Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הקמת שורות תאים Overexpressing DR3 כדי להעריך את התגובה אפופטוטיים להיפגע הרפוי אנטי-mitotic

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58705
Automatic Translation
*1, *2, *1, 1,3
1School of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University, 2Department of Radiology, University of California, San Francisco, 3Beijing Advanced Innovation Center for Structural Biology
* These authors contributed equally

Summary

הקמת קו יציב תא overexpressing הגן עניין ללמוד פונקציה ג'ין יכול להיעשות על ידי שיבוטים יחיד יציב של חיטוט תרביות תאים לאחר transfecting אותם באמצעות retroviral זיהום. הנה אנחנו מראים כי HT29-DR3 שורות תאים שנוצרו בדרך זו להבהיר את מנגנוני מוות איזה קולטן 3 (DR3) תורמת antimitotics-induced אפופטוזיס.

Abstract

לומד את הפונקציה של הגן עניין יכולה להיות מושגת על-ידי מניפולציה לרמת הביטוי, כגון הפחתת הביטוי שלה עם שורות תאים תמונות ציפורים או להגדיל את הביטוי שלה עם שורות תאים ביטוי. תרביות תאים ארעית ויציבה הם שתי שיטות שבהן משמשים לעתים קרובות על ביטוי גנים אקסוגני. תרביות תאים ארעי שימושית רק ביטוי לטווח קצר, ואילו תקנים יציב מאפשר גנים אקסוגני לשלב את הגנום של התא המארח היכן זה ברציפות יתבטא. כתוצאה מכך, תרביות תאים יציב בדרך כלל מועסק למחקר לתוך תקנה גנטי לטווח ארוך. כאן נתאר פרוטוקול פשוט כדי ליצור קו יציב תא overexpressing מוות מתויג קולטן 3 (DR3) לחקור פונקציה DR3. בחרנו שיבוטים יחיד לאחר זיהום retroviral על מנת לשמור על הומוגניות של טוהר השורות תא יציב. הקווים תא יציב שנוצר באמצעות פרוטוקול זה לבלתי DR3 לקויה HT29 תאים רגישים לסמים antimitotic, ובכך לשחזר את התגובה אפופטוטיים להיפגע בתאים HT29. יתר על כן, התג דגל על DR3 מפצה על אי זמינות של נוגדן DR3 טוב ואסטמה ומקילה על המחקר הביוכימי של המנגנון המולקולרי שבאמצעותו סוכנים antimitotic לגרום אפופטוזיס.

Introduction

ביטוי גנים heterologous הוא מועסק בדרך כלל ללמוד את התפקוד של הגנים של עניין. שתי השיטות, תרביות תאים ארעית ויציבה, משמשים prevalently תאים וביולוגיה מולקולרית כדי להוסיף מקטע של DNA או RNA1,תא מארח2. ה-DNA או RNA transiently transfected שאי אפשר לעבור לתאי הבת, אז שינוי גנטי יכול להישמר רק לתקופה קצרה של זמן. מצד שני, stably transfected תאים, גנים אקסוגני משולבים לתוך הגנום התא המארח, סופגת ביטויה של הקו הסלולרי. לפיכך, תרביות תאים יציבה היא שיטה זה שמורה בדרך כלל למחקר לתוך תקנה גנטי לטווח ארוך. גם יכול להיות מושתלים הקו הסלולרי יציב כמו xenografts לתוך עכבר מודלים עבור ויוו ללמוד3. תרביות תאים יציבה ניתן לחלק לשתי קטגוריות: ויראלי, nonviral. לעומת תקנים nonviral, זיהום ויראלי יכול להעביר גנים לתוך מגוון רחב יותר של תאים אנושיים עם גבוה יותר יעילות4,5,6,7. יתר על כן, קו יציב תא שיבוט יחיד מציעה את היתרון של הומוגניות וטוהר המשובטים.

