Summary
このプロトコルは、calretinin、S100 タンパク質、およびタンパク質遺伝子産物9.5 に対する免疫染色の直腸吸引生検のプロセスを記載している。ヒルシュスプルング病のためのこの新しいアジュバント診断法は、好ましい感受性および特異性率を有する。
Abstract
ヒルシュスプルング病 (HD) は、乳児の胎便を通過することができない、または小児の長期便秘として臨床的に明らかにされている先天性腸疾患である。神経節細胞および神経肥大の不在を決定する直腸の吸引のバイオプシー (RSB) は現時点で HD の診断のための最も正確なテストである。従来のヘマトキシリン・エオシン染色は感受性および特異性に欠ける。アセチルコリンエステラーゼ染色は、その複雑なプロセスのために広く使用することはできません.我々が RSBs で行った calretinin、S100 タンパク質およびタンパク質遺伝子産物 9.5 (PGP 9.5) のための免疫染色の新規プロトコルは、96.49% (95% 信頼区間、0.88-0.99) の高感度および特異性率を示し、100% (95% 信頼間隔は 0.97 ~ 1.00) です。HD に影響を受けるセグメントは、calretinin、S100 タンパク質、および粘膜下組織の神経肥大のマーカーである PGP 9.5 の発現が存在しないとしてしばしば存在する。このプロトコルは、この新しい診断方法の詳細な動作プロセスについて説明します。
Introduction
ヒルシュスプルング病 (HD) は、遠位腸管1の異なるセグメントにおける神経節細胞の欠乏によって特徴付けられる一般的な先天性腸疾患である。ヒトの腸神経系は、胚性神経細胞の浸潤が完了したときに形成される。プロセスの乱れがあり、侵襲が完了しなかった場合、新生児の遠位腸管は aganglionic2になる。この潜在的に致命的な状態はヒルシュスプルング病と呼ばれます。増殖、運動性、および腸の成長は、コロニー形成の成功の3つの主要な要素である。
限定された粘膜下生検の伝統的なヘマトキシリンおよびエオシン (H & E) 染色は、手術から得られる全厚組織の H & E 染色としての結果に満足できるものとして達成することができない。さらに、直腸の吸引のティッシュのアセチルコリンエステラーゼ (痛み) の染色は 91%、および凍結セクション3,4の複雑な処理である不十分な感受性が原因で理論的に挑戦的である。ホルマリン固定およびパラフィン包埋標本で染色されることができる神経節細胞および脳繊維の他のいくつかの免疫組織化学的マーカーは、徐々に主流の HD 診断になってきている。Calretinin は、HD 罹患セグメント5の myenteric および粘膜下叢において発現されていないビタミン D 依存性カルシウム結合性タンパク質である。S100 タンパク質は、神経線維およびグリア細胞などの神経堤に由来する細胞において発現され、これは、しばしば、HD 罹患セグメント6の粘膜下組織における神経肥大を示す。タンパク質遺伝子産物 9.5 (PGP 9.5) は、神経線維および神経節細胞を確実に染色する。PGP 9.5 染色は、特に孤立した hypoganglionosis の場合、calretinin 染色の補足として機能します。S100 および PGP 9.5 との二重染色は、偽陰性率を減少させ、感度を高めることができます。前提条件として、現在の研究は、この新規診断方法の十分な特異性および高感度を確保することを目的とする。私たちの新しいプロトコルは、aganglionic 腸と肥厚性神経線維の識別のために3つのマーカーすべてを使用しました。318子供の将来の研究は、私たちの研究室によって行われ、以前に詳細なプロトコル7なしで公開しました。詳細なプロトコルと注意事項については、この記事で説明します。出生後に重度の排便問題を患った新生児、または他の一般的な疾患を除く慢性便秘の小児は、直腸吸引生検 (RSB) の候補となる可能性がある。私達の新しい議定書は RSBs だけでなく、最終的な診断を作るために完全な厚さのバイオプシーまたは外科標本を染色のために適している。
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Protocol
このプロトコルは、科学技術の Huazhong 大学のユニオン病院の研究倫理委員会によって承認されました。
1. 直腸の吸引のバイオプシー
- 十分に訓練された小児科の外科医によって直腸の吸引のバイオプシーを行い、保護者からのインフォームドコンセントを得た後 Rbi2 吸引の直腸のバイオプシーシステムを使用する助手。
- 以下の適応症を有する患者に RSB を行う: 小児の乳児における胎便の通過ができない、または便秘の有無にかかわらず長期膨満感;排便を完了するためにパラフィン油を必要とする長期便秘の子供。enterostomy を受けている子供の原因不明の腸閉塞または腸管穿孔。
注: RSB のための禁忌は次のとおりです: 重度の症状を有する小児、体調が悪い人、または RSB を許容できない人。急性期腸炎の子供;完全な治癒のない腸の吻合を受けている子供たち.
- 以下の適応症を有する患者に RSB を行う: 小児の乳児における胎便の通過ができない、または便秘の有無にかかわらず長期膨満感;排便を完了するためにパラフィン油を必要とする長期便秘の子供。enterostomy を受けている子供の原因不明の腸閉塞または腸管穿孔。
- 便の緩みや粘膜の過度の浮腫を避けるために、手順の前に腸の準備 36 h として通常の食塩水保持浣腸を実行します。小児に重度の便秘がある場合は、硫酸マグネシウム溶液を加える。新生児にビタミン K (1mg/kg) を投与する。
注意: 術前の血液検査や抗生物質の投与は、必須ではないため、行わないでください。 - 患者を lithotomy 位置に置く。チューブの表面をパラフィンオイルでコーティングします。鈍い端管 4-7 cm を直腸に挿入し、側孔を後部または横壁に向けます。
- 直腸の壁に側面の穴の適切な付着を促進するために管に穏やかな圧力を加えなさい。トリガーを押して、すぐにツールを撤回してください。
- バイオプシーの器械を使用して歯科ライン、前方および後方の上の 3 cm そして 6 cm の直径2つの mm の4つの吸引のバイオプシーを得なさい。生理食塩水で湿らせたガーゼに試料を置くために針を使用してください。
- 処置の後2時間まで患者を観察して直腸出血を除外します。RSB 後の最初の24時間で、さらなる直腸および肛門の操作を避けてください。
2. RSB セクションの準備
- 直腸の吸引のバイオプシーを 6 h のための 4% パラホルムアルデヒドにティッシュを固定するために置きなさい。組織容積の5倍以上の固定液容積を使用する。
- 11時間の病理組織脱水機を用いて組織を脱水する。プログラム全体のプロセスは、次の5つの手順で構成されています。
- ホルムアルデヒドで組織を配置し、1時間を固定します。
- 75% エタノールに4時間組織を置きます。
- 組織を絶対エタノールに入れます (2 つの変化、それぞれ1時間)。
- 組織を絶対エタノールに入れます (2 つの変化、それぞれ30分)。
- ティッシュをキシレン (3 つの変化、それぞれ 1 h) に置きます。
- 組織をパラフィンワックス (58-60 ° c) に置きます (3 つの変化、それぞれ1時間)。パラフィンブロックに RSB 組織を埋め込みます。
- 組織が完全な断面で露出されるまで、ミクロトームを使用してパラフィンブロックをトリムします。
- ミクロトームの0.4 μ m セクションにブロックを切りなさい。
- セクションを平らなプレートに広げることができるