Summary
פרוטוקול זה מתאר את תהליך העיבוד החיסוני שאיבה רקטלית ביופסיה עבור calretinin, S100 חלבון, חלבון מוצר גן 9.5. שיטת האבחון החדשנית של מחלת הירשפרונג מעדיפה רגישות ותעריפים מסוימים.
Abstract
מחלת הירשפרונג (HD) היא מחלת מעיים מולדת אשר מתבטאת קלינית כחוסר יכולת לעבור meconium בתינוקות או עצירות לטווח ארוך אצל ילדים. ביופסיה שאיבה רקטלית (RSB) כדי לקבוע את העדר של תאים גנגליון והיפרפרס עצביים הוא המבחן המדויק ביותר עבור האבחנה של HD כיום. המטאוקסילין המסורתי-אאוזין מכתים חסר רגישות וספציפיות. כתמים אצטילכולין אסטראז לא ניתן להשתמש באופן נרחב עקב התהליך המורכב שלה. הפרוטוקול הרומן שלנו של כתמים עבור calretinin, חלבון S100, וחלבון מוצר גן 9.5 (PGP 9.5), אשר אנו מתנהלים על RSBs, תצוגות רגישות גבוהה ושיעורי ספציפיות של 96.49% (95% מרווח ביטחון, 0.88-0.99) ו 100% (95% ביטחון מרווח, 0.97-1.00), בהתאמה. מקטעים מושפעים HD לעתים קרובות להציג כהעדר הביטוי של calretinin, S100 חלבון, ו PGP 9.5, אשר הם סמנים של היפרפרס עצבי ברקמת submucosal. פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההפעלה המפורט של שיטת אבחון חדשה זו.
Introduction
מחלת הירשפרונג (HD) היא הפרעת מעיים שכיחה בבטן מולדת המאופיינת בהעדר תאים גנגליון בחלקים שונים של מערכת העיכול1. מערכת העצבים האנושית נוצר כאשר הפלישה של התאים העצביים העובריים הושלמה. אם יש הפרעה של התהליך ואת הפלישה נכשל להשלים, המעי המרוחק של היילוד הופך aganglionic2. המצב הקטלני הזה נקרא מחלת הירשפרונג. התפשטות, תנועתיות וגידול במעיים הם שלושת המרכיבים העיקריים של הקולוניזציה המוצלחת.
המטאוקסילין מסורתית ו אאוזין (H & E) כתמים של ביופסיה מוגבלת submucosal לא יכול להגיע כגורם משביע רצון של התוצאה כמו H & E כתמים של רקמה בעובי מלא שהתקבלו מהניתוח. בנוסף, אצטילכולין אסטראז (כאב) כתמים של רקמת שאיבה רקטלית הוא מאתגר תיאורטית בשל הרגישות שלה מספיק, שהוא 91%, ועיבוד מורכב של סעיפים קפואים3,4. מספר סמנים אימונוהיסטוכימיה אחרים של תאים גנגליון וסיבי עצב שניתן לוכתם ב-formalin קבוע ו פרפין מוטבע דגימות בהדרגה להפוך את האבחון המיינסטרים HD. Calretinin הוא ויטמין D תלויי-חלבון מחייב סידן שאינו מתבטא במיקלעת myenteric ו submucosal של מקטעים מושפעים HD5. חלבון S100 מתבטא בתאים הנגזרים מהרכס העצבי, כגון סיבי עצב ותאי גליה, אשר לעתים קרובות מציגים היפרפרס עצביים ברקמת המשנה של מקטעים מושפעים של HD6. גן חלבון מוצר 9.5 (PGP 9.5) כתמים באופן אמין סיבי עצב ו גנגליון תאים; PGP 9.5 כתמים מעשים כתוספת calretinin כתמים, במיוחד במקרים של היפוגנגלארי מבודדים. מכתים כפול עם S100 ו PGP 9.5 יכול להקטין את שיעור שלילי שלילית ולהגדיל את הרגישות. כתנאי מוקדם, המחקר הנוכחי שואפת להבטיח ספציפיות הולם רגישות גבוהה של שיטה זו אבחון הרומן. הפרוטוקול הרומן שלנו השתמש בכל שלושת הסמנים לאפליה של aganglionic מעי וסיבי עצב יפרטרופית. מחקר פוטנציאלי של 318 ילדים בוצע על ידי המעבדה שלנו ופורסם בעבר ללא פרוטוקול מפורט7. הפרוטוקול המפורט ואמצעי הזהירות נדונים במאמר זה. כל neonates שסבלו מבעיית הצואה חמור מאז הלידה או הילדים עם עצירות כרונית למעט מחלות נפוצות אחרות הם מועמדים פוטנציאליים ביופסיה שאיבה רקטלית (RSB). הפרוטוקול הרומן שלנו מתאים לצביעת לא רק RSBs אלא גם ביופסיות בעובי מלא או דגימות כירורגי כדי לבצע אבחנה סופית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי מועצת האתיקה המחקר של בית החולים האיחוד של האוניברסיטה של Huazhong המדע והטכנולוגיה.
