Summary
Stabil celle linjen overexpressing en genet av interesse å studere gen funksjon kan gjøres av stabil transfection-plukking enkelt kloner etter transfecting dem via retroviral infeksjon. Her viser vi at HT29-DR3 cellelinjer generert på denne måten belyse mekanismer som død reseptor 3 (DR3) bidrar til antimitotics-indusert apoptose.
Abstract
Studere funksjonen til en genet av interesse kan oppnås ved å manipulere nivået av uttrykk, for eksempel redusere sitt uttrykk med knockdown linjer eller øke sitt uttrykk med overuttrykte linjer. Forbigående og stabil transfection er to metoder som ofte brukes for eksogene genuttrykk. Forbigående hva er bare nyttig for kortsiktige uttrykk, mens stabil transfection gir eksogene gener å bli integrert i vert celle genomet der det vil være kontinuerlig uttrykt. Som et resultat, er stabil transfection vanligvis ansatt for forskning i langsiktig genetisk regulering. Her beskriver vi en enkel protokoll for å generere en stabil cellen linje overexpressing merket død reseptor 3 (DR3) for utforske DR3 funksjon. Vi plukket enkelt kloner etter en retroviral infeksjon for å opprettholde homogenitet og renhet av de stabile linjene. De stabile cellelinjer generert ved hjelp av denne protokollen gjengi DR3 dårlig HT29 celler følsom for antimitotic stoffene, dermed gjenoppbygge apoptotisk svaret i HT29 celler. Videre flagg koden på DR3 kompenserer for utilgjengelighet av god DR3 antistoffer og muliggjør biokjemiske studiet av molekylære mekanismen som antimitotic agenter forårsake apoptose.
Introduction
Heterologous genuttrykk er ofte ansatt å studere funksjonen av gener av interesse. To metoder, forbigående og stabil transfection, prevalently brukes i celler og molekylærbiologi å sette inn et segment av DNA eller RNA i verten celle1,2. Transiently transfekterte DNA eller RNA kan ikke videreformidles til datter celler, så genetisk endring bare beholdes i en kort tidsperiode. På den annen side, i stabilt transfekterte celler, er eksogene gener integrert i vert celle genomet, opprettholde sitt uttrykk i cellen linje. Dermed er stabil transfection en metode som er vanligvis reservert for forskning på langsiktige genetisk regulering. Stabil celle linjen kan også være transplantert som xenografts til musen modeller in vivo studere3. Stabil transfection kan deles inn i to kategorier: virus- og nonviral. Sammenlignet med nonviral hva, kan virusinfeksjon overføre gener til et bredere utvalg av menneskelige celler med en høyere effektivitet4,5,6,7. Videre tilbyr en stabil cellen linje fra en enkel klone fordelen av homogenitet og klonal renhet.
Ukontrollert cellevekst og deling er de mest særtrekk av kreft. I kliniske innstillinger er antimitotic agenter de primære behandlingene for mange typer av svulster8. Men ikke kan noen betydelige begrensninger av antimitotic agenter ignoreres. Først disse chemotherapies også kan drepe normale celler med uønsket cancerous celler, og dermed kan føre til alvorlige bivirkninger8. Andre, antitubulin narkotika er ikke effektiv mot alle typer av svulster, til tross for tubulin's allestedsnærværende uttrykk i en rekke forskjellige vev som en cellen cytoskjelett proteiner9,10. Det er uklart hvorfor antitubulin agenter viste lovende effekt mot eggstokkene, lunge og Hematologisk kreft i klinisk behandling, men ikke i nyre, kolon eller pancreatic kreft11. Til slutt, selv pasienter med samme type svulst kan svare på antimitotics annerledes på en uforutsigbar måte. Det kan være en nøkkel effektor molekyl som påvirker følsomheten pasienter antimitotic agenter, som resulterer i ulike resultatene sett i klinisk behandling12. Dermed bør potensielle differensial problemområdene av pasienter til antimitotic behandling tas i betraktning for å optimalisere terapeutisk intervensjon13.
