Summary
Tot vaststelling van een stabiel cellijn overexpressing een gen van belang zijn voor het bestuderen van de genfunctie kan gebeuren door stabiele transfectie-picking enkele klonen na transfecting hen via retrovirale infectie. Hier laten we zien dat HT29-DR3 cellijnen gegenereerd op deze manier verhelderen de mechanismen door welke dood receptor 3 (DR3) draagt bij tot antimitotics-veroorzaakte apoptosis.
Abstract
Bestuderen van de functie van een gen van belang kan worden bereikt door het manipuleren van het niveau van meningsuiting, zoals minderen qua uitdrukkingswijze met vechtpartij cellijnen of het verhogen van de expressie met overexpressie cellijnen. Voorbijgaande en stabiele transfectie zijn twee methoden die worden vaak gebruikt voor exogene genexpressie. Voorbijgaande Transfectie is alleen handig voor korte termijn expressie, overwegende dat stabiele transfectie kunt exogene genen worden geïntegreerd in het genoom van de cel host waar het voortdurend zal worden uitgedrukt. Dientengevolge, is stabiele transfectie meestal werkzaam voor onderzoek in lange termijn genetische verordening. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het genereren van een stabiele cellijn tagged dood receptor 3 (DR3) te verkennen DR3 functie overexpressing. We pakte enkele klonen na een retrovirale infectie teneinde de homogeniteit en de zuiverheid van de stabiele cellijnen. De stabiele cellijnen gegenereerd met behulp van dit protocol maken DR3-deficiënte HT29 cellen gevoelig voor antimitotische geneesmiddelen, aldus bijenpopulatie de apoptotic reactie in HT29 cellen. Bovendien, de vlag-tag op DR3 compenseert de onbeschikbaarheid van goede DR3 antilichaam en vergemakkelijkt de biochemische studie van het moleculaire mechanisme waarmee antimitotische agenten apoptosis induceren.
Introduction
Heterologe genexpressie is vaak aangewend om te bestuderen van de functie van genen van belang. Twee methoden, voorbijgaande en stabiele transfectie, worden prevalently gebruikt in cellen en moleculaire biologie aan een segment van DNA of RNA invoegen een host cel1,2. Transient-transfected DNA of RNA kan niet worden doorgegeven aan dochtercellen, zodat de genetische wijziging kan alleen worden gehandhaafd voor een korte periode van tijd. Aan de andere kant, in stabiel transfected cellen, zijn exogene genen geïntegreerd in het ontvangende cel genoom, behoud van de expressie in de cellijn. Dus, stabiele transfectie is een methode die is meestal gereserveerd voor onderzoek naar lange termijn genetische verordening. De stabiele cellijn kan ook worden getransplanteerd zoals xenografts in Muismodellen voor in vivo studie3. Stabiele transfectie kan worden onderverdeeld in twee categorieën: virale en nonviral. In vergelijking met nonviral transfectie, kunt virale infectie overbrengen van genen in een breder scala aan menselijke cellen met een hogere efficiëntie4,5,6,7. Bovendien biedt een stabiele cellijn van een enkele kloon het voordeel van homogeniteit en klonen zuiverheid.
Ongecontroleerde celgroei en deling zijn de meest onderscheidende kenmerken van de kanker. In klinische instellingen zijn antimitotische agenten de primaire behandelingen voor vele soorten tumoren8. Echter, enkele belangrijke beperkingen van antimitotische agenten kunnen niet worden genegeerd. Eerst, deze chemokuren kunnen ook doden normale cellen samen met de ongewenste kankercellen en, dus, kunnen leiden tot ernstige bijwerkingen8. Tweede, antitubulin medicijnen zijn niet effectief tegen alle soorten tumoren, ondanks tubuline de alomtegenwoordige expressie in een breed scala aan verschillende weefsels als een cytoskeletal eiwit9,10. Het is onduidelijk waarom antitubulin agenten toonde veelbelovende werkzaamheid tegen ovariële, Long-, en hematologische kankers in klinische behandeling, maar niet in de nier, dubbele punt of alvleesklier kanker11. Ten slotte, zelfs patiënten met hetzelfde type tumor kunnen reageren op de antimitotics anders op een onvoorspelbare wijze. Kan er een belangrijke effector molecuul dat is van invloed op de gevoeligheid van verschillende patiënten aan antimitotische agentia, resulterend in de uiteenlopende resultaten gezien in klinische behandeling12. Dus moeten de potentiële differentiële gevoeligheden van patiënten antimitotische behandeling in aanmerking worden genomen voor het optimaliseren van therapeutische interventies13.
