid en 37 ° C inkubator med 5% CO2 ~ 1-2 veckor.
- Under denna period, Observera kolonierna varje dag med ett inverterat Mikroskop vid 10 X förstoring. Markera de välisolerade kolonierna på botten av skålen när kolonin diameter är ca 1-2 mm.
- Sug ut mediet och tvätta cellerna med 3 mL före värmde PBS. Lägg till 2 milliliter av trypsin-EDTA i en 60 mm maträtt. Använd steril pincett för att plocka upp Ånghärdad sterila kloning cylindrar, och placera dem i 60 mm skålen. Plocka upp cylindrarna som innehåller trypsin-EDTA och försiktigt placera dem över markerade kolonierna. Kontrollera varje kloning cylinder endast innehåller en koloni och undvika kontaminering med närliggande kolonier.
- Återgå skålen till inkubatorn i 3 minuter.
- Efter 3 min, kolla cellerna under lupp med 10 X förstoring att se om de har lossnat. När cellerna har lyfts, tillsätt 70 μL av odlingsmedium varje cylinder att inaktivera trypsin. Blanda försiktigt cellsuspension med 200 μL pipett. Se till att inte flytta cylindern under denna process.
- Överföra cellsuspensionen från varje koloni till två 24 brunnar innehållande 1 mL DMEM per brunn. Tillsätt 30 μl cellsuspension per brunn i plattan A och 70 μl i motsvarande brunnar i plattan B. etikett plattorna ordentligt och sätta dem i inkubatorn.
2. kontroll av den DR3 överuttryck cellinje
- När cellerna i plattan B är på 90% confluence, ta bort materialet och noggrant tvätta cellerna med 1 mL PBS. Helt ta bort PBS och lysera cellerna med 50 μL 1 x SDS-PAGE lastning buffert. Överför den cell lysates från 24-väl plattan till 1,5 mL centrifugrör och koka proverna under 10 minuter vid 100 ° C.
- Kör exemplen på 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) gel vid en konstant spänning på 80 V för 15 min och sedan, vid 120 V för 1 h.
- Överföra proteinet till en polyvinylidene fluor (PVDF) membran genom våta överföring på en konstant ström av 400 mA för 2 h.
- Testa DR3 uttrycket i olika kloner med anti-Flag antikropp, med vildtyp HT29 cellerna som en negativ kontroll (figur 1). Späd den primär antikroppen med en faktor på 5 000 i 5% nonfat mjölk som löses upp i TBST (Tris-buffrad koksaltlösning innehållande 0,1% Tween-20). Inkubera membranet med flaggan antikropp vid 4 ° C över natten.
- Tvätta membranet med TBST genom att skaka det på en decoloring shaker på 200 rpm vid RT. uppdatera TBST var 5 minut totalt tvätt-tid på 15 min.
- Inkubera membranet med sekundära antimus-antikropp utspädd med en faktor på 10 000 i 5% nonfat mjölk vid 4 ° C för 5-6 h.
- Tvätta membranet igen som beskrivs i steg 2.5.
- Upptäcka flagga uttrycket använder västra förbättrade chemiluminescence (ECL) substrat och bild membranet med en geldokumentationssystem (se Tabell för material). Identifiera de kloner som uttrycker DR3 som positiva kloner.
- Överföra de kloner i plattan A som motsvarar positiva kloner i plattan B till en 6-well platta och fortsätta att förstärka cellerna tills växer dem i 10 cm rätter. Göra fryst lager av cellerna växer från positiva kloner och lagra dem vid-80 ° C för framtida bruk.
3. bedömning av apoptotiska celler Mitoshämmande agenter
Obs: Diazonamide är en ny klass av Marina naturprodukt som har märkliga aktivitet i att hämma cancer celltillväxt, vilket speglar andra tubulin-destabiliserande agenter21. Dess verkningsmekanism är dock fortfarande oklart. För att testa celler cellulära svar Mitoshämmande agenter, användes paklitaxel och diazonamide att behandla vildtyps-HT29 och HT29-DR3 celler. Drogerna var löses i dimetyl sulfoxid (DMSO) att göra 10 mM lager och sedan spädas vidare till olika koncentrationer: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1000 nM, 3.000 nM och 10.000 nM i DMSO.
- Samla HT29 och HT29-DR3 celler genom trypsinization. Mäta cell densiteten med en automatisk cell räknare. Sedan, utsäde cellerna i 12-väl plattorna i DMEM vid en densitet på 3 x 104 celler per brunn. Nästa dag, lägga till 10 nM diazonamide och använda 1% DMSO som en negativ kontroll. Efter 48 h behandling, image cellerna i Mikroskop vid 10 X förstoring (figur 2).
- Frö HT29 och HT29-DR3 celler i 96 brunnar plattorna i DMEM vid en densitet på 3 x 103 celler per brunn och tillåta dem att växa över natten vid 37 ° C. Lägg sedan till dos-eskalerande diazonamide koncentrationer av 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM och 100 nM för varje brunn, använda 1% DMSO som en negativ kontroll.
- Efter 48 h behandling, mäta den cellviabilitet som använder en luminescence-baserade cell livskraft analyssats enligt tillverkarens bruksanvisning.
- Ta ut plattan med 96 brunnar från inkubatorn och låt den stå på RT i ca 30 min. Lägg sedan till 50 µL analysreagenser i varje brunn, skaka plattan på RT för 2 min att lysera celler, och inkubera plattan på RT för en annan 10 min. bestämma Luminiscens för varje brunn med en microplate reader (figur 3).
Notera: Cellviabiliteten representerar relativa luminiscens intensiteten av varje väl till som kontrollen väl behandlade med 1% DMSO.
- Ta ut plattan med 96 brunnar från inkubatorn och låt den stå på RT i ca 30 min. Lägg sedan till 50 µL analysreagenser i varje brunn, skaka plattan på RT för 2 min att lysera celler, och inkubera plattan på RT för en annan 10 min. bestämma Luminiscens för varje brunn med en microplate reader (figur 3).
- Använd sex veckor gamla kvinnliga BALB/c naken möss för en-14 i vivo studie.
Obs: Möss kvarstod särskilda villkor patogenfria.- Trypsinize HT29 och HT29-DR3 cell och, sedan stoppa den trypsinization som använder DMEM föruppvärmd vid 37 ° C. Samla in cellsuspensionen i en 50 mL tub och centrifugera cellerna vid 1000 rpm i 10 min på RT. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i DMEM medium utan FBS. Centrifugera cellerna igen och återsuspendera cellpelleten i PBS.
- Räkna cellerna med en automatisk cell räknare och späd cellerna till en koncentration av 2,5 x 107 celler/mL med PBS. Generera tumörer genom en subkutan injektion med 200 μL av HT29 eller HT29-DR3 cellsuspensionen i den högra flanken av varje mus (5 x 106 celler/mus)22.
- Mät volymen tumör (TV) använda bromsok varje 2 d efter transplantation. Beräkna TV: N med hjälp av följande formel: TV = 1 / 2L x b x B (här, W: tumör bredd, L: tumör längd). När den genomsnittliga tumör volymen når cirka 100 mm3, Slumpa möss till antingen kontroll eller den behandlade gruppen (n = 6 per grupp) och inleda behandling.
- Bered den paklitaxel som följer. Först, upplösa paklitaxel helt i etanol 5% av den totala volymen och sedan lägga till 5% av den slutliga volymen av polyoxol 35 hydrerad ricinolja. Slutligen, utgör de resterande 90% av volymen med D5W (5% dextros i vatten, pH 7,4).
- Injicera paklitaxel intravenöst i en dos på 20 mg/kg 3 x per vecka i två veckor. Mäta den tumör volym och kroppsvikt 3 x en vecka14. Avsluta experimentet och euthanize djuren om kroppsvikten minskar med 20% eller tumör volym når ca 2000 mm3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En karakterisering av HT29 celler som stabilt uttrycker DR3 visas i figur 1. Klonerna express varierande nivåer av DR3, medan vildtyps-cellerna, som utgöra en negativ kontroll, inte visar exogena genuttryck. Här visar vi endast fem kloner, bland vilka klon 1 och 5 express högsta DR3. Vi valde klon 1 och 5 för följande experiment.
Morfologi av HT29 och HT29-DR3 celler efter administrering av diazonamide observerades av en inverterade Mikroskop vid 10 X förstoring i figur 2. Efter 48 h behandling med 10 nM diazonamide visade HT29-DR3 uppenbara apoptos, med trasiga cellmembran och cellfragment (nedre panelen). HT29 visade dock endast mitotiska gripandet med intakta celler uppvisar en runda upp cell form (övre panelen).