En høy gjennomstrømming hele-genome siRNA biblioteket skjermen vist at DR3 knockdown kan gjengi følsom celler motstandsdyktig mot antimitotic narkotika, implicating en rolle for DR3 i kjemoterapi-indusert apoptose14. Som medlem av tumor nekrose faktor reseptor (TNFR) gruppe, har DR3 blitt rapportert å megle celle apoptose i ulike systemer15,16,17,18. Derfor begynte vi for å etablere stabil linjer overexpressing DR3 for å studere molekylære mekanismer som antimitotic narkotika indusere apoptose. En riktig celle modell for å studere DR3 overuttrykte kan gis av menneskelig kolon kreft celle HT29, som ble funnet for å være DR3-mangelfull. I tillegg i klinikken, kolon kreft er ufølsom for antimitotic narkotika19.
I denne artikkelen beskriver vi en metode som tillater generering av en HT29-DR3 stabile cellen linje gjennom retroviral infeksjon. Videre viser vi hvordan å validere DR3 uttrykket i disse cellene med vestlige blotting og vurdere følsomheten til antimitotic agenter ved å bruke celle levedyktighet analysen og morfologiske observasjon. Cellene er forsterket fra enkelt kloner, og dermed har fordelen av en homogen genetisk bakgrunn. I tillegg tillatt flagg koden på DR3 for visualisering av mobilnettet DR3 mikroskopi og analyse av gene expression og protein samspillet av biokjemiske tilnærminger. Videre kan cellene xenografted i mus å analysere svulst progresjon svar på antimitotics i vivo14.
HT29-DR3 cellen systemet presenteres her tilbys et effektivt verktøy for å studere molekylære mekanismer av hvordan antimitotics drepe kreft celler14. Siden overuttrykte og pusse cellelinjer er vanlige verktøy for å studere gen funksjon, denne protokollen kan tilpasses enkelt andre gener severdigheter eller andre linjer, og dermed forvandlet til en mye brukt tilnærming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vær oppmerksom på at alle mus eksperimenter beskrevet her var godkjent og utført i henhold til institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Tsinghua University.
1. generasjon DR3 overuttrykte linjer
- Konstruere plasmider DR3 uttrykk (pMXs-IRES-DR3-flagg) ved å sette full lengde DR3 cDNA med 3 x flagg på C-terminus i retroviral vektor pMXs-IRES-Blasticidin ved begrensning BamHI/XhoI.
- Vokse Plat-A celler i 60 mm retter med 4 mL av Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM). Neste dag, når cellene nå 80-90% samløpet, transfect cellene med 2 μg plasmider pMXs-IRES-DR3-flagg bruker transfection reagens (se Tabell for materiale) i henhold til produsentens manuell20.
- Etter 72 h, samle nedbryting, Filtrer media bruker et 0,45 μm sterilt filter og holde viral suspensjon i mørket på 4 ° C.
- Vokse HT29 celler i DMEM i 60 mm parabol og ruge cellene på 37 ° C med 5% CO2.
- Neste dag, når cellene nå 30% - 50% samløpet, infisere cellene med 2 mL viral suspensjon i nærvær av 8 μg av 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide per milliliter viral suspensjon. Etter 4-6 h med inkubering på 37 ° C, Sug opp viral suspensjon, legge 4 mL av fersk DMEM og tilbake rett til inkubator.
- Forkaste media fra retter 24 h postinfection og nøye vask celler med 2 mL prewarmed PBS. Legg 1 mL av trypsin-EDTA til cellene og ruge ved 37 ° C i 3 minutter.
- Etter å observere under et mikroskop på 10 X forstørrelse som de fleste av cellene har løsrevet, stopp trypsinization med 2 mL av komplett DMEM som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS). Samle celle suspensjon i en 15 mL tube og sentrifuge cellene på 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
- Fjern nedbryting og resuspend celle pellet i 10 mL av DMEM. Bland godt av pipettering forsiktig opp og ned. Fortynne cellene av faktorer av 30, 100 og 300. Ætt cellene i 150 mm retter med 20 mL av DMEM som inneholder 1 µg/mL blasticidin. Ruge på en 37 ° C inkubator med 5% CO2 ~ 1-2 uker.
- I denne perioden, observere koloniene hver dag med en invertert mikroskopet på 10 X forstørrelse. Merk godt isolert koloniene i bunnen av parabolen når kolonien diameteren er ca 1-2 mm.
