Summary
Estableciendo una línea estable de células overexpressing un gen de interés para el estudio de funciones de los genes puede hacerse estables recogida de transfección clones solo después de la transferencia de ellos a través de la infección retroviral. Aquí mostramos que las líneas de celulares HT29-DR3 generadas de esta manera dilucidar los mecanismos por el cual la muerte receptor 3 (DR3) contribuye a la apoptosis inducida por antimitotics.
Abstract
Estudiar la función de un gen de interés se logra mediante la manipulación de su nivel de expresión, como su expresión con líneas celulares de sobreexpresión de aumentando o disminuyendo su expresión con líneas celulares de precipitación. Transfección transitoria y estable son dos métodos que se utilizan para la expresión de genes exógenos. Transitorios de la transfección sólo es útil para la expresión a corto plazo, mientras que la transfección estable permite genes exógenos a integrarse en el genoma de la célula huésped donde se se expresa continuamente. Como resultado, la transfección estable se emplea generalmente para la investigación en regulación genética a largo plazo. Aquí describimos un protocolo simple para generar una línea celular estable overexpressing muerte etiquetado receptor 3 (DR3) para explorar la función DR3. Seleccionamos clones solo después de una infección retroviral para mantener la homogeneidad y la pureza de las líneas celulares estables. Las líneas celulares estables generadas mediante este protocolo representan células HT29 DR3-deficiente sensibles a drogas antimitótica, reconstituyendo así la respuesta apoptótica en células HT29. Además, la etiqueta de la bandera en DR3 compensa la falta de buena anticuerpo DR3 y facilita el estudio bioquímico del mecanismo molecular por el cual agentes antimitótica inducen apoptosis.
Introduction
Expresión de genes heterólogos se emplea a menudo para estudiar la función de los genes de interés. Dos métodos, transfección transitoria y estable, se utilizan predominantemente en las células y biología molecular para insertar un segmento de ADN o ARN en un anfitrión célula1,2. Transitorio transfected ADN o ARN no puede transmitirse a células de la hija, por lo que la alteración genética puede conservarse sólo durante un período corto de tiempo. Por otra parte, en las células transfected estable, genes exógenos se integran en el genoma de la célula anfitrión, mantener su expresión en la línea celular. Así, la transfección estable es un método que generalmente se reserva para la investigación en la regulación genética a largo plazo. La línea celular estable también puede trasplantarse como xenoinjertos en modelos de ratón in vivo de estudio3. Transfección estable puede dividirse en dos categorías: virales y nonviral. En comparación con transfección nonviral, infección viral puede transferir genes en una variedad más amplia de células humanas con una mayor eficiencia4,5,6,7. Además, una línea celular estable de un solo clon ofrece la ventaja de la homogeneidad y pureza clonal.
División y crecimiento incontrolados de células son las más características del cáncer. En ajustes clínicos, agentes antimitótica son los tratamientos principales para muchos tipos de tumores8. Sin embargo, no se puede ignorar algunas limitaciones significativas de agentes antimitótica. En primer lugar, estas quimioterapias también pueden matar a las células normales junto con las células cancerosas no deseadas y, por lo tanto, pueden resultar en efectos secundarios graves8. Segundo, antitubulin medicamentos no son eficaces contra todos los tipos de tumores, a pesar de expresión ubicua de la tubulina en una amplia variedad de diferentes tejidos como una proteína citoesquelética9,10. No está claro porqué antitubulin agentes mostraron eficacia prometedora contra el ovario, pulmón y cánceres hematológicos en el tratamiento clínico, pero no en riñón, colon y los cánceres de páncreas11. Por último, incluso los pacientes con el mismo tipo de tumor pueden responder a las antimitotics diferentemente de una manera impredecible. Puede haber una molécula efectora clave que afecta a la sensibilidad de diferentes pacientes a agentes antimitótica, dando por resultado los diversos resultados en el tratamiento clínico12. Por lo tanto, la potencial sensibilidad diferencial de los pacientes al tratamiento antimitótica debe tenerse en cuenta para optimizar las intervenciones terapéuticas13.
