Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Immunfärbung von rektalen Absaugbiopsien für Calretinin, S100-Protein und Protein-Genprodukt 9.5. Diese neuartige Adjuvan-Diagnostik für Hirschsprungs Krankheit hat bevorzugt Empfindlichkeits-und Spezifitätsraten.
Abstract
Hirschsprungs Krankheit (HD) ist eine angeborene Darmerkrankung, die sich klinisch als Unfähigkeit manifestiert, Mekonium bei Säuglingen oder als langfristige Verstopfung bei Kindern zu passieren. Die Rectal-Saugbiopsie (RSB) zur Bestimmung des Fehlens von Ganglienzellen und der neuronalen Hypertrophie ist derzeit der genaueste Test für die Diagnose von HD. Der traditionellen Hämatoxlin-Eosin-Färbung fehlt es an Sensibilität und Spezifität. Die Acetylcholinesterase-Färbung kann aufgrund ihres komplexen Prozesses nicht weit verbreitet sein. Unser neuartiges Protokoll der Immunfärbung für Kalretinin, S100-Protein und Protein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5), das wir an RSBs durchgeführt haben, weist hohe Empfindlichkeits-und Spezifitätsraten von 96,49% (95% Vertrauensintervall, 0,88-0,99) und 100% (95% Zuversicht auf Intervall, 0,97-1.00), bzw. Die HD-betroffenen Segmente treten oft als das Fehlen des Ausdrucks von Calretin, S100-Protein und PGP9.5 auf, die Marker der neuronalen Hypertrophie im submukosmischen Gewebe sind. Dieses Protokoll beschreibt den detaillierten Arbeitsprozess dieser neuen Diagnosemethode.
Introduction
Hirschsprungs Erkrankung (HD) ist eine häufige angeborene Darmdarmstörung, die durch einen Mangel an Ganglienzellen in verschiedenen Segmenten des distalenDarms 1 gekennzeichnet ist. Das menschliche, enterische Nervensystem entsteht, wenn die Invasion der embryonalen Zellen abgeschlossen ist. Wenn es eine Störung des Prozesses gibt und die Invasion nicht abgeschlossen ist, wird der Distanzdarm des Neugeborenen aganglionisch2. Dieser potenziell tödliche Zustand wird Hirschsprungs Krankheit genannt. Verbreitung, Beweglichkeit und Darmwachstum sind die drei Hauptbestandteile einer erfolgreichen Kolonisierung.
Die traditionelle Hämatoxylin und Eosin (H & E) kann eine begrenzte submukosmale Biopsie nicht so zufriedenstellend erreichen wie die H-& E-Färbung eines aus der Operation gewonnenen Volldickengewebes. Darüber hinaus ist die Acetylcholinesterase (AChE) Färbung des rektalen Sauggewebes theoretisch eine Herausforderung, da die Empfindlichkeit von 91% nicht ausreichend ist, unddie komplexe Verarbeitung der gefrorenen Abschnitte3,4. Mehrere andere immunhistochemische Marker von Ganglienzellen und Nervenfasern, die in formalinfixierten und paraffin-eingebetteten Proben verfärbt werden können, werden nach und nach zur Mainstream-HD-Diagnostik. Calretinin ist ein Vitamin D-abhängiges Kalziumbindenprotein, das sich nicht im myenterischen und submukosmischen Plexus von HD-betroffenenSegmenten 5 ausdrückt. S100-Protein wird in Zellen ausgedrückt, die aus dem neuronalen Kamm abgeleitet werden, wie Nervenfasern und Gliazellen, die im Submukosmonalgewebe der HD-betroffenenSegmente 6 oft neuronale Hypertrophie aufweisen. Protein-Gen-Produkt 9.5 (PGP9.5) verfärbt zuverlässig Nervenfasern und Ganglienzellen; Die PGP9.5-Färbung dient als Ergänzung zur Kalretinin-Färbung, insbesondere bei isolierter Hypoganglionose. Doppelfärbung mit S100 und PGP9.5 kann die Falsch-Negativrate senken und die Empfindlichkeit erhöhen. Als Voraussetzung ist, dass die aktuelle Studie eine ausreichende Spezifität und hohe Empfindlichkeit dieser neuartigen Diagnostik gewährleisten soll. Unser neuartiges Protokoll verwendete alle drei Marker für die Diskriminierung von aganglionischen Darm und hypertrophen Nervenfasern. Eine prospektive Studie mit 318 Kindern wurde von unserem Labor durchgeführt und zuvor ohne ein detailliertes Protokoll7veröffentlicht. Das detaillierte Protokoll und die Vorsichtsmaßnahmen werden in diesem Artikel diskutiert. Alle Neugeborenen, die seit der Geburt an einem schweren Defekationsproblem litten, oder Kinder mit chronischer Verstopfung, die andere Volkskrankheiten ausgrenzend ausgrenzten, sind potenzielle Kandidaten für die rektale Saugbiopsie (RSB). Unser neuartiges Protokoll eignet sich zur Färbung nicht nur von RSBs, sondern auch zur Färbung von Biopsien oder chirurgischen Proben, um eine endgültige Diagnose zu stellen.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde vom Research Ethics Board des Union Hospital of Huazhong University of Science and Technology genehmigt.