1. שאיבה רקטלית ביופסיה
- בצע את ביופסיה שאיבה פי הטבעת על ידי מנתח ילדים מיומן היטב עוזר באמצעות מערכת Rbi2 יניקה ביופסיה רקטלית לאחר קבלת הסכמה מושכלת מהשומר.
- לבצע RSB על חולים שיש להם את הסימנים הבאים: חוסר יכולת לעבור meconium אצל תינוקות או נפיחות ארוכת טווח עם או בלי עצירות אצל ילדים; ילדים עם עצירות ארוכת טווח הזקוקים שמן פרפין כדי להשלים את הצרכים; חסימת מעיים או ניקוב מעיים בעלי סיבות לא ידועות אצל ילדים העוברים בידור.
הערה: התוויות RSB הן כדלקמן: ילדים שיש להם תסמינים חמורים, אשר נמצאים במצב פיזי עני, או מי לא יכול לסובלנית RSB; ילדים עם כניסה חריפה לבמה; ילדים העוברים השקה מעיים ללא החלמה מלאה.
- לבצע RSB על חולים שיש להם את הסימנים הבאים: חוסר יכולת לעבור meconium אצל תינוקות או נפיחות ארוכת טווח עם או בלי עצירות אצל ילדים; ילדים עם עצירות ארוכת טווח הזקוקים שמן פרפין כדי להשלים את הצרכים; חסימת מעיים או ניקוב מעיים בעלי סיבות לא ידועות אצל ילדים העוברים בידור.
- לבצע חוקן החזקה מלוחים רגילה כמו הכנת המעיים 36 h לפני ההליך כדי למנוע שרפרפים רופפים בצקת מוגזמת של רירית. הוסף פתרון מגנזיום גופרתי אם לילד יש עצירות חמורה. מנהל ויטמין K (1 מ"ג/ק"ג) כדי neonates.
הערה: אין לבצע בדיקות דם לפני הניתוח או טיפול באנטיביוטיקה, מאחר שהן אינן נדרשות. - . שים חולה בתנוחת הלייטוטומיה מעילים את המשטח של הצינור עם שמן פרפין. הכנס את הצינור בוטה הסתיימה 4-7 ס מ לתוך הרקטום עם החור הצדדי מול הקירות האחוריים או הצדדיים.
- הפעילו לחץ עדין על הצינורית כדי להקל על הדבקה מספקת של החור הצדדי לקיר הרקטלי. לחץ על ההדק ומלא את הכלי באופן מיידי.
- השתמש בכלי ביופסיה כדי לקבל 4 שאיבה ביופסיות עם קוטר של 2 מ"מ ב 3 ס"מ ו 6 ס מ מעל קו השיניים, בהמתנה ופוסטיות. השתמש במחט כדי לשים את הדגימה. על גזה הלחלח בתמיסת מלח
- שימו לב למטופל עד השעה 14:00 לאחר ההליך לשלול דימום רקטלי. הימנע מניפולציות רקטאליים ואנאלי יותר ב -24 שעות הראשונות לאחר RSB.
2. הכנת מקטעי RSB
- מניחים את ביופסיות היניקה פי הטבעת ב 4% פאראפורמלדהיד עבור 6 h כדי לתקן את הרקמה. השתמש בכרך הקבע 5 פעמים יותר מנפח הרקמה.