HT29 och HT29-DR3 celler efter behandling med diazonamide visas i figur 3cell livskraft. Efter 48 h behandling med 3 nM diazonamide, över 80% celldöd hittades i HT29-DR3 celler (röd kurva). Föräldrarnas HT29 cellerna visade dock endast en liten reaktion på diazonamide i form av mitotiska gripandet (blå kurva). Således ombildade överuttryck av DR3 diazonamide-inducerad apoptotiska vägen i dessa celler.
Resultaten för xenografts i vivo tumör experiment har visat i en tidigare papper14. Andelen framgångsrika tumör implantation för både HT29 och HT29-DR3 är 100%. Xenograft tumörer utvecklats på samma sätt i kontrollen fordon; de HT29-DR3 xenograft visas dock snabbare tumörregression än de HT29 xenograft när de behandlades med paklitaxel vid en dos på 20 mg/kg. Vår observation av ett bättre svar av HT29-DR3 tumörer paklitaxel än för HT29 tumörer i vivo bekräftat att ektopisk uttryck för DR3 gör tumörcellerna mer känsliga för antimitotics.
Figur 1 : Analys av DR3 uttryck i olika kloner. Dr3 uttrycksnivåerna analyserades av western blotting med anti-Flag (övre panelen) och anti-beta-aktin antikroppar (nedre panelen, som intern kontroll). Föräldrarnas HT29 celler användes som en negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Morfologi analys av HT29 och HT29-DR3 celler efter behandling med diazonamide. HT29 (övre panelen) och HT29-DR3 (nedre panelen) behandlades med 10 nM diazonamide för 48 h. Skala barer = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Dos-responskurvor för HT29 och HT29-DR3 celler till diazonamide. Cellernas viabilitet mättes efter 48 h behandling med seriell koncentrationer av diazonamide. Felstaplar = standardavvikelsen (SD) för experimentell exemplar. DA = diazonamide. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript beskriver vi en metod för att generera HT29-DR3 stabil cellinjer. HT29-DR3 celler ger en modell för att studera molekylära mekanismer genom vilka DR3 bidrar till apoptos induceras av Mitoshämmande agenter. Detta synsätt är mångsidig och repeterbar. För att säkerställa framgången för förfarandet, behöver fyra viktiga steg i protokollet beaktas. Först, för att producera en hög nog virus titer, det rekommenderas att utföra DNA transfection när Plat-A cellerna är på 80-90% confluence. Andra ska virala suspensionen förvaras vid 4 ° C för längre än 2 veckor, omfattas från ljus. För det tredje, när att dela de infektera cellerna i 150 mm rätter, rekommenderas att göra seriespädningar för att få väl separerade kolonier, som infektion effektivitet varierar i olika celler. Slutligen, när du plockar upp en enda koloni, det bör inte vara all kontaminering med omgivande kolonierna.
Detta protokoll fungerar bra med de flesta cellinjer men kan vara svårt för celler som inte tenderar att bilda enstaka kolonier. I sådana fall kommer andra cell-sortering tekniker, såsom antibiotika i kombination med fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS), att behövas.
Stabil transfection innehåller både virus- och icke-virala metoder. I detta protokoll använde vi en retrovirala infektion att generera celler överuttryck DR3, resonemang att fysiska metoder, såsom elektroporation, är mer giftigt för celler23 och kemiska metoder, såsom lipid-medierad DNA-transfection, har en låg effektivitet i många cell typer och har potentiella off-target effekter24,25,26.
Ektopisk uttryck är ett direkt och effektivt sätt att belysa gen funktioner. Detta protokoll kan därför användas för att studera andra målmolekyler. Dessutom gen knockdown är också viktigt i funktionella studier, och det är möjligt att protokollet kan anpassas till genen knockdown system. Det protokoll som presenteras här jämfört med andra gen inpressning och knock-out tillvägagångssätt, såsom CRISPR-Cas9, och är lätt att applicera och överkomligt för alla laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag 53110000117 (att G.W.) och 043222019 (till WX) från Tsinghua University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q.
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R.
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