1. Rectal Suction Biopsie
- Führen Sie die rektale Saugbiopsie durch einen gut ausgebildeten Kinderchirurgen und einen Assistenten mit einem Rbi2-Saugbiopsiesystem durch, nachdem Sie vom Vormund eine informierte Einwilligung erhalten haben.
- RSB bei Patienten durchführen, die folgende Indikationen haben: Unfähigkeit, Mekonium bei Säuglingen zu passieren oder Langzeitspeißen mit oder ohne Verstopfung bei Kindern; Kinder mit langfristiger Verstopfung, die Paraffinöl benötigen, um die Entschärfung zu vollenden; Darm-Behinderung oder Darmperforation mit unbekannten Gründen bei Kindern, die sich einer Enterostomie unterziehen.
Hinweis: Die Kontraindikationen für die RSB sind wie folgt: Kinder, die schwere Symptome haben, die in einem schlechten körperlichen Zustand sind oder die RSB nicht tolerieren können; Kinder mit Akute-Stadium Enterocolitis; Kinder, die sich einer Darmerastomose unterziehen, ohne vollständige Heilung.
- RSB bei Patienten durchführen, die folgende Indikationen haben: Unfähigkeit, Mekonium bei Säuglingen zu passieren oder Langzeitspeißen mit oder ohne Verstopfung bei Kindern; Kinder mit langfristiger Verstopfung, die Paraffinöl benötigen, um die Entschärfung zu vollenden; Darm-Behinderung oder Darmperforation mit unbekannten Gründen bei Kindern, die sich einer Enterostomie unterziehen.
- Führen Sie einen normalen Salzrückhalteeinlauf als Darmaufbereitung 36 h vor dem Eingriff, um lose Stühle und übermäßige Ödeme der Schleimhaut zu vermeiden. Fügen Sie Magnesiumsulfat-Lösung hinzu, wenn das Kind eine schwere Verstopfung hat. Administer Vitamin K (1 mg/kg) zu Neonaten.
Hinweis: Führen Sie keine präoperativen Bluttests durch oder verabreichen Sie Antibiotika, da sie nicht erforderlich sind. - Setzen Sie den Patienten in die Lithotomie-Position. Die Oberfläche der Röhre mit Paraffinöl bedecken. Legen Sie das unverblümte Rohr 4-7 cm in das Rektum mit dem Seitenloch, das den hinteren oder seitlichen Wänden zugewandt ist.
- Tragen Sie einen sanften Druck auf das Rohr auf, um eine ausreichende Haftung des Seitenlochs an der Rectalwand zu ermöglichen. Drücken Sie den Auslöser und ziehen Sie das Werkzeug sofort ab.
- Mit dem Biopsie-Instrument erhalten Sie 4 Saugbiopsien mit einem Durchmesser von 2 mm bei 3 cm und 6 cm über der Dentallinie, anteriorisch und posteriorly. Verwenden Sie eine Nadel, um das Exemplar auf mit Salz befeuchtete Gaze zu legen.
- Beobachten Sie den Patienten bis 2 Stunden nach dem Eingriff, um rektale Blutungen auszuschließen. Vermeiden Sie weitere rektale und anale Manipulationen in den ersten 24 Stunden nach RSB.