- Sug opp mediet og vask cellene med 3 mL forvarmes PBS. Legge til 2 ml trypsin-EDTA i en 60 mm rett. Bruk sterilt pinsetter for å plukke opp autoklaveres sterilt kloning sylindere, og plassere dem i 60 mm parabolen. Plukk opp sylindere som inneholder trypsin-EDTA og forsiktig sett merkede koloniene. Kontroller at hver kloning sylinder bare inneholder en koloni og unngå forurensning med nærliggende kolonier.
- Tilbake retten til inkubator i 3 minutter.
- Etter 3 min, når cellene under mikroskopet på 10 X forstørrelse å se om de har frittliggende. Når cellene har løftet opp, legge 70 μL kultur medium til hver sylinder å deaktivere trypsin. Bland forsiktig celle suspensjon med en 200 μL pipette. Pass på ikke å flytte sylinderen under denne prosessen.
- Overføre celle suspensjon fra hver koloni til to 24-vel plater som inneholder 1 mL av DMEM per brønn. Legge til 30 μL celle suspensjon per brønn i en og 70 μL i tilsvarende brønner i plate B. etiketten platene riktig og sette dem tilbake i inkubator.
2. bekreftelse av DR3 overuttrykte celle linje
- Når cellene i plate B på 90% samløpet, fjerne media og nøye vask cellene med 1 mL av PBS. Fjerne PBS og lyse cellene med 50 μL av 1 x SDS-lasting buffer. Overføre celle lysates fra 24-vel platen til 1,5 mL sentrifuge rør og kok prøvene i 10 minutter ved 100 ° C.
- Kjøre prøver på 10% natrium dodecyl sulfate (SDS) gel med en konstant spenning på 80 V i 15 min, og deretter på 120 V 1t.
- Overføre protein til en polyvinylidene fluor (PVDF) membran av våt overføring på en konstant strøm av 400 mA for 2T.
- Test DR3 uttrykket i forskjellige kloner med anti-flagg antistoff, med vill-type HT29 cellene som en negativ kontroll (figur 1). Fortynne det primære antistoffet med en faktor på 5000 i 5% nonfat melk som oppløses i TBST (Tris-bufret saline 0,1 prosent Tween-20). Inkuber membranen med flagg antistoff ved 4 ° C over natten.
- Vask membranen med TBST ved å riste det på en decoloring shaker på 200 rpm på RT. Oppdater TBST hver 5 min totalt vaske tid på 15 min.
- Inkuber membranen med anti-musen sekundære antistoff fortynnet med en faktor på 10 000 på 5% nonfat melk på 4 ° C for 5-6 h.
- Vask membranen igjen som beskrevet i trinn 2.5.
- Oppdage flagg uttrykket i vestlige forbedret chemiluminescence (ECL) substrat og image membranen med en gel dokumentasjonen (se Tabell for materiale). Identifisere kloner uttrykke DR3 som positive kloner.
- Overføre kloner i en som tilsvarer positiv kloner tallerken B til en 6-vel plate og fortsette å forsterke cellene til voksende dem i 10 cm retter. Lage frosne aksjer cellene vokser fra positiv kloner og lagre dem på-80 ° C for fremtidig bruk.
3. vurdering av apoptotisk svaret celler Antimitotic agenter
Merk: Diazonamide er en ny klasse av marine naturlig produkt som har bemerkelsesverdige aktivitet i hemme kreft cellevekst, som gjenspeiler andre tubulin-destabiliserende agenter21. Modus for handlingen er imidlertid uklart. For å teste mobilnettet svaret celler antimitotic agenter, ble paklitaxel og diazonamide brukt til å behandle vill-type HT29 cellene og HT29-DR3. Narkotika ble oppløst i dimethyl sulfoxide (DMSO) å gjøre 10 mM aksjer, og deretter videre utvannet til ulike konsentrasjoner: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1000 nM, 3000 nM og 10 000 nM i DMSO.
- Samle inn HT29 og HT29-DR3 celler ved trypsinization. Måle celle tettheten ved hjelp av en automatisk celle teller. Deretter frø cellene i 12-vel plater i DMEM på en tetthet av 3 x 104 celler per brønn. Neste dag, legger 10 nM diazonamide og bruker 1% DMSO som en negativ kontroll. Etter 48 timer av behandlingen, bilde cellene under et mikroskop på 10 X forstørrelse (figur 2).