- מייבשים את הרקמה בעזרת מייבש. הרקמות הפתולוגי במשך 11 שעות התהליך המתוכנת כולו מורכב מ -5 השלבים הבאים:
- מניחים את רקמת פורמלדהיד ולתקן עבור 1 h.
- הניחו את הרקמה ב-75% אתנול במשך 4 שעות.
- מניחים את הרקמה באתנול מוחלט (שני שינויים, 1 h כל אחד).
- מניחים את הרקמה באתנול מוחלט (שני שינויים, 30 דקות כל אחד).
- מניחים את הרקמה ב קסילן (שלושה שינויים, 1 h כל אחד).
- מניחים את הרקמה בשעווה פרפין (58-60 ° c) (שלושה שינויים, 1 h כל אחד). להטביע את רקמות RSB בגושי פרפין.
- לקצץ את גושי פרפין באמצעות מיקרוטומה עד הרקמה חשופה לחלוטין עם מטוס בסעיף שלם.
- חותכים את גושי לתוך 0.4 יקרומטר סעיפים עם מיקרוטומה.
- מניחים את הסעיפים לתוך 45-50 מעלות צלזיוס במשך כמה שניות כדי לאפשר לקטעים להתפשט לתוך צלחת שטוחה.
- העבר את מקטעי הפרפין אל שקופיות.
- אופים את השקופיות בתנור של 60 ° c עבור 3-5 h. הימנע אפייה במשך זמן רב מדי, אשר עשוי להוביל לאובדן של אנטיגנים.
- מניחים את השקופיות היחידות לתוך קסילן (2 שינויים, 15 דקות כל אחד).
- מימה את השקופיות באתנול מוחלט, 95%, 80%, ו 75% אתנול עבור 5 דקות כל אחד. ואז, לשטוף אותם אוסמוזה הפוכה (RO)-מים מטוהרים לעוד 5 דקות.
3. שליפת אנטיגן
- להפוך את העבודה לדילול עבור calretinin אחזור על ידי ערבוב 4 מ ל של מאגר האחזור אנטיגן EDTA עם 200 mL של מים RO-מטוהרים. הפוך את העבודה לדילול עבור S100 ו PGP 9.5 אחזור על ידי ערבוב 1 מ ל של חומצת לימון מאגר ציטראט של נתרן (100x) עם 99 mL של מים RO-מטוהרים.
הערה: ניתן לאחזר את Calretinin באמצעות פתרון האחזור EDTA. עם זאת, חומצת המלח נתרן ציטראט מאגר מתאים יותר לשליפה של S100 ו PGP 9.5. - הצב את השקופיות בצנצנת המכתימה של הcoplin. ממלאים את הצנצנת בתמיסת האחזור ומניחים אותו לאמבט מים רותחים מחומם. לאחר הרתיחה של 20 דקות, להסיר את הצנצנת מאמבט מים ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר. תהליך הקירור נמשך כ-10 דקות. הסר את השקופיות ושטוף אותם בעדינות פעם אחת עם תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS).
- ציירו עיגול עם עט סמן סביב הרקמה והכינו קופסה רטובה להליכים הבאים.
4. חסימות
- הפוך את העבודה לדילול על ידי ערבוב 3 מ ל של 30% H2O2 עם 27 מ ל של המים RO-מטוהרים.
- הוסף שתיים או שלוש טיפות של 3% H2O 2 הפתרון dropwise על הרקמה כדי לחסום את הפרמוקסיתמרים. הוסף את הפתרון H2O2 בהקדם כדי לוודא שהפתרון לא גולש מהמעגל. לבצע חסימה של הפרמוקסיתמרים בחממה 37 ° c עבור 20 דקות.
- שטפו את השקופיות בעדינות עם ה-PBS (שלוש שטיפות, 5 דקות כל אחת).
- לחסום את השקופיות עבור 20 דקות ב 37 ° צ' עם 5% בסרום שור (BSA, שהוכנו על ידי ערבוב 1.5 g של אבקת BSA עם 30 מ ל של מים RO-מטוהרים).
הערה: חסימת עם 3% H2O 2 יכול למנוע 95% של כתמים לא ספציפיים חסימה עם 5% bsa יכול למנוע את 5% אחרים של כתמים לא ספציפיים. שלב את שתי השיטות כדי לקבל תוצאה אמינה.