2. Vorbereitung der RSB-Sektionen
- Legen Sie die rektalen Saugbiopsien in 4% Paraformaldehyd für 6 h, um das Gewebe zu fixieren. Verwenden Sie ein fixiertes Volumen 5-mal mehr als das Gewebevolumen.
- Das Gewebe mit dem pathologischen Gewebedehydrierung für 11 Stunden entflehen. Der gesamte programmierte Prozess besteht aus den folgenden 5 Schritten:
- Das Gewebe in Formaldehyd legen und 1 Stunde fixieren.
- Das Gewebe in 75% Ethanol für 4 Stunden legen.
- Legen Sie das Gewebe in absolutes Ethanol (zwei Änderungen, je 1 h).
- Legen Sie das Gewebe in absolutes Ethanol (zwei Änderungen, je 30 min).
- Legen Sie das Gewebe in Xylol (drei Änderungen, je 1 h).
- Das Gewebe in Paraffinwachs (58-60 ° C) (drei Änderungen, je 1 h) geben. Das RSB-Gewebe in Paraffinblöcke einbetten.
- Schneiden Sie die Paraffinblöcke mit einem Mikrotom, bis das Gewebe vollständig mit einer kompletten Sektionsebene freigelegt ist.
- Die Blöcke mit einem Mikrotom in 0,4 μm schneiden.
- Legen Sie die Abschnitte für jeweils einige Sekunden in 45-50 ° C Wasser, damit sich die Abschnitte in eine flache Platte ausbreiten können.
- Übertragen Sie die Paraffinabschnitte auf Folien.
- Die Dias in einem 60 ° C-Ofen 3-5 h backen. Vermeiden Sie zu lange Backen, was zum Verlust der Antigene führen kann.
- Die abgefessten Dias in Xylol (2 Änderungen, je 15 min) geben.
- Die Folien in absolutes Ethanol, 95%, 80% und 75% Ethanol für jeweils 5 min anfeueren. Dann in Umkehrosmose (RO)-Reinigtes Wasser für weitere 5 min spülen.
3. Antigen Retrieval
- Machen Sie Arbeitsverdünnungen für die Calretinin-Abfrage, indem Sie 4 mL EDTA-Antigen-Abholpuffer mit 200 ml RO-Reinigungswasser mischen. Machen Sie Arbeitsverdünnungen für S100 und PGP9.5 Abruf, indem Sie 1 ml Natriumcitrat-Puffer (100x) mit 99 ml RO-Reinigungswasser mischen.
Hinweis: Calretinin kann bevorzugt über EDTA Retrieval abgerufen werden. Allerdings eignet sich der Natriumcitrat-Puffer aus der Zitronensäure eher für die Rückgewinnung von S100 und PGP9.5. - Legen Sie die Dias in ein Coplin-Färtedgefäß. Füllen Sie das Glas mit Abhollösung und legen Sie es in ein vorgeheiztes kochendes Wasserbad. Nach dem Kochen für 20 Minuten, entfernen Sie das Glas aus dem Wasserbad und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen. Der Abkühlvorgang dauert ca. 10 Minuten. Entfernen Sie die Dias und spülen Sie sie mit phosphatgepufferter Saline (PBS).
- Zeichnen Sie einen Kreis mit einem Marker-Stift um das Gewebe und bereiten Sie eine Nassbox für die folgenden Verfahren vor.
4. Blocking
- Machen Sie Arbeitsverdünnungen, indem Sie 3 ml von 30% H2O2 mit 27 ml RO-Reinigungswasser mischen.
- Zwei oder drei Tropfen von 3% H2O2 Lösung dropwise auf das Gewebe legen, um Peroxidate zu blockieren. Fügen Sie die H2O2-Lösung umgehend hinzu, um sicherzustellen, dass die Lösung nicht aus dem Kreis überlaufen wird. Führen Sie die Blockierung von Peroxidaten in einem 37 ° C Inkubator für 20 Minuten.
- Spülen Sie die Dias sanft mit PBS (drei Waschmaschinen, je 5 min).
- Die Dias 20 min bei 37 ° C mit 5% Rinder-Serumalbumin (BSA, hergestellt durch Mischen von 1,5 g BSA-Pulver mit 30 ml RO-Reinigungswasser) blockieren.