Een high-throughput geheel-genoom siRNA bibliotheek scherm aangetoond dat DR3 knockdown gevoelige cellen resistent tegen antimitotische geneesmiddelen, we een rol voor DR3 in chemotherapie-veroorzaakte apoptosis14kan renderen. Als een lid van de tumor necrose factor receptor (TNFR) superfamilie, is DR3 gemeld te bemiddelen cel apoptosis in verschillende systemen15,16,17,18. Dus zetten we uit om stabiele cellijnen DR3 om te bestuderen van de moleculaire mechanismen waarmee antimitotische geneesmiddelen apoptosis induceren overexpressing. Een model van de juiste cel voor het bestuderen van DR3 overexpressie kan worden verstrekt door de menselijke Colón kanker cellijn HT29, die bleek te zijn DR3-deficiënte. Bovendien, in de kliniek, dikke darm kankers zijn ongevoelig voor antimitotische geneesmiddelen19.
In dit artikel beschrijven we een methode waarmee de generatie van een HT29-DR3 stabiele cellijn door retrovirale infectie. Verder laten we zien hoe de DR3 expressie in deze cellen gebruikend het westelijke bevlekken valideren en hoe om te beoordelen van de gevoeligheid voor antimitotische agentia met behulp van een cel levensvatbaarheid assay en morfologische observatie. De cellen van één klonen worden versterkt en, dus, hebben het voordeel van een homogene genetische achtergrond. Bovendien mag de vlag-tag op DR3 voor de visualisatie van cellulaire DR3 door microscopie en analyse van gen expressie en eiwit interactie door biochemische benaderingen. Bovendien, kunnen de cellen xenografted in muizen aan tumor progressie in reactie op antimitotics in vivo14verder te analyseren.
De HT29-DR3 cel systeem gepresenteerd hier aangeboden een doeltreffend instrument voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van hoe antimitotics doden van kanker cellen14. Aangezien overexpressie en vechtpartij cellijnen gemeenschappelijke hulpmiddelen zijn voor de bestudering van de genfunctie, kan dit protocol worden aangepast gemakkelijk aan andere genen van belang of andere cellijnen en, dus, omgevormd tot een veel gebruikte aanpak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Houd er rekening mee dat alle hier beschreven muis experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd overeenkomstig de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Universiteit van Tsinghua.
1. generatie van DR3 overexpressie cellijnen
- Bouw van de plasmide voor DR3 expressie (pMXs-IRES-DR3-FLAG) door het invoegen van full-length DR3 cDNA met 3 x vlag in het C-terminus in retrovirale vector pMXs-IRES-Blasticidin op de sites van de beperking van BamHI/XhoI.
- Groeien Plat-A cellen in 60 mm gerechten met 4 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM). De volgende dag, wanneer de cellen bereikt 80% - 90% samenvloeiing, transfect de cellen met 2 μg plasmide pMXs-IRES-DR3-FLAG transfectiereagens gebruiken (Zie Tabel van materialen) volgens de fabrikant handmatige20.
- Na 72 uur verzamelen het supernatant filtraat van de media met behulp van een 0,45 micrometer steriel filter en houden de virale schorsing in het donker bij 4 ° C.