Una pantalla de biblioteca de siRNA de todo el genoma de alto rendimiento demostró que DR3 caída puede hacer sensibles células resistentes a drogas antimitótica, implicando un papel para DR3 en la apoptosis inducida por la quimioterapia14. Como miembro de la superfamilia de receptores (TNFR) factor de necrosis tumoral, DR3 se ha divulgado para mediar la apoptosis de las células en varios sistemas15,16,17,18. Así pues, nos propusimos establecer líneas celulares estables overexpressing DR3 para estudiar los mecanismos moleculares por el cual droga antimitótica induce apoptosis. Un modelo de celular adecuado para el estudio de sobreexpresión de DR3 se puede proporcionar por la línea de celular del cáncer de colon humano HT29, que fue encontrado para ser DR3-deficiente. Además, en la clínica, cánceres de colon son insensibles a fármacos antimitótica19.
En este artículo, describimos un método que permite la generación de una línea celular estable de HT29-DR3 a través infección retroviral. Además mostramos cómo validar la expresión DR3 en estas células mediante western blot y cómo evaluar la sensibilidad a agentes antimitótica mediante un análisis de viabilidad de la célula y la observación morfológica. Las células son amplificadas de clones individuales y, por lo tanto, tienen la ventaja de un fondo genético homogéneo. Además, la etiqueta de la bandera en DR3 permitido para la visualización de DR3 celular por microscopia y análisis de la gene expresión y proteína interacción por métodos bioquímicos. Además, las células pueden ser investigaciones en ratones para analizar la progresión del tumor en respuesta a antimitotics en vivo14.
El sistema de células HT29-DR3 presentado aquí ofrece una herramienta efectiva para estudiar los mecanismos moleculares de cómo antimitotics matar células de cáncer14. Puesto que la sobreexpresión y líneas celulares de precipitación son herramientas comunes para estudiar la función genética, este protocolo puede ser adaptado fácilmente a otros genes de interés o de otras líneas celulares y, así, se convirtió en un método ampliamente utilizado.
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Protocol
Tenga en cuenta que todos los experimentos de ratón aquí descritos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el cuidado de Animal institucional y Comité uso (IACUC) en la Universidad Tsinghua.
1. generación de líneas de celulares sobreexpresión DR3
- Construir el plásmido de expresión DR3 (pMXs-IRES-DR3-FLAG) mediante la inserción del cDNA integral DR3 con 3 x bandera en el c-terminal en vector retroviral pMXs-IRES-Blasticidin en los sitios de restricción de BamHI/XhoI.
- Cultivar células de Plat-A en platos de 60 mm con 4 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Al día siguiente, cuando las células alcanzan 80% - 90% de confluencia, transfectar las células con 2 μg de plásmido pMXs-IRES-DR3-bandera usando el reactivo de transfección (véase Tabla de materiales) según manual del fabricante de la20.
- Después de 72 h, recoger el sobrenadante filtrado a los medios de comunicación utilizando un filtro estéril de 0,45 μm y mantener la suspensión viral en la oscuridad a 4 ° C.
- Cultivar células HT29 en DMEM en un plato de 60 mm e incubar las células a 37 ° C con 5% CO2.
- Al día siguiente, cuando las células alcanzan 30% - 50% de confluencia, infectar las células con 2 mL de la suspensión viral en presencia de 8 μg de 1, 5-Dimetil-1, 5-diazaundecamethylene polymethobromide por mililitro de suspensión viral. Después de 4-6 h de incubación a 37 ° C, aspirar la suspensión viral, añadir 4 mL de DMEM fresco y vuelva el plato a la incubadora.
- Desechar los medios de comunicación desde el postinfection de 24 h de platos y lavar cuidadosamente las células con 2 mL de PBS precalentadas. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA a las células e incubar a 37 ° C durante 3 minutos.
- Después de observar al microscopio con 10 aumentos que ha separado la mayoría de las células, parar la tripsinización con 2 mL de DMEM completo con 10% suero bovino fetal (FBS). Recoge la suspensión de células en un tubo de 15 mL y centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 10 mL de DMEM. Mezclar por pipeteo suavemente hacia arriba y hacia abajo. Diluir las células por los factores de 30, 100 y 300. Semilla de las células en platos de 150 mm con 20 mL de DMEM que contenía 1 μg/mL blasticidin. Incubar en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2 ~ 1-2 semanas.
- Durante este período, observar el día a día con un microscopio invertido con 10 aumentos. Marque las colonias bien aisladas en la parte inferior del plato cuando el diámetro de la Colonia es aproximadamente 1-2 mm.