Hinweis: Das Blockieren mit 3% H2O2 kann 95% der unspezifischen Färbung und Sperrung mit 5% BSA verhindern, die anderen 5% der unspezifischen Färbung. Kombinieren Sie die beiden Methoden, um ein zuverlässiges Ergebnis zu erzielen.
5. Antigen-Antikörperreaktion
- Entfernen Sie die 5% BSA und fügen Sie 50 μL des primären Antikörpers (Calretinin, S100 oder PGP9.5) in das Dia. Über Nacht bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Folie mit PBS (dreimal, 3 min).
- 50 μL Polymerverstärker (Reagenz A; siehe Materialtabelle) in den Abschnitt gebenund 20 Minuten in einem 37 ° C-Inkubator inkubieren. Dann die Folie mit PBS waschen (dreimal, je 3 min).
- 50 μL sekundärer Antikörper B (Ziege Anti-Kanonnrabbit/Maus IgG sekundärer Antikörper) in den Abschnitt und Inkubat für 30 Minuten in einem 37 ° C Inkubator. Waschen Sie den Abschnitt mit PBS (dreimal, 5 min).
6.3, 3-Diaminobenzidin und Hematoxylin Staining
- 850 μL RO-Reinigungswasser zu einem 1,5 mL Rohr hinzufügen und die Färbereagenzien (siehe Materialtabelle) in die Reihenfolge A, B und C. Addieren Sie 50 μL jedes Reagenzes, um insgesamt 1 ml 3,3-Diaminobenzid (DAB) Arbeitslösung zu erhalten. Wenn es Niederschläge gibt, verwenden Sie die Lösung nach der Filtration.
- Fügen Sie einen Tropfen DAB-Arbeitslösung in den Gewebeabschnitt und flecken Sie 3-10 min auf. Inkubieren Sie die Dias in DAB bei Raumtemperatur, bis eine braune Färbung festgestellt wird. Überwachen Sie sorgfältig mit einem Lichtfeld-Mikroskop. Halten Sie die DAB-Arbeitslösung vom Licht fern. Dann die Rutsche mit PBS für 5 min waschen.
- Fügen Sie einen Tropfen Hämatoxylin hinzu, um die Kerne für etwa 1 Minute zu kontern. Dann das Coplin-Glas halten und unter einem Wassertropfen für ca. 30-40 s waschen, bis der überschüssige Farbstoff entfernt ist. Achten Sie darauf, dass die Gewebeabschnitte nicht beschädigt werden.
- Tauchen Sie die RSB-Folien in ein Coplin-Glas mit PBS für 25-30 s. Dann in 1% hydrochlorhaltigen Ethanol für 10 s unterschieden. Die Folien mit PBS für 1 min waschen.
- Die Dias in der umgekehrten Feuchtigkeitsreihenfolge entflehen: 75%, 80%, 95% und absolutes Ethanol (je 5 min).
- Die Dias mit Xylol aussetzen (2 Änderungen, je 5 min).
- Montieren Sie den Küsgchen mit ultrakleer Montage. Lassen Sie Dias vor der Visualisierung mit Hilfe eines Mikroskops trocknen.
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Representative Results
Insgesamt waren 318 Patienten in unsere Studie aufgenommen worden. Alle Patienten unterliefen RSB, und das Gewebe wurde für Calretinin, S100 und PGP9.5 gefärbt. Die Diagnose, die auf unserem neuartigen Protokoll basiert, war HD in 97 Fällen, Nicht-HD in 213 Fällen und Verdacht HD in 8 Fällen. Unter den 132 chirurgischen Patienten wurden 99 Patienten nach der Operation durch Immunfärbung von Volldickenproben mit HD diagnostiziert. Die Färbung der S100 und PGP9.5 zeigte, dass 92% bzw. 93% der 99 Patienten Nervenstämme hypertrophiert hatten. Die anderen 83 der 186 Patienten unterliefen Volldickenbiopsien und zeigten Ganglienzellen. Insgesamt 103 Patienten wurden von konservativen Therapien klinisch geheilt, HD wurde ausgeschlossen. Von den 8 Patienten mit Verdacht auf HD wurden 3 Patienten als Kurzsegment HD und die anderen 5 Patienten als non-HD eingestuft.