- Frø-HT29 og HT29-DR3 celler i 96-brønnen plater i DMEM på en tetthet av 3 x 103 celler per brønn og tillate dem å vokse over natten på 37 ° C. Legg deretter til dose økende diazonamide konsentrasjoner av 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM og 100 nM i hver brønn, med 1% DMSO som en negativ kontroll.
- Etter 48 timer av behandlingen, kan du måle celle levedyktigheten bruker en luminescence-baserte celle levedyktighet analysen kit i henhold til produsentens håndbok.
- Ta ut platen 96-brønns settefiskanlegg og la den stå på RT i ca 30 min. Deretter legge til 50 µL av analysen reagenser i hver brønn, riste platen på RT i 2 minutter til lyse cellene og ruge platen på RT i en annen 10 min. fastslå luminescence i hver brønn ved hjelp av en microplate reader (Figur 3).
Merk: Cellen levedyktigheten representerer relativ luminescence intensiteten av hver godt til for kontrollen godt behandlet med 1% DMSO.
- Ta ut platen 96-brønns settefiskanlegg og la den stå på RT i ca 30 min. Deretter legge til 50 µL av analysen reagenser i hver brønn, riste platen på RT i 2 minutter til lyse cellene og ruge platen på RT i en annen 10 min. fastslå luminescence i hver brønn ved hjelp av en microplate reader (Figur 3).
- Bruk seks uker gamle kvinnelige BALB/c naken mus for en i vivo studie14.
Merk: Mus ble opprettholdt ved bestemte patogen uten betingelser.- Trypsinize HT29 og HT29-DR3-cellen, og deretter stoppe trypsinization bruker DMEM prewarmed på 37 ° C. Samle celle suspensjon i en 50 mL tube og sentrifuge cellene på 1000 rpm for 10 min på RT. Forkast nedbryting og resuspend celle pellet i DMEM medium uten FBS. Sentrifuge cellene igjen og resuspend celle pellet i PBS.
- Telle celler ved hjelp av en automatisk celle teller og fortynne cellene til en konsentrasjon av 2.5 x 107 celler/mL med PBS. Generere svulster gjennom en subcutaneous injeksjon av 200 μL av HT29 eller HT29-DR3 celle suspensjon i høyre flanke hvert mus (5 x 106 celler/mus)22.
- Måle svulst volumet (TV) med calipers hver 2 d etter transplantasjon. Beregne TV ved hjelp av følgende formel: TV = 1 / 2L x b x W (her, W: svulst bredde, L: svulst lengde). Når gjennomsnittlig svulst volumet når ca 100 mm3, tilfeldig musene i kontrollen eller gruppen behandlet (n = 6 per gruppe) og starte behandling.
- Forbered den paklitaxel løsningen som følger. Først oppløse paklitaxel helt i etanol på 5% av det totale volumet, og deretter legge til 5% av det siste bindet polyoxyl 35 hydrogenert ricinusolje. Til slutt, utgjør de resterende 90% av volumet med D5W (5% druesukker i vann, pH 7.4).
- Injisere paklitaxel intravenøst på en dose av 20 mg/kg 3 x per uke i to uker. Måle svulst volum og kroppen vekt 3 x en uke14. Avslutte eksperimentet og avlive dyrene hvis kroppsvekten reduseres med 20% eller svulst volum når rundt 2000 mm3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakteristikk av HT29 celler uttrykke stabilt DR3 er vist i figur 1. Kloner uttrykke varierende grad av DR3, mens de vill-type cellene, som fungerer som en negativ kontroll, ikke viser eksogene genuttrykk. Her viser vi bare fem kloner, hvorav klone 1 og 5 uttrykke høyeste DR3. Vi valgte klone 1 og 5 for følgende eksperimenter.
Morfologi av HT29 og HT29-DR3-cellene etter administrasjon av diazonamide ble observert av en invertert mikroskopet på 10 X forstørrelse i figur 2. Etter 48 timer behandling med 10 nM diazonamide viste HT29-DR3 åpenbare apoptose, brutt cellemembranen og celle rusk (nedre panelet). Men viste HT29 bare mitotisk arrestasjonen intakt cellene viser en oppsummering celle figur (topp panel).