גידול תאים בלתי מבוקרת וחילוק הם בעלי התכונות להבחין ביותר של סרטן. הגדרות קליני, סוכנים antimitotic הם הטיפולים העיקרי עבור סוגים רבים של גידולים8. עם זאת, שאי אפשר להתעלם ממנו כמה מגבלות משמעותיות של סוכנים antimitotic. ראשית, אלה chemotherapies גם יכול להרוג תאים נורמליים יחד עם תאים סרטניים רצויה, לפיכך, יכול לגרום תופעות לוואי חמורות8. שנית, antitubulin סמים אינם יעילים נגד כל סוגי גידולים, למרות ביטוי בכל מקום של טובולין במגוון רחב של רקמות שונות כמו חלבון cytoskeletal9,10. לא ברור מדוע סוכנים antitubulin הראה מבטיח יעילות כנגד השחלות, ריאות, סרטן hematological בטיפול קליני, אך לא כליה, המעי הגס או סרטן הלבלב11. בסופו של דבר, אפילו חולים עם אותו סוג של גידול יכול להשיב antimitotics באופן שונה באופן בלתי צפוי. אולי יש מולקולה אפקטור המפתח המשפיעה על הרגישות של מטופלים שונים לסוכנים antimitotic, וכתוצאה מכך התוצאות מגוונות ראיתי טיפול רפואי12. לפיכך, פוטנציאל שהיא התכוונה דיפרנציאלית של חולים לטיפול antimitotic צריך לקחת בחשבון כדי לייעל התערבויות טיפוליות13.

מסך ספריית תפוקה גבוהה הגנום כולו siRNA הפגינו DR3 נוקאאוט לחסרת רגישות תאים עמידים בפני תרופות antimitotic, שמערבות תפקיד עבור DR3 אפופטוזיס כימותרפיה14. כחבר superfamily קולטן (TNFR) הגידול נקרוזה מקדם, דווח DR3 לתווך תא אפופטוזיס שונים מערכות15,16,17,18. לפיכך, יצאנו להקים שורות תאים יציב overexpressing DR3 ללמוד המנגנון המולקולרי שבאמצעותו סמים antimitotic לגרום אפופטוזיס. מודל תאים מתאים עבור הלומדים DR3 ביטוי יכולה להינתן על ידי הקו התא סרטן המעי הגס האנושי HT29, אשר נמצאה להיות DR3 לקויה. בנוסף, במרפאה, סרטן המעי הגס הם רגישות antimitotic סמים19.

במאמר זה, אנו מתארים שיטה המאפשרת את הדור של קו יציב תא HT29-DR3 דרך retroviral זיהום. בהמשך נראה כיצד לאמת את הביטוי DR3 בתאים אלה באמצעות סופג המערבי וכיצד להעריך את הרגישות לסוכנים antimitotic על-ידי שימוש assay הכדאיות תא והתבוננות מורפולוגי. התאים הם מוגבר מן שיבוטים יחיד, ולכן, יש את היתרון של רקע גנטי הומוגני. בנוסף, דגל תג על DR3 מותר עבור הפריט החזותי של DR3 התאית על ידי מיקרוסקופ וניתוח של ג'ין ביטוי וחלבון אינטראקציה על ידי גישות הביוכימי. יתר על כן, התאים ניתן xenografted בעכברים לנתח יותר התקדמות הגידול בתגובה antimitotics ויוו14.

תא HT29-DR3 המערכת המוצגת כאן מוצעים כלי יעיל עבור הלומדים את המנגנונים המולקולריים של מה antimitotics להרוג את תאי הסרטן14. מאז ביטוי וקווים תא תמונות ציפורים הם כלים נפוצים ללמוד תפקוד הגן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות גנים אחרים מעניינים או שורות תאים אחרים והפכו, לפיכך, גישה בשימוש נרחב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

שימו לב: כל הניסויים העכבר המתוארים כאן היו אישר וביצע בהתאם טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת צינג.