- Aspire el medio y lavar las células con 3 mL de PBS precalentada. Añadir 2 ml de tripsina-EDTA en un plato de 60 mm. Use pinzas estériles para recoger cilindros de clonación estériles esterilizados y colocarlos en el plato de 60 mm. Recoger los cilindros que contienen tripsina-EDTA y colocarlos suavemente sobre las colonias marcadas. Asegúrese de que cada cilindro de clonación sólo contiene una colonia y evitar la contaminación con las colonias cercanas.
- Vuelva el plato a la incubadora durante 3 minutos.
- Después de 3 minutos, compruebe las células bajo el microscopio con un aumento 10 X para ver si han separado. Cuando las células han elevado, añadir 70 μL de medio de cultivo para cada cilindro para inactivar la tripsina. Mezclar suavemente la suspensión de células con una pipeta μL 200. Asegúrese de que no se mueva el cilindro durante este proceso.
- Transferir la suspensión de células de cada colonia a dos placas de 24 pocillos que contienen 1 mL de DMEM por pozo. Añadir 30 μL de suspensión de células por pocillo en placa A y 70 μL en los correspondientes pozos en placa B. etiqueta las placas correctamente y ponerlos en la incubadora.
2. verificación de la línea de celular de sobreexpresión de DR3
- Cuando las células en la placa B en 90% de confluencia, eliminar los medios de comunicación y lavar cuidadosamente las células con 1 mL de PBS. Completamente quitar PBS y lyse las células con 50 μL de 1 x de buffer de carga SDS-PAGE. Transferencia de los lysates de la célula de la placa de 24 pocillos para tubos de centrífuga de 1.5 mL y hervir las muestras por 10 min a 100 ° C.
- Ejecutar las muestras en el gel de sulfato (SDS) de dodecilbenceno sódico al 10% en una tensión constante de 80 V durante 15 minutos y, luego, a 120 V durante 1 hora.
- La proteína de transferencia a una membrana de polivinilideno (PVDF) de fluoruro por transferencia húmedo en una corriente constante de 400 mA durante 2 horas.
- Prueba la expresión DR3 en diferentes clones con el anticuerpo de anti-FLAG, usando las células HT29 de tipo salvaje como un control negativo (figura 1). Diluir el anticuerpo primario por un factor de 5.000 en 5% leche descremada en polvo que se disuelve en TBST (solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% Tween-20). Incubar la membrana con el anticuerpo de la bandera a 4 ° C durante la noche.
- Lavar la membrana con TBST por agitación en un agitador decoloring a 200 rpm en RT. actualización TBST cada 5 minutos para un total de 15 minutos el tiempo de lavado.
- Incubar la membrana con el anticuerpo secundario anti ratón diluido por un factor de 10.000 en 5% de leche descremada a 4 ° C durante 5-6 h.
- Lavar la membrana otra vez como se describe en el paso 2.5.
- Detectar la expresión bandera usando el substrato de la quimioluminescencia realzada occidental (ECL) y la imagen de la membrana con un sistema de documentación de gel (véase Tabla de materiales). Identificar los clones expresando DR3 como los clones positivos.
- La transferencia de los clones en la placa A que corresponden a los clones positivos en placa B a una placa de 6 pozos y continuarán amplificar las células hasta el crecimiento de ellos en platos de 10 cm. Hacer reservas congeladas de las células de cultivo de clones positivos y almacenarlas a-80 ° C para su uso futuro.
3. evaluación de la respuesta apoptótica de las células a agentes antimitótica
Nota: Diazonamide es una nueva clase de productos naturales marinos que tiene notable actividad en la inhibición de crecimiento de la célula de cáncer, que refleja otros agentes desestabilizadores de tubulina21. Sin embargo, su modo de acción sigue siendo confuso. Para probar la respuesta celular de las células a agentes antimitótica, paclitaxel y diazonamide fueron utilizados para tratar las células HT29 de tipo salvaje y las células HT29-DR3. Las drogas fueron disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO) para hacer las reservas de 10 mM y, luego, más diluidas a concentraciones diferentes: 30 nanómetros, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3.000 nM y 10.000 nM en DMSO.