5. אנטיגן-התגובה הנוגדן
- הסר את 5% BSA ולהוסיף 50 μL של הנוגדן העיקרי (calretinin, S100, או PGP 9.5) לשקופית. המלון משלב בין לילה ב -4 ° c.
- שטוף את השקופית עם PBS (שלוש פעמים, 3 דקות לכל אחד).
- הוסף 50 μL של פולימר משפר (מגיב A; ראה טבלה של חומרים) לסעיף ו מודקות אותו 20 דקות בחממה 37 ° c. לאחר מכן, שטוף את השקופית עם ה-PBS (שלוש פעמים, 3 דקות לכל אחד).
- הוסף 50 μL של נוגדן משני B (עז אנטי ארנב/עכבר IgG נוגדן משני) לסעיף ו דגירה עבור 30 דקות בחממה 37 ° c. שטוף את הקטע עם PBS (שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד).
6.3, 3-diaminobenzidine ו המטאוקסילין כתמים
- להוסיף 850 μL של המים RO-מטוהרים ל שפופרת 1.5 mL ולהוסיף את ריאגנטים מכתים (לראות את הטבלה של חומרים) בסדר a, B, ו-C. Add 50 μl של כל מגיב כדי לקבל סכום כולל של 1 מ"ל של 3, 3-diaminobenzidine (בתוך) פתרון העבודה. אם יש מאיצים, השתמש בפתרון לאחר סינון.
- הוסף טיפה של הפתרון לעבוד לחלק את הרקמה ואת הכתם עבור 3-10 דקות. מודקות את השקופיות בטמפרטורת החדר עד שמתגלה כתמים חומים. הצג בזהירות על ידי שימוש במיקרוסקופ שדה ברייטאני. השאר את הפתרון העובד בקלות הרחק מהאור. לאחר מכן, שטוף את השקופית עם ה-PBS למשך 5 דקות.
- הוסיפו טיפה של המטאוקסילין כדי להכתים את הגרעינים במשך כ-1 דקות. ואז, להחזיק את הצנצנת הcoplin ולשטוף אותו תחת זרזיף של מים עבור כ 30-40 s עד עודף הצבע מוסר. להיזהר לא לפגוע בסעיפים הרקמה.
- לטבול את שקופיות RSB בצנצנת coplin המכילה PBS עבור 25-30 s. ואז, להבדיל ב 1% חומצה הידרוכלורית-אתנול עבור 10 ס. לשטוף את השקופיות עם PBS עבור 1 דקות.
- מייבשים את השקופיות בסדר הפוך של לחות: 75%, 80%, 95%, ו אתנול מוחלט (5 דקות כל אחד).
- לחשוף את השקופיות כדי קסילן (2 שינויים, 5 דקות כל אחד).
- הר את הכיסויים באמצעות הרכבה ultraclean. אפשר לשקופיות להתייבש לפני הדמיה באמצעות מיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בסך הכל, 318 חולים נרשמו במחקר שלנו. כל החולים עברו RSB, ואת הרקמות היו מוכתם calretinin, S100, ו PGP 9.5. האבחנה המבוססת על הפרוטוקול הרומן שלנו היה HD ב 97 מקרים, non-HD במקרים 213, וחשד HD ב 8 מקרים. בין 132 חולים כירורגי, 99 חולים אובחנו עם HD על ידי כתמים חיסוני של דגימות מלאות בעובי לאחר הניתוח. S100 ו PGP 9.5 צביעת הראו כי 92% ו 93% מהחולים 99, בהתאמה, היו מכנסי עצב היפרטרופיקים. 83 אחרים של החולים 186 עברו ביופסיות בעובי מלא והראו תאים גנגליון. סך של 103 חולים נרפא קלינית על ידי טיפולים שמרנים, ו-HD לא נכלל. של 8 חולים עם חשד HD, 3 חולים היו מסווגים ב-HD קטע קצר, ו 5 החולים האחרים היו מסווגים כמו לא HD.