Nach unseren Ergebnissen wurden zunächst 97 Patienten von der RSB diagnostiziert. Detaillierte Informationen finden Sie in Tabelle 1. Das Protokoll der immunhistochemischen Färbung für Calretinin, S100 und PGP9.5, das wir auf RSB durchgeführt haben, hat eine hohe Empfindlichkeit und Spezifitätsraten von 96,49% (95% Vertrauensintervall [CI], 0,88-0,99) bzw. 100% (95% CI, 0,97-1,00). Der positive Vorhersagewert liegt bei 94,3% (95% CI, 0,87-0,99), der negative Vorhersagewert bei 99,1% (95% CI, 0,95-1,00).
Die Abbildung 1A und 1B stellen typische Ergebnisse nach der Immunfärbung für Kalretinin dar. Viele Ganglienzellen, die Kalretinin ausdrücken, finden sich im normalen Gewebe. Allerdings wurden in keinem Bereich des Gewebes aus dem HD-Segment Ganglienzellen nachgewiesen. Wie in Abbildung 1C-F, S100 und PGP9.5 Immunfärbung gezeigt wird, zeigen hypertrophierte Nervenstämme in der Subschleimhaut, während im normalerweise erdförmigen Darm nur eine granulare Färbung einiger kleiner Nervenzweige beobachtet wurde. Hypertrophe Nervenstämme sind in unserer Studie Nervenfasern mit einem Durchmesser von 40 μm.
Abbildung 1: Immunfärbung von rektalen Saugbiopsien für Calretinin, PGP9.5 und S100. Immunfärbung für Kalretinin im HD-betroffenen Gewebe (A) und in Ganglienzellen myenterischer Plexus im normalerweise gepolsterten Gewebe (B). In den myenterischen Plexen des HD-betroffenen Segments wurde keine Kalretininfärbung festgestellt. Die PGP9.5-Färbung im HD-betroffenen Gewebe zeigte im Gegensatz zu Nervenfasern im normalen Gewebe (D) dichte hypertrophische Nervenfasern in der Subschleimhaut (C). (E) Die dichte und prominente S100-Immunfärbung zeigte hypertrophe Nervenstämme in der Subschleimhaut des HD-betroffenen Gewebes. (F) Normale Nervenfasern in der Subschleimhaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Eiweißmarker | HD-99) | Non-HD-219) | ||
| Ganglienzellen (+) | Hypertrophe Nervenstämme (+) | Ganglienzellen (+) | Hypertrophe Nervenstämme (+) | |
| Calretinin | 2 | — | 214 | — |
| S100 | — | 91 | — | 3 |
| PGP9.5 | — | 92 | — | 4 |
Tabelle 1: Immunhistochemische Färbung für die drei Proteinmarker in rektalen Saugbiopsien.
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Discussion
Hier beschrieben wir ein Verfahren mit drei verschiedenen immunhistochemischen Antikörpern, um RBS-Abschnitte für die Diagnose von HD zu verfärben. Die Empfindlichkeit unseres Diagnoseprotokolls betrug 96,49% (95% CI, 0,88-0,99), und die Spezifität lag bei 100% (95% CI, 0,97-1,00).
Die kritischsten Schritte des Protokolls sind die RSB-und Antigen-Antikörper-Reaktion. Die Größe der Biopsie bestimmt die Genauigkeit der Färbung. Eine kleine Biopsie liefert nicht genügend Gewebe, um eine genaue Diagnose zu stellen, während eine große Biopsie zu einem höheren Risiko für Blutungen führt. Erfahrungsgemäß sind Biopsien mit einem Durchmesser von 2 mm die optimale Größe. Für die Antigen-Antikörperreaktion kann die richtige Konservierung des Antikörpers nicht ignoriert werden. Nach dem Protokoll werden Schritt für Schritt und schonend gearbeitet. Das umgekehrte, mit osmossengereinigtem Wasser gereinigte Wasser wird in allen Schritten empfohlen, was ein klareres Feld für die Beobachtung ermöglicht und es Pathologen erleichtert, eine genaue Diagnose zu stellen.