- Recoger las células HT29 y HT29-DR3 por tripsinización. Medir la densidad de células usando un contador celular automático. Luego, las células en placas de 12 pozos en DMEM con una densidad de 3 x 104 células por pocillo de la semilla. Al día siguiente, añadir 10 nM diazonamide y utilizar DMSO 1% como control negativo. Después de 48 h de tratamiento, imagen de las células bajo un microscopio en 10 X de ampliación (figura 2).
- Semilla HT29 y HT29-DR3 células en placas de 96 pocillos en DMEM con una densidad de 3 x 103 células por pozo y permitan crecer durante la noche a 37 ° C. Luego, añade las concentraciones diazonamide de escalada de dosis de 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM y 100 nM para cada pocillo, utilizando DMSO 1% como control negativo.
- Después de 48 h de tratamiento, medir la viabilidad de las células usando un kit de ensayo de viabilidad celular basado en luminiscencia según el manual del fabricante.
- Saque la placa de 96 pocillos de la incubadora y dejar reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Luego, añada 50 μl de los reactivos de ensayo a cada pocillo, agitar la placa a temperatura ambiente por 2 min para lyse las células e incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos otro Determine de la luminiscencia de cada pozo con un lector de microplacas (figura 3).
Nota: La viabilidad celular representa la intensidad de la luminiscencia relativa de cada uno bien a bien que el control tratados con DMSO 1%.
- Saque la placa de 96 pocillos de la incubadora y dejar reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Luego, añada 50 μl de los reactivos de ensayo a cada pocillo, agitar la placa a temperatura ambiente por 2 min para lyse las células e incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos otro Determine de la luminiscencia de cada pozo con un lector de microplacas (figura 3).
- Utilizar ratones desnudos de seis semanas de edad hembra de BALB/c para un en vivo estudio14.
Nota: Los ratones fueron mantenidos en condiciones libres de patógenos específicas.- Trypsinize células HT29 y HT29-DR3 y, entonces, parar la tripsinización con DMEM precalentada a 37 ° C. Recoger la suspensión de células en un tubo de 50 mL y centrifugar las células a 1.000 rpm por 10 min a RT. descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en medio DMEM sin SFB. Centrifugar las células otra vez y resuspender el precipitado de células en PBS.
- Contar las células usando un contador celular automático y diluir las células a una concentración de 2,5 x 107 células/mL con PBS. Generar tumores a través de una inyección subcutánea de 200 μL de la suspensión de células HT29 o HT29-DR3 en el flanco derecho de cada ratón (5 x 106 células/ratón)22.
- Medir el volumen del tumor (TV) con pinzas cada 2 d después del trasplante. Calcular el TV usando la siguiente fórmula: TV = 1 / 2L x W x W (aquí, W: tumor ancho, L: longitud de tumor). Cuando el volumen del tumor promedio alcanza alrededor de 100 mm3, aleatorizar los ratones en el control o en el grupo tratado (n = 6 por grupo) e iniciar el tratamiento.
- Preparar la solución de paclitaxel como sigue. En primer lugar, disolver paclitaxel totalmente en etanol al 5% del volumen total y, a continuación, añadir 5% del volumen final de polioxil 35 hidrogenada el aceite de ricino. Por último, constituyen el 90% restante del volumen con D5W (dextrosa 5% en agua, pH 7,4).
- Inyectar el paclitaxel por vía intravenosa en una dosis de 20 mg/kg 3 veces por semana durante dos semanas. Medir el tumor volumen y el peso corporal 3 x una semana14. Terminar el experimento y eutanasia a los animales si el peso del cuerpo disminuye en un 20% o el volumen del tumor alcanza unos 2.000 mm3.
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Representative Results
Una caracterización de las células HT29 estable expresaban DR3 se muestra en la figura 1. Los clones expresan diferentes niveles de DR3, mientras que las células de tipo salvaje, que sirven como un control negativo, no muestran expresión de genes exógenos. Aquí sólo mostramos cinco clones, entre los que la copia 1 y 5 expresa el máximo nivel de DR3. Elegimos clon 1 y 5 para los siguientes experimentos.
La morfología de las células HT29 y HT29-DR3 después de la administración de diazonamide fue observada por un microscopio invertido con 10 aumentos en la figura 2. Después de un tratamiento de 48 h con 10 nM diazonamide, HT29-DR3 demostró apoptosis obvio, con una membrana celular rota y restos celulares (panel inferior). Sin embargo, HT29 sólo demostró detención mitótica con las células intactas exhibiendo una forma celular de round-up (panel superior).