על פי התוצאות שלנו, 97 חולים אובחנו על ידי RSB בתחילה. מידע מפורט מוצג בטבלה 1. הפרוטוקול של מכתים אימונוהיסטוכימיה עבור calretinin, S100, ו PGP 9.5, אשר אנו מתנהלים על RSBs, יש רגישות גבוהה ושיעורי ספציפיות של 96.49% (95% מרווח זמן ביטחון [CI], 0.88-0.99) ו 100% (95% CI, 0.97-1.00), בהתאמה. הערך החזוי החיובי הוא 94.3% (95% CI, 0.87-0.99), וערך הניבוי השלילי הוא 99.1% (95% CI, 0.95-1.00).
איור 1A ו- 1a מייצגים תוצאות אופייניות לאחר כתמים מסוימים עבור calretinin. תאים גנגליון רבים, אשר לבטא calretinin, ניתן למצוא את הרקמות הרגילות. עם זאת, לא תאים גנגליון זוהו בכל אזור של הרקמה מקטע HD. כפי שניתן לראות באיור 1C-F, S100 ו-pgp 9.5 כתמים מראה היפרטרופיאד גזעי העצב ב submucosa, בעוד רק כתמים בלבד של כמה זרדים עצבים קטנים נצפתה המעי innervated בדרך כלל. במחקר שלנו, מכנסי עצב יפרטרופית הם סיבי עצב עם קוטר של ≥ 40 μm.
איור 1: כתמים של ביופסיות שאיבה רקטלית עבור calretinin, PGP 9.5, ו S100. חיסוני של calretinin ב-HD רקמה מושפעת (A) ו בתאי גנגליון של plexuses משתמש ברקמת innervated בדרך כלל (ב). אין כתמים calretinin התגלתה בתוך השימושים של myenteric של מקטע HD מושפע. PGP 9.5 כתמים ברקמה מושפעת HD הראה צפוף סיבים עצביים יפרטרופית ב submucosa (ג) בניגוד סיבי עצב ברקמות הרגיל (D). (ה) S100 בולטות ובולט חיסוני הראה יפרטרופית גזעי העצבים בתוך הרירית של הרקמה HD מושפע. (ו) סיבי עצב רגילים ברירית המשנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| חלבון סמני | HD (99) | לא-HD (219) | ||
| התאים גנגליון (+) | מכנסי עצב יפרטרופית (+) | התאים גנגליון (+) | מכנסי עצב יפרטרופית (+) | |
| מיכל כליף | 2 | — | 214 | — |
| S100 | — | 91 | — | 3 |
| PGP 9.5 | — | 92 | — | 4 |
טבלה 1: אימונוהיסטוכימיה מכתים ציונים עבור שלושת סמני החלבון בביופסיה של שאיבה רקטלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן תיארנו הליך באמצעות שלושה נוגדנים אימונוהיסטוכימיה שונים כדי להכתים סעיפים RBS לאבחון של HD. הרגישות של פרוטוקול האבחון שלנו היה 96.49% (95% CI, 0.88-0.99), והספציפיות היתה 100% (95% CI, 0.97-1.00).
הצעדים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הם התגובה RSB ונוגדן אנטיגן. גודל הביופסיה קובע את הדיוק של ההכתמים. ביופסיה קטנה לא תספק מספיק רקמות כדי לבצע אבחנה מדויקת, בעוד ביופסיה גדולה מובילה לסיכון גבוה יותר של דימום. כעניין של ניסיון, ביופסיות עם קוטר של 2 מ"מ הם הגודל האופטימלי. עבור התגובה אנטיגן-נוגדן, שמירה נכונה של הנוגדן לא ניתן להתעלם. בעקבות הפרוטוקול צעד אחר צעד והעבודה בעדינות נחוצים. מים הפוכה אוסמוזה מטוהרים מומלצת בכל השלבים, מניב שדה ברור יותר עבור התבוננות ובכך קל יותר לפתולוגים לעשות אבחנה מדויקת.