Kontrasteinlauf, Anorekalmanometrie und Biopsie mit Histologie sind drei präoperative Diagnosemethoden, die in den letzten Jahren eingesetzt wurden. Laut Takawira et al.' Die Forschung, Biopsie mit Histologie hat die höchste Empfindlichkeit und Spezifität8. Meier-Ruge et al. berichtete zuerst über die Verwendung von Acetylcholinesterase (AChE), die auf gefrorenem rektalen Sauggewebefärbt, um bei der Diagnose HD 1972 zu helfen. Diese Färbemethode erkennt hypertrophische Nervenstämme in der Submucosa. Nach diesem Bericht begannen viele Institutionen auf der ganzen Welt, diese Methode als Ergänzung zur Diagnose von HD zu verwenden. Aufgrund ihrer diagnostischen Einschränkungen begannen die Forscher, sich auf andere Marker zu konzentrieren, die auch die Ganglienzellen und Nervenfasern in Formalin-fixierte und paraffin-eingebettete Exemplare. Im Jahr 2004 fand Barshack et al. heraus, dass der Verlust des Calretinin-Ausdrucks dazu beitragen kann, aganglionische Segmente in HD10zu diagnostizieren. Kapur et al. und Guinard-Samuel et al. wiederholten 2009 das Protokoll und kamen zu dem Schluss, dass die immunhistochemische Färbung für Kalretinin der Färbung für Acetylcholinestase11,12überlegensei. 1988 wurde die S100-Immunfärbung für die Diagnose HD erstmals von Robey et al eingeführt. 13. Monforte-Muñoz et al. wiederholte die Methode 1998 und stellte fest, dass 90% ihrer 20 Hirschsprung-Fälle Nervenfasern von weit als40 μm 14 hatten. Daher kann die S100-Immunfärbung in Fällen ohne Ganglienzellen als zusätzliche Diagnostik dienen. Darüber hinaus bemerkte Bachmann et al., dass die immunhistochemische Färbung für MAP2, Calretinin, GLUT1 und S100 ein zuverlässiges Ergebnis erzielen konnte, das so genau wieTiefkühlschnitttechniken 15. Im Jahr 1992 bewertete Sams et al. jedoch den Wert von PGP9.5 in der Diagnose HD16. Obwohl S100 mehr Lamina propria Nervenfasern erkennen kann, hat es eine höhere Falsch-Negativrate. Aus diesem Grund haben wir uns dafür entschieden, PGP9.5 und S100 gemeinsam für die immunhistochemische Diagnose HD zu verwenden, wie frühere Studien empfohlen. Viele Fälle von Färbung für neuronenspezifische Enolase in Übergangszonen zeigten auch positive Ganglienzellen im myenterischen und submukosmalen Plexus, aber diese Zellen waren spärlich und klein12. Ebenso sind Kalretin-positive Ganglienzellen klein und haben eine Clusterbildung. Eine frühere Studie ergab, dass einige leicht verdickte Nervenstämme auch in den Transitsegmenten HD nachgewiesen werden konnten, aber bei einer totalen kältenfarbigen Aganglionose können sich die Nervenstämme innerhalb normaler Grenzen(< 40 μm) 17 befinden. Wir sollten die Ergebnisse von Fall zu Fall analysieren und diese Ergebnisse mit klinischen Manifestationen kombinieren, um Fehldiagnosen zu vermeiden.
Dieses Protokoll konnte nicht die endgültige pathologische Diagnose darstellen, daher haben wir für jedes Kind mindestens ein Jahr gründliche klinische Nachsorge durchgeführt. Zusätzlich benötigt dieses Protokoll mehr Proben, um seine Zuverlässigkeit zu beweisen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Diagnose HD durch RSB eine praktische Methode ist, die eine ideale histologische Diagnose mit akzeptabler minimaler Verletzung bietet. Die Empfindlichkeit hängt eng damit zusammen, ob der Fundort der Probenahme richtig ist. Die immunhistochemische Färbung von RSB für Calretinin, S100 und PGP9.5 ist empfindlich und spezifisch bei der Erkennung von Ganglienzellen und hypertrophen Nervenstämmen. Die Kombination dieser drei Marker bietet eine zuverlässigere Diagnosemethode für HD.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken Weibing Tang für seine große Hilfe bei der Bereitstellung des Drehortes. Dieser Artikel wird von der Public Welfare Research unterstützt, und Sonderfonds wurden von der National Health and Family Planning of China (Grant No.201402007) erhalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
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