1. דור של שורות תאים ביטוי DR3

  1. לבנות את פלסמיד לביטוי DR3 (pMXs-IRES-DR3-דגל) על-ידי הוספת cDNA DR3 באורך מלא עם 3 x הדגל על קצה קרבוקסילי לתוך retroviral וקטור pMXs-IRES-Blasticidin באתרים מגבלת של BamHI/XhoI.
  2. לגדל תאים Plat-A במנות 60 מ מ עם 4 מיליליטר הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM). למחרת, כאשר התאים להגיע למפגש 80% - 90%, transfect את התאים עם 2 μg של פלסמיד pMXs-IRES-DR3-דגל באמצעות תקנים ריאגנט (ראה טבלה של חומרים) על פי היצרן ידנית20.
  3. לאחר 72 h, לאסוף את תגובת שיקוע, filtrate התקשורת באמצעות מסנן סטרילי 0.45 μm ולשמור את המתלים ויראלי בחושך ב 4 º C.
  4. לגדל תאים HT29 DMEM בקערה 60 מ מ, דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2.
  5. למחרת, כאשר התאים להגיע למפגש 30% - 50%, להדביק את התאים עם 2 מ"ל של השעיה ויראלי בנוכחות μg 8 של 1, 5-דימתיל-1, 5-diazaundecamethylene polymethobromide למיליליטר של השעיה ויראלי. לאחר 4-6 h של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, וארוקן את המתלים ויראלי, להוסיף 4 מיליליטר DMEM טריים, להחזיר את המנה החממה.
  6. למחוק את המדיה מן postinfection 24 שעות מנות ולשטוף היטב תאים עם 2 מ של prewarmed PBS. להוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לתאים, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
  7. לאחר התבוננות במיקרוסקופ בהגדלה X 10 זה רוב התאים יש תלושים, להפסיק את trypsinization 2 מ של DMEM מלא המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS). לאסוף את התליה תא בשפופרת 15 מ"ל, centrifuge את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  8. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של DMEM. מערבבים היטב על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה. לדלל את התאים על ידי גורמים של 30, 100 ו- 300. הזרע התאים במנות 150 מ מ עם 20 מ של DMEM המכילה 1 blasticidin µg/mL. דגירה-חממה 37 ° C עם 5% CO2 ~ 1-2 שבועות.
  9. במהלך תקופה זו, להתבונן המושבות כל יום עם מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה X 10. סמן את המושבות מבודד היטב בחלק התחתון של המנה כאשר הקוטר המושבה הוא כ 1-2 מ מ.
  10. האחות המדיום ולשטוף את התאים עם 3 מ"ל של PBS ומחוממת מראש. להוסיף 2 מיליליטר של טריפסין-EDTA בקערה 60 מ מ. השתמש מלקחיים סטרילי כדי להרים את בלוק צילינדרים שכפול סטרילי, ומניחים בצלחת 60 מ מ. לאסוף את הצילינדרים המכיל טריפסין-EDTA ומניחים בעדינות על המושבות מסומן. ודא כי כל גליל שיבוט מכיל מושבה אחת בלבד ולהימנע זיהום עם המושבות הסמוכה.
  11. להחזיר את המנה החממה במשך 3 דקות.
  12. לאחר 3 דקות, לבדוק את התאים במיקרוסקופ בהגדלה X 10 כדי לראות אם הם להיות מנותק. כאשר התאים יש הרים, להוסיף כל גליל כדי להשבית את טריפסין μL 70 של תרבות בינוני. מערבבים בעדינות התליה תא עם פיפטה 200 μL. ודא כי לא להעביר את הצילינדר במהלך תהליך זה.
  13. העברה התליה תא מהמושבה לכל שתי צלחות 24-ובכן המכיל 1 מ ל DMEM לכל טוב. להוסיף 30 μL של התא השעיה לכל טוב בצלחת A, μL 70 ב המתאימה בארות בצלחת תווית ב' הלוחות כראוי ולשים אותם בחזרה בחממה.