Cellen levedyktigheten til HT29 og HT29-DR3-cellene etter behandling med diazonamide er vist i Figur 3. Etter 48 timer av behandling med 3 nM diazonamide, over 80% celledød ble funnet i HT29-DR3 celler (rød kurve). Foreldre HT29 cellene viste imidlertid bare en liten respons til diazonamide i form av mitotisk arrest (blå kurve). Dermed rekonstituert overuttrykte DR3 diazonamide-indusert apoptotisk veien i disse cellene.
Resultatene for i vivo svulst xenograft eksperimenter har vist i en tidligere papir14. Suksessen er av svulst implantasjon for både HT29 og HT29-DR3 100%. Xenograft svulster kommet tilsvarende i kjøretøy kontrollen. HT29-DR3-xenografts vises imidlertid raskere tumor regresjon enn HT29 xenografts når behandlet med paklitaxel på en dose av 20 mg/kg. Våre observasjon av en bedre svar av HT29-DR3 svulster paklitaxel enn HT29 svulster i vivo ytterligere bekreftet at ektopisk uttrykk for DR3 gjengir kreftceller mer følsomme for antimitotics.
Figur 1 : Analyse av DR3 uttrykk i ulike kloner. DR3 uttrykk nivåer ble analysert av vestlige blotting med anti-FLAGGET (topp panel) og anti-beta-utgangen antistoffer (nedre panelet, som en intern kontroll). Foreldre HT29 celler ble brukt som en negativ kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Morfologi analyse av HT29 og HT29-DR3 celler etter behandling med diazonamide. HT29 (topp panel) og HT29-DR3 (nedre panelet) ble behandlet med 10 nM diazonamide 48 h. Skala barer = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Dose-respons kurver av HT29 og HT29-DR3 cellene diazonamide. Cellen levedyktighet ble målt etter 48 timer av behandling med føljetong konsentrasjoner av diazonamide. Feilfeltene = standardavviket (SD) for eksperimentell triplicates. DA = diazonamide. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet beskriver vi en metode for å generere HT29-DR3 stabile linjer. HT29-DR3 celler gir en modell for å studere molekylære mekanismer som DR3 bidrar til apoptose indusert av antimitotic agenter. Denne tilnærmingen er allsidig og repeterbare. For å sikre suksess for prosedyren, må fire sentrale trinn av protokollen vurderes. Først, for å produsere en høy nok virus titer, det anbefales å utføre DNA transfection når Plat-A cellene på 80-90% samløpet. Andre bør viral suspensjon lagres på 4 ° C for ikke lenger enn 2 uker, dekket av lys. Tredje Når dele de infiserte cellene i 150 mm retter, anbefales det å gjøre føljetong fortynninger å få godt atskilt kolonier, som infeksjon effektiviteten varierer i ulike celler. Til slutt, når plukke opp en enkelt koloni, det bør ikke være noen forurensning med omkringliggende koloniene.
Denne protokollen fungerer godt med de fleste cellelinjer, men kan være vanskelig for celler som ikke pleier å danne enkelt kolonier. I slike tilfeller vil andre celle-sortering teknikker, for eksempel antibiotika kombinert med fluorescens-aktivert celle sortering (FACS), være nødvendig.
Stabil transfection inkluderer både viral og ikke-viral. I denne protokollen brukt vi en retroviral infeksjon å generere celler overexpressing DR3, argumentasjon at fysiske metoder, for eksempel electroporation, er mer giftig for celler23 og kjemiske metoder, for eksempel lipid-formidlet DNA-hva, har en lav effektivitet i mange celle typer og har potensielle off-målet effekter24,25,26.
Ektopisk uttrykket er en direkte og effektiv måte å belyse genet funksjoner. Denne protokollen kan derfor brukes til å studere andre målmolekyler. Videre genet knockdown er også viktig i funksjonelle studier, og det er mulig at protokollen kan tilpasses til genet knockdown systemer. Sammenlignet med andre gene knock-i og knock-out tilnærminger, slik som CRISPR-Cas9, er protokollen presenteres her enkel å bruke og rimelig for alle laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å fortolle.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd 53110000117 (til GW) og 043222019 (til X.W.) fra Tsinghuauniversitetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q.
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R.
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