- Groeien HT29 cellen in DMEM in een schotel van 60 mm en Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.
- De volgende dag, wanneer de cellen bereiken samenvloeiing van de 30% - 50%, de cellen met 2 mL virale schorsing in aanwezigheid van 8 μg van 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide per milliliter van virale schorsing infecteren. Na 4-6 uur incubatie bij 37 ° C, gecombineerd de virale schorsing, Voeg 4 mL verse DMEM en de schotel terugkomen in de incubator.
- Negeren van de media van de gerechten 24 h postinfection en cellen met 2 mL PBS voorverwarmde grondig te wassen. Voeg 1 mL trypsine-EDTA aan de cellen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten.
- Na het observeren onder een microscoop op 10 X vergroting die allermeest naar de cellen hebben losgemaakt, stoppen de trypsinebehandeling met 2 mL van volledige DMEM met 10% foetale runderserum (FBS). Verzamelen van de celsuspensie in een tube van 15 mL en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 10 mL DMEM. Meng goed door pipetteren zachtjes op en neer. Verdun de cellen door factoren van 30, 100 en 300. Zaad de cellen in 150 mm gerechten met 20 mL DMEM met 1 µg/mL blasticidin. Incubeer bij een incubator 37 ° C met 5% CO2 ~ 1-2 weken.
- Observeren tijdens deze periode elke dag op de kolonies met een omgekeerde Microscoop op 10 X vergroting. De goed geïsoleerde kolonies op de bodem van de schotel markeren als de waarde de kolonie diameter is ongeveer 1-2 mm.
- Het medium gecombineerd en wassen van de cellen met 3 mL voorverwarmde PBS. Voeg 2 milliliter trypsine-EDTA in een schotel van 60 mm. Gebruik van steriel pincet te halen gesteriliseerde met autoclaaf steriel klonen cilinders, en plaats ze in de schotel van 60 mm. Pak de cilinders met trypsine-EDTA en plaats ze voorzichtig over de gemarkeerde kolonies. Zorg ervoor dat elke klonen cilinder alleen bevat één kolonie en voorkoming van verontreiniging met nabijgelegen kolonies.
- Terug de schotel naar de incubator voor 3 minuten.
- Na 3 min, Controleer de cellen onder de Microscoop op 10 X vergroting om te zien of ze hebben losgemaakt. Wanneer de cellen hebben opgetild, 70 μL van kweekmedium aan elke cilinder naar de inactivering van de trypsine toevoegen. Meng voorzichtig de celsuspensie met een 200 μL pipet. Zorg ervoor dat niet te verhuizen van de cilinder tijdens dit proces.
- Overbrengen van de celsuspensie van elke kolonie naar twee 24-Wells-platen met DMEM 1 mL per putje. Voeg 30 μL van celsuspensie per putje in plaat A en 70 μL in de corresponderende putjes in de plaat B. Label de platen goed en leg ze terug in de incubator.
2. controle van de DR3 overexpressie cellijn
- Wanneer de cellen in de plaat B aan 90% samenvloeiing zijn, verwijder het medium en de cellen met 1 mL PBS grondig te wassen. Volledig verwijderen van PBS en lyse de cellen met 50 μl van 1 x SDS-pagina laden buffer. De cel lysates van de 24-well plaat overbrengen met 1,5 mL centrifuge buizen en kook de monsters gedurende 10 minuten bij 100 ° C.
- De monsters worden uitgevoerd op 10% natrium dodecyl sulfaat (SDS) gel bij een constante spanning van 80 V gedurende 15 minuten en vervolgens 120 V voor 1 h.
- Het eiwit overbrengen in een Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride membraan door natte overdracht op een constante stroom van 400 mA gedurende 2 uur.
- Test de DR3 expressie in verschillende klonen met Anti-Flag antilichaam, met behulp van de wild-type HT29 cellen als een negatieve controle (Figuur 1). Het primaire antilichaam verdund met een factor van 5.000 in 5% nonfat melk die wordt opgelost in TBST (Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20). Incubeer het membraan met vlag antilichaam bij 4 ° C's nachts.
- Het membraan met TBST wassen door schudden op een decoloring shaker bij 200 t/min bij RT. Refresh de TBST elke 5 min voor een totaal tijd van 15 minuten wassen.
- Incubeer het membraan met anti-muis secundair antilichaam verdund met een factor van 10.000 in 5% nonfat melk bij 4 ° C gedurende 5-6 h.
- Het wassen van het membraan opnieuw zoals beschreven in stap 2.5.
- Detecteren van de expressie van de vlag met westerse Verbeterde Chemiluminescentie (ECL) substraat en beeld van het membraan met een documentatiesysteem gel (Zie Tabel van materialen). Het identificeren van de klonen DR3 uitdrukken als de positieve klonen.
- Overdracht van de klonen in plaat A die overeenstemmen met positieve klonen in plaat B naar een 6-well-plaat en blijven versterken de cellen tot het verbouwen ervan in 10 cm schotels. Maak bevroren voorraden van de cellen groeien uit positieve klonen en sla ze bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.
3. beoordeling van de reactie van de Apoptotic cellen op antimitotische agenten
Opmerking: Diazonamide is een nieuwe klasse van mariene natuurproduct dat opmerkelijke activiteit heeft in het remmen van kanker-celgroei, die andere agenten tubuline-destabiliserende21weerspiegelt. Echter is zijn werkingsmechanisme onduidelijk. Om te testen het cellulaire antwoord van cellen op antimitotische agenten, werden paclitaxel en diazonamide gebruikt voor de behandeling van wild-type HT29 cellen en HT29-DR3 cellen. De drugs werden ontbonden in dimethylsulfoxide (DMSO) te maken van voorraden van 10 mM en, vervolgens verder verdund tot verschillende concentraties: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3000 nM, en 10.000 nM in DMSO.
- HT29 en HT29-DR3 cellen verzamelen door trypsinebehandeling. Het meten van de celdichtheid met behulp van een automatische cel counter. Vervolgens, seed cellen in 12-Wells-platen in DMEM bij een dichtheid van 3 x 104 cellen per putje. De volgende dag, voeg 10 nM diazonamide en 1% DMSO gebruiken als een negatieve controle. Na 48u van behandeling, het imago van de cellen onder een microscoop op 10 X vergroting (Figuur 2).
- Zaad HT29 en HT29-DR3 cellen in 96-wells-platen in DMEM bij een dichtheid van 3 x 10-3 cellen per putje en laten groeien 's nachts bij 37 ° C. Voeg vervolgens dosis-escalatie diazonamide concentraties van 0.3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, en 100 nM aan elk putje, met behulp van 1% DMSO als negatieve controle.
- Na 48u van behandeling, meten van de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van een cel luminescentie gebaseerde levensvatbaarheid assay kit volgens de handleiding van de fabrikant.
- Neem de 96-wells-plaat uit de incubator en laat het staan op RT voor ongeveer 30 min. Voeg vervolgens toe 50 µL van assay reagentia aan elk putje, schud de plaat op RT voor 2 min Lyse de cellen en Incubeer de plaat duikt met RT voor een ander 10 min. bepalen de luminescentie van elk putje met behulp van een microplate reader (Figuur 3).
Opmerking: De levensvatbaarheid van de cellen vertegenwoordigt de luminescentie van de relatieve intensiteit van elk goed tot dat van het besturingselement ook behandeld met 1% DMSO.
- Neem de 96-wells-plaat uit de incubator en laat het staan op RT voor ongeveer 30 min. Voeg vervolgens toe 50 µL van assay reagentia aan elk putje, schud de plaat op RT voor 2 min Lyse de cellen en Incubeer de plaat duikt met RT voor een ander 10 min. bepalen de luminescentie van elk putje met behulp van een microplate reader (Figuur 3).
- Zes weken oude vrouwelijke BALB/c naakt muizen voor een in vivo onderzoek14gebruiken.
Opmerking: De muizen werden onderhouden onder omstandigheden van specifieke pathogenen vrije.- Trypsinize HT29 en HT29-DR3 cel en, vervolgens, stoppen de trypsinebehandeling met behulp van DMEM voorverwarmde bij 37 ° C. Verzamelen van de celsuspensie in een tube van 50 mL en centrifugeer de cellen bij 1000 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten op RT. Discard het supernatant en resuspendeer de pellet cel in DMEM medium zonder FBS. Centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer de cel pellet in PBS.
- Met behulp van een automatische cel counter cellen tellen en verdunnen van de cellen tot een concentratie van 2.5 x 107 cellen/mL met behulp van PBS. Genereren door een subcutane injectie van 200 μL van de HT29 of HT29-DR3 celsuspensie tumoren in de rechterflank van elke muis (5 x 106 cellen/muis)22.
- Meet het volume (TV) van de tumor met remklauwen elke 2 d na de transplantatie. De TV met behulp van de volgende formule berekenen: TV = 1 / 2L x W x W (hier, b: tumor breedte, L: tumor lengte). Wanneer het gemiddelde tumor volume ongeveer 100 mm3 bereikt, randomize de muizen in het besturingselement of de behandelde groep (n = 6 per groep) en de behandeling te starten.
- Bereid de paclitaxel-oplossing als volgt. Eerst, ontbinden paclitaxel volledig in 5% van het totale volume ethanol en voeg vervolgens toe 5% van het uiteindelijke volume van polyoxyl 35 gehydrogeneerde ricinusolie. Tot slot maken de resterende 90% van het volume met de D5W (5% dextrose in water, pH 7.4).
- Injecteer de paclitaxel intraveneus bij een dosis van 20 mg/kg 3 x per week gedurende twee weken. Het meten van de tumor volume en lichaamsgewicht 3 x een week14. Het experiment beëindigen en de dieren euthanaseren, als het lichaamsgewicht met 20 daalt % of het volume van de tumor ongeveer 2.000 mm3 bereikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een karakterisering van HT29 cellen stabiel uiten DR3 is afgebeeld in Figuur 1. De klonen express uiteenlopende niveaus van DR3, terwijl de wild-type-cellen, die als een negatieve controle dienen, geen exogene genexpressie vertonen. Hier tonen we slechts vijf klonen, waaronder kloon 1 en 5 express het hoogste niveau van DR3. We kozen de kloon 1 en 5 voor de volgende experimenten.
De morfologie van cellen van de HT29 en HT29-DR3 na de toediening van diazonamide werd waargenomen door een omgekeerde Microscoop op 10 X vergroting in Figuur 2. Na 48 uur behandeld met een 10 nM diazonamide toonde HT29-DR3 duidelijk apoptosis, met een gebroken celmembraan en cel puin (onderkant). HT29 toonde echter alleen mitotische arrestatie met intact cellen tentoonstellen van een ronde-up cel vorm (bovenste paneel).
De levensvatbaarheid van de cellen van HT29 en HT29-DR3 cellen na behandeling met diazonamide is afgebeeld in Figuur 3. Na 48u van behandeling met 3 nM diazonamide, over de dood van de cel van de 80% werd gevonden in HT29-DR3 cellen (rode curve). De ouderlijke HT29 cellen blijkt echter slechts een lichte reactie op diazonamide in de vorm van de mitotische arrestatie (blauwe curve). De overexpressie van DR3 gereconstitueerd dus, de diazonamide-geïnduceerde apoptotic traject in deze cellen.
De resultaten voor de in-vivo -experimenten van het tumor-xenograft is aangetoond in een eerdere papier14. Het slagingspercentage van tumor implantatie voor zowel HT29 als HT29-DR3 is 100%. De xenograft tumoren vorderde op dezelfde manier in de controle van het voertuig; echter weergegeven de HT29-DR3 xenografts sneller tumor regressie dan de HT29 xenografts wanneer behandeld met paclitaxel bij een dosis van 20 mg/kg. Onze waarneming van een betere reactie van HT29-DR3 tumoren op paclitaxel dan die van HT29 tumoren in vivo verder bevestigd dat een ectopische expressie van DR3 tumorcellen gevoeliger voor antimitotics maakt.
Figuur 1 : Analyse van DR3 expressie in verschillende klonen. DR3 expressie niveaus werden geanalyseerd door het westelijke bevlekken met Anti-Flag (bovenzijde) en beta-actine antilichamen (onderste paneel, als een interne controle). Ouderlijke HT29 cellen werden gebruikt als een negatieve controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Morfologie analyse van HT29 en HT29-DR3 cellen na de behandeling met diazonamide. HT29 (bovenzijde) en HT29-DR3 (onderste paneel) werden behandeld met 10 nM diazonamide voor 48 uur. De schaal balken = 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Dosis / respons-curven van HT29 en HT29-DR3 cellen diazonamide. Levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten na 48u van behandeling met seriële concentraties van diazonamide. De foutbalken = de standaarddeviatie (SD) van experimentele triplicates. DA = diazonamide. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript beschrijven we een methode voor het genereren van HT29-DR3 stabiele cellijnen. HT29-DR3 cellen bieden een model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die door die DR3 draagt bij aan apoptosis geïnduceerd door antimitotische agenten. Deze aanpak is veelzijdig en herhaalbaar. Om te verzekeren het succes van de procedure, vier belangrijke stappen van het protocol moeten worden overwogen. Eerst, produceren een hoog genoeg virus titer, wordt u aangeraden uitvoeren DNA transfectie wanneer de Plat-A-cellen op de samenvloeiing van de 80% - 90 zijn %. Ten tweede, de virale opschorting moet worden opgeslagen bij 4 ° C voor waarop niet langer dan 2 weken, van licht. Ten derde, wanneer de geïnfecteerde cellen verdelen in 150 mm gerechten, is het raadzaam te doen seriële verdunningen om goed gescheiden kolonies, als de efficiëntie van de infectie in verschillende cellen varieert. Tot slot, bij het oppakken van een één kolonie, er mag geen elke besmetting met de omliggende koloniën.
Dit protocol werkt goed samen met de meeste cellijnen maar potentieel moeilijk kan zijn voor cellen die doen niet de neiging om enkele kolonies vormen. In dergelijke gevallen zouden andere technieken op basis van cel-sorteren, zoals antibiotica in combinatie met fluorescentie-activated cell sorting (FACS), nodig zal zijn.
Stabiele transfectie omvat zowel virale als niet-virale methoden. In dit protocol gebruikten we een retrovirale infectie te genereren van cellen overexpressing DR3, redeneren dat fysieke methoden, zoals electroporation, giftiger is aan cellen23 en chemische methoden, zoals lipide-gemedieerde DNA-transfectie zijn, hebben een lage efficiëntie in veel cel typen en hebben potentiële af-target effecten24,25,26.
Ectopische expressie is een directe en efficiënte manier om het verhelderen van gene functies. Daarom kan dit protocol worden gebruikt om te bestuderen van andere doel-moleculen. Bovendien gene knockdown is ook belangrijk in functionele studies, en het is mogelijk dat het protocol aangepast aan gene vechtpartij systemen worden kan. Vergeleken met andere gen knock-in en knock-out-benaderingen, zoals CRISPR-Cas9, is het protocol hier gepresenteerd eenvoudig toe te passen en betaalbaar voor alle laboratoria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies 53110000117 (naar G.W.) en 043222019 (met X.W.) van Tsinghua Universiteit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q.
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R.
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