2. אימות של הקו הסלולרי ביטוי DR3

  1. כאשר התאים בצלחת B ב- 90% הנהרות, מסיר את המדיה ולשטוף היטב את התאים עם 1 מ"ל ל- PBS. לחלוטין להסיר PBS ואת lyse התאים עם μL 50 1 x מאגר מרחביות-דף הטעינה. להעביר את lysates תא מהצלחת 24-ובכן 1.5 mL צנטריפוגה צינורות. והרתיחו הדגימות 10 דקות ב- 100 מעלות צלזיוס.
  2. הפעל את הדוגמאות על 10% נתרן dodecyl סולפט (מרחביות) ג'ל על מתח קבוע של 80 V למשך 15 דקות ואז,-120 V עבור 1 h.
  3. להעביר את החלבון קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene על ידי העברה רטוב-זרם קבוע של 400 אמא כבר שעתיים.
  4. לבחון את הביטוי DR3 שיבוטים שונים עם נוגדן אנטי-דגל, באמצעות התאים HT29 פראי-סוג כפקד שלילי (איור 1). לדלל את הנוגדן הראשי במקדם של 5,000 ב 5% חלב דל שומן הוא מומס TBST (תמיסת מלח באגירה טריס המכיל 0.1% Tween-20). דגירה הקרום עם דגל נוגדנים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. לשטוף את הקרום עם TBST ע י ניעור שלה על מטרף decoloring ב 200 סל ד-RT. רענן את TBST כל 5 דקות כולל שטיפת זמן של 15 דקות.
  6. דגירה הקרום עם העכבר נגד נוגדן משני מדולל לפי פקטור של 10,000 ב- 5% חלב דל שומן ב 4 ° C עבור 5-6 שעות.
  7. לשטוף את הקרום שוב כפי שמתואר בשלב 2.5.
  8. הביטוי הדגל באמצעות המצע chemiluminescence משופרת המערבי (ECL) ויוכל תמונה הקרום עם מערכת תיעוד ג'ל (ראה טבלה של חומרים). לזהות שיבוטים לבטא DR3 כמו שיבוטים חיובי.
  9. העברת השיבוטים בצלחת א שיתאימו שיבוטים חיובי בצלחת B כדי צלחת 6-ובכן, להמשיך להגביר את התאים עד לגידול במנות 10 ס מ. להפוך את מניות קפוא של תאי גידול מ שיבוטים חיובי ואחסן אותם ב- 80 ° C לשימוש עתידי.

3. הערכה של התגובה מוות של תאים לסוכנים Antimitotic

הערה: Diazonamide הוא סוג חדש של מוצר טבעי ימית בעלת פעילות יוצאת דופן עיכוב צמיחת תאים של סרטן, אשר מראות אחרים סוכנים יציב-טובולין21. עם זאת, אופן פעולתו עדיין לא ברור. כדי לבדוק את התגובה התאית של תאים לסוכנים antimitotic, פקליטקסל diazonamide שימשו לטיפול פראי-סוג HT29 תאים ותאים HT29-DR3. הסמים היו מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כדי להפוך את המניות 10 מ מ, לאחר מכן, בהמשך מדולל על ריכוזים שונים: 30 nM, 100 ננומטר, 300 ננומטר, 1,000 nM, 3,000 nM, ו 10,000 nM, דימתיל סולפוקסיד.