La viabilidad celular de las células HT29 y HT29-DR3 después de tratamiento con diazonamide se muestra en la figura 3. Después de 48 h de tratamiento con 3 nM diazonamide, sobre la muerte celular 80% se encontró en HT29-DR3 células (curva roja). Sin embargo, las células HT29 parentales demostraron sólo una leve respuesta a diazonamide en forma de arresto mitótico (curva azul). Así, la sobreexpresión de DR3 había reconstituido la vía de apoptosis inducida por la diazonamide en estas células.
Los resultados de los experimentos en vivo tumor xenoinjerto han visto en un anterior documento14. La tasa de éxito de implantación del tumor para HT29 y HT29-DR3 es 100%. Los tumores xenoinjerto progresaban igualmente en el control del vehículo; sin embargo, los xenoinjertos HT29-DR3 muestran regresión del tumor más rápida que los xenoinjertos HT29 cuando fueron tratados con paclitaxel a dosis de 20 mg/kg. Nuestra observación de una mejor respuesta de los tumores HT29-DR3 a paclitaxel que HT29 tumores en vivo había confirmado más que una expresión ectópica de DR3 hace que las células tumorales más sensibles a antimitotics.
Figura 1 : Análisis de la expresión de DR3 en clones diferentes. Niveles de expresión de DR3 se analizaron mediante western blot con anti-FLAG (panel superior) y los anticuerpos anti-beta-actina (panel inferior, como un control interno). Células HT29 parentales fueron utilizadas como control negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Análisis de la morfología de las células HT29 y HT29-DR3 después del tratamiento con diazonamide. HT29 (panel superior) y HT29-DR3 (panel inferior) fueron tratados con 10 nM diazonamide de 48 h. Las barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Curvas de dosis-respuesta de las células HT29 y HT29-DR3 diazonamide. Viabilidad celular se midió después de 48 h de tratamiento con seriales concentraciones de diazonamide. Las barras de error = la desviación estándar (SD) de triplicados experimentales. DA = diazonamide. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este manuscrito, se describe un método para generar líneas de células estables de HT29-DR3. Las células HT29-DR3 son un modelo para el estudio de los mecanismos moleculares por los cuales DR3 contribuye a la apoptosis inducida por agentes antimitótica. Este enfoque es versátil y repetible. Para garantizar el éxito del procedimiento, cuatro pasos claves del protocolo necesitan ser considerados. En primer lugar, con el fin de producir un alto suficiente título de virus, se recomienda realizar la transfección de ADN cuando las células de Plat-A 80-90% de confluencia. En segundo lugar, la suspensión viral debe almacenarse a 4 ° C por no más de dos semanas, cubierto de la luz. En tercer lugar, al dividir las células infectadas en platos de 150 mm, se recomienda hacer diluciones seriadas para obtener colonias bien separadas, como la eficiencia de la infección varía en diferentes células. Finalmente, al recoger una sola Colonia, no debe haber ningún tipo de contaminación con las colonias circundantes.
Este protocolo funciona bien con la mayoría de las líneas celulares pero potencialmente puede ser difícil para las células que no tienden a formar colonias individuales. En tales casos, se necesitarán otras técnicas de clasificación de la célula, como antibióticos combinados con celular activado por fluorescencia (FACS), de clasificación.
Transfección estable incluye métodos virales y no virales. En este protocolo, utilizamos una infección retroviral para generar células overexpressing DR3, razonamiento que métodos físicos, tales como la electroporación, son más tóxicos para las células23 y químico los métodos, como la transfección de ADN mediada por lípidos, tienen una baja eficiencia en muchos tipos de células y tienen posibles efectos off-target24,25,26.
Expresión ectópica es una manera directa y eficaz para aclarar las funciones del gene. Por lo tanto, este protocolo puede utilizarse para estudiar otras moléculas Diana. Además, knockdown de genes es importante en estudios funcionales, y es posible que el protocolo puede ser adaptado a sistemas de knockdown de genes. En comparación con otros enfoques de golpe y golpe de gene, como CRISPR-Cas9, el protocolo presentado aquí es fácil de aplicar y accesibles para todos los laboratorios.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de 53110000117 (a GW) y 043222019 (a X.W.) de la Universidad de Tsinghua.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
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