חוקן ניגודיות, נצפתה מנמטריה, וביופסיה עם היסטולוגיה הם שלוש שיטות אבחון טרום הניתוח ששימשו בשנים האחרונות. לדברי טקווירה ואח '. של מחקר, ביופסיה עם היסטולוגיה יש רגישות גבוהה וספציפיות8. מאייר-Ruge ואח ' דווח לראשונה על השימוש אצטילכולין אסטראז (כאב) מכתים על רקמת שאיבה הקפוא רקטלי כדי לסייע לאבחן HD ב 19729. השיטה המכתימה מאתרת גזעי עצבים יפרטרופית ברירית המשנה. לאחר הדו ח הזה, מוסדות רבים ברחבי העולם החלו להשתמש בשיטה זו כתוספת לאבחון של HD. בשל מגבלות אבחון שלה, החוקרים החלו להתרכז סמנים אחרים שיכולים גם להכתים את התאים גנגליון וסיבי העצב ב פורמאלין-קבוע ופרפין-דגימות מוטבעות. ב 2004, Barshack ואח ' מצאו כי אובדן ביטוי calretinin עשוי לעזור לאבחן aganglionic מקטעים ב-HD10. קאפור ואח ' וגינארד-סמואל ואח ' חזר על הפרוטוקול ב - 2009 והסיק שצביעת אימונוהיסטוכימיה לקאלרטיב הייתה מעולה לצביעת אצטילכולין אסטראז11,12. ב 1988, S100 כתמים לאבחנה של HD הוצג לראשונה על ידי robey et al. 13. monforte-מוניוס ואח ' חזר על השיטה בשנת 1998 ומצא כי 90% שלהם 20 מקרים הירשרונג היו סיבי עצב רחב יותר מאשר 40 יקרומטר14. לכן, S100 חיסוני עשוי לשמש שיטת אבחון משניים במקרים ללא גנגליון תאים. יתרה מזאת, בקמן הבחין כי מכתים אימונוהיסטוכימיה עבור MAP2, calretinin, GLUT1, ו S100 יכול לקבל תוצאה אמינה מדויק כמו שיטות מקטע קפוא15. עם זאת, בשנת 1992, סאמט ואח ' העריך את הערך של pgp 9.5 באבחנה של HD16. למרות S100 יכול לזהות יותר לאמינה סיבי עצב, יש לו שיעור גבוה יותר כוזב שלילי. לכן, אנחנו בחרנו להשתמש PGP 9.5 ו S100 יחד עבור האבחנה האימונוהיסטוכימיה של HD, כמו מחקרים קודמים מומלץ. מקרים רבים של כתמים של אנולאז ספציפי לעצב באזורי המעבר הראה גם תאים גנגליון חיובי ב מקלעת myenteric ו submucosal, אבל תאים אלה היו דלילים קטנים12. באופן דומה, calretinin-חיובי התאים הם קטנים ויש להם מבנה מקובצים. מחקר קודם עולה כי כמה גזעי עצבים מעט מעובה יכול להתגלות גם במקטעי המעבר של HD, אבל עם הכולל המעי הגס agangosis, גזעי עצבי יכול להיות בתוך גבולות נורמליים (< 40 μm)17. אנחנו צריכים לנתח את מקרה התוצאות במקרה ולשלב את התוצאות עם ביטויים קליניים כדי למנוע אבחנה מוטעית.
פרוטוקול זה לא הצליח לייצג את האבחנה הפתולוגית הסופית, ולכן ביצעו מינימום של שנה של מעקב קליני יסודי עבור כל ילד. בנוסף, פרוטוקול זה דורש דוגמאות נוספות כדי להוכיח את אמינותו.
לסיכום, האבחנה של HD על ידי RSB היא שיטה נוחה המספקת אבחנה היסטולוגית אידיאלית עם פציעה מינימלית סבירה. הרגישות קשורה קשר הדוק אם אתר הדגימה נכון. אימונוהיסטוכימית כתמים של RSB עבור calretinin, S100, ו PGP 9.5 הוא רגיש וספציפי בזיהוי של תאים גנגליון וגזעי עצבי יפרטרופית. השילוב של שלושת הסמנים האלה מציע שיטת אבחון אמינה יותר עבור HD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מודים לweibing טאנג על עזרתו הגדולה במתן מעבדת הצילום. מאמר זה נתמך על ידי מחקר הרווחה הציבורית, וקרנות מיוחדות התקבלו מן הבריאות הלאומית ותכנון המשפחה של סין (גרנט No. 201402007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