  1. איסוף תאים HT29 ו- HT29-DR3 על-ידי trypsinization. מודדים את צפיפות התא באמצעות מונה אוטומטי תא הניתן. לאחר מכן, זרע תאי הצלחות 12-טוב DMEM על צפיפות של תאים4 3 x 10 לכל טוב. למחרת, להוסיף 10 nM diazonamide ולהשתמש 1% דימתיל סולפוקסיד כפקד שלילי. לאחר 48 שעות של טיפול, תמונה התאים במיקרוסקופ בהגדלה X 10 (איור 2).
  2. זרעי HT29 ו- HT29-DR3 תאים ב 96-ובכן הצלחות DMEM-צפיפות של 3 x 103 תאים לכל טוב, לאפשר להם לצמוח בין לילה ב 37 º C. לאחר מכן, הוסף מנה הסלמה ריכוזי diazonamide 0.3 nM, 1 ננומטר, 3 ננומטר, 10 ננומטר, 30 nM, 100 nM כל טוב, באמצעות 1% דימתיל סולפוקסיד כפקד שלילי.
  3. לאחר 48 שעות של טיפול, למדוד את הכדאיות התא באמצעות ערכת assay הכדאיות תא מבוסס-הפריה חוץ גופית לפי הוראות היצרן.
    1. להוציא לצלחת 96-ובכן מן החממה, ב RT ומשהים כ 30 דקות. לאחר מכן, להוסיף 50 µL של ריאגנטים וזמינותו בכל טוב, לנער את הצלחת ב RT למשך 2 דקות כדי lyse התאים, דגירה את הצלחת ב RT עבור עוד 10 דקות לקבוע הפריה חוץ גופית של מכל קידוח באמצעות קורא microplate (איור 3).
      הערה: הכדאיות תא מייצג את עוצמת הארה היחסי של כל אחד שטוב יהיה זה של הפקד ליחס טוב עם דימתיל סולפוקסיד 1%.
  4. השתמש עכברים עירום נשי בן 6 שבועות BALB/c ויוו מחקר14.
    הערה: העכברים היו נשמרים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן.
    1. Trypsinize תא HT29, HT29-DR3, אז תפסיק את trypsinization באמצעות DMEM prewarmed ב 37 º C. לאסוף את התליה תא בשפופרת 50 מ ל ו centrifuge את התאים ב- 1,000 סל ד 10 דקות ב RT. להשליך תגובת שיקוע resuspend בגדר תא DMEM בינוני ללא FBS. Centrifuge התאים שוב, resuspend בגדר תא ב- PBS.
    2. לספור את התאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית ו לדלל את התאים כדי ריכוז של 2.5 x 107 תאים למ"ל באמצעות PBS. ליצור גידולים באמצעות זריקה תת עורית של 200 μL של התליה תא HT29 או HT29-DR3 באגף הימני של העכבר (5 x 106 תאים/עכבר) כל22.
    3. למדוד האחסון הגידול (טלוויזיה) באמצעות מחוגה כל d 2 לאחר ההשתלה. לחשב את הטלוויזיה באמצעות הנוסחה הבאה: טלוויזיה = 1 / 2L x ר x W (כאן, w: גידול רוחב, אורך l: הגידול). כאשר אמצעי האחסון הגידול הממוצע מגיע כ-100 מ מ3, אקראי העכברים לתוך הפקד או קבוצת מטופלים (n = 6 לכל קבוצה) וליזום את הטיפול.
    4. להכין את הפתרון פקליטקסל כדלקמן. ראשית, להמיס פקליטקסל לחלוטין באתנול ב-5% מהנפח הכולל, לאחר מכן, הוסף שמן קיק 5% נפח סופי של polyoxyl 35 מוקשה. לבסוף, לפצות ו 90% של אמצעי האחסון עם D5W (דקסטרוז 5% במים, pH 7.4).
    5. להזריק את פקליטקסל דרך הווריד במינון של 20 מ"ג/ק"ג 3 x בשבוע, למשך שבועיים. למדוד את הגידול נפח וגוף משקל 3 x בשבוע14. לסיים את הניסוי, המתת חסד החיות אם מקטינה משקל הגוף על-ידי 20% או אמצעי האחסון הגידול מגיע כ-2,000 מ מ3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אפיון של תאים HT29 stably לבטא DR3 מוצג באיור1. השיבוטים מביעים רמות משתנות של DR3, בעוד תאי פראי-סוג, אשר לשמש פקד שלילי, לא להראות ביטוי גנים אקסוגני. הנה אנחנו מראים רק שיבוטים חמש, ביניהם לשבט 1 ו- 5 express הרמה הגבוהה ביותר של DR3. בחרנו שיבוט 1 ו-5 על הניסויים הבאים.

המורפולוגיה של תאי HT29 ו- HT29-DR3 לאחר מתן של diazonamide נצפתה על ידי מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה X 10 באיור2. לאחר 48 שעות טיפול עם 10 nM diazonamide, HT29-DR3 הראה אפופטוזיס ברור, עם קרום התא שבור, שאריות תאים (פאנל התחתונה). עם זאת, HT29 הראתה רק מעצר mitotic עם תאים שלמים מפגין צורת עיגול תא (החלונית העליונה).

הכדאיות התא של תאי HT29 ו- HT29-DR3 לאחר הטיפול עם diazonamide מוצג באיור3. לאחר 48 שעות של טיפול עם 3 diazonamide ננומטר, מעל 80% מוות תאי נמצא ב- HT29-DR3 תאים (עיקול אדום). עם זאת, התאים HT29 הורים הפגינו רק תגובה קטנה diazonamide בצורה של מעצר mitotic (עיקול כחול). לפיכך, ביטוי של DR3 מחדש מסלול מוות diazonamide-induced בתאים אלה.

תוצאות הניסויים xenograft הגידול ויוו הוכחו נייר הקודם14. שיעור ההצלחה של הגידול השרשה הן HT29 והן HT29-DR3 היא 100%. הגידולים xenograft התקדמה באופן דומה בפקד הרכב; עם זאת, xenografts HT29-DR3 מוצגים רגרסיה הגידול מהר יותר מאשר xenografts HT29 כאשר מטופלים עם פקליטקסל במינון של 20 מ"ג/ק"ג. ההתבוננות שלנו מענה טוב יותר של גידולים HT29-DR3 פקליטקסל מזה של HT29 גידולים ויוו נוספת אישר כי ביטוי חוץ רחמי DR3 רינדור תאים סרטניים יותר רגישים antimitotics.

Figure 1
איור 1 : ניתוח של DR3 ביטוי שונה שיבוטים. רמות הביטוי DR3 נותחו על ידי סופג המערבי עם אנטי-דגל (החלונית העליונה), נוגדנים אנטי-גירסת ביתא-אקטין (פאנל התחתונה, כמו בקרה פנימית). הורים HT29 תאים שימשו כפקד שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : ניתוח המורפולוגיה של תאי HT29 ו- HT29-DR3 לאחר הטיפול עם diazonamide. HT29 (לוח העליון), HT29-DR3 (פאנל התחתונה) שטופלו diazonamide nM 10 במשך 48 שעות. פסי בקנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : עקומות מנה-תגובה של HT29 ו- HT29-DR3 לתאים diazonamide. תא הכדאיות נמדדה לאחר 48 שעות של טיפול עם טורי ריכוזים של diazonamide. קווי השגיאה = סטיית תקן (SD) של triplicates ניסיוני. DA = diazonamide. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כתב יד זה, אנו מתארים שיטה ליצירת שורות תאים יציב HT29-DR3. תאים HT29-DR3 מספקות מודל לימוד המנגנון המולקולרי שבאמצעותו DR3 תורמת אפופטוזיס המושרה על ידי סוכנים antimitotic. גישה זו היא תכליתי הדיר. כדי להבטיח ההצלחה של ההליך, ארבעה שלבים מרכזיים של הפרוטוקול צריך להיחשב. ראשית, על מנת לייצר גבוה מספיק כייל וירוס, מומלץ לבצע תרביות תאים DNA כאשר התאים Plat-A ב- 80% - 90% הנהרות. שנית, ההשעיה ויראלי לאחסנו ב 4 ° C עבור לא יותר מ 2 שבועות, מכוסה מהאור. שלישית, כאשר חלוקת התאים הנגועים מנות 150 מ מ, מומלץ לעשות דילולים טורי להגיע מושבות מופרדים היטב, היעילות זיהום משתנה בתאים שונים. לבסוף, כשלומדים שמושבה בודדת, שם לא צריך להיות כל זיהום עם המושבות שמסביב.

פרוטוקול זה עובד טוב עם רוב שורות תאים, אך עלולה להיות קשה עבור התאים אינם נוטים ליצור מושבות יחיד. במקרים כאלה, מיון תא טכניקות אחרות, כגון אנטיביוטיקה בשילוב עם תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS), יהיה צורך.

תרביות תאים יציבה כולל שיטות ויראלי והן נגיפי. ב פרוטוקול זה, השתמשנו זיהום retroviral ייצור תאים overexpressing DR3, הסקת מסקנות כי שיטות פיזיות, כגון אלקטרופורציה, רעילים יותר שיטות23 וכימי תאים, כגון בתיווך השומנים DNA-תרביות תאים, יש נמוך יעילות רבות תא סוגים ויש תופעות מחוץ-יעד פוטנציאליים24,25,26.

ביטוי חוץ רחמי היא דרך ישירה ויעילה התירי פונקציות גנים. לכן, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה ללמוד מולקולות אחרות היעד. יתר על כן, גנים חשובה גם במחקרים פונקציונלי, ייתכן כי הפרוטוקול יכול להיות מותאם למערכות תמונות ציפורים גנים. לעומת גנים טוק-in ומעלף גישות אחרות, כגון CRISPR-Cas9, פרוטוקול המוצג כאן הוא קל ליישום ובמחירים סבירים עבור כל המעבדות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש ריהצהל.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים 53110000117 (כדי G.W.) ו 043222019 (ל X.W.) מאוניברסיטת צינג.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen C11965500BT Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin
Luminescent Cell Viability Assay Promega G7571
Paclitaxel Selleck S1150
pMXs-IRES-Blasicidin Cell Biolabs RTV-016
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
PBS Invitrogen C14190500BT
Trypsin-EDTA (0.25%) Invitrogen 25200056
1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide Santa Cruz sc-134220
 Transfection Reagent Promega E2311
Anti-mouse secondary antibody Jackson ImmumoResearch 115-035-166
anti-Flag antibody Sigma F-3165
HT29 cell line ATCC HTB-38
plat-A cell line Cell Biolabs RV-102
PVDF Immobilon-P Millipore IPVH00010
Cloning Cylinder Sigma C1059
Cell Imaging Multi-Mode Reader Biotek BTCYT3MV
CKX53 Inverted Microscope Olympus CKX53
12-well cell culture plates Nest 712001
60 mm cell culture plates Nest 705001
15 mL centrifuge tubes Nest 601052
0.22 μm steril filter Millipore SLGP033RB
Centrifuge 5810 R Eppendorf 5810000327
96 Well White Polystyrene Microplate  Corning 3903
Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060
ImageQuant LAS 4000 GE Healthcare ImageQuant LAS 4000 
Decoloring Shaker  HINOTECH TS-2000A
Blasticidin InvivoGen ant-bl-1
Automated cell counter BIO-RAD TC 20
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher 31985070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  2. Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
  3. Daley, G. Q. Animal models of BCR/ABL-induced leukemias. Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).
  4. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
  5. Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
  6. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
  7. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
  8. Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
  9. Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
  10. Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
  11. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  12. Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
  13. Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
  14. Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
  15. Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
  16. Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
  17. Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
  18. Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
  19. Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
  20. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
  21. Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
  22. Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
  23. Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9, Unit9 3 (2010).
  24. Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
  25. Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
  26. Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).

Tags

חקר הסרטן גיליון 143 יציבה תא קו שמושבה בודדת זיהום retroviral רווח-של-פונקציה פקליטקסל antimitotic סרטן המעי הגס אפופטוזיס מוות קולטן 3
הקמת שורות תאים Overexpressing DR3 כדי להעריך את התגובה אפופטוטיים להיפגע הרפוי אנטי-mitotic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang , X., Zhou, J., Qi, C.,… More

Wang , X., Zhou, J., Qi, C., Wang, G. Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics. J. Vis. Exp. (143), e58705, doi:10.3791/58705 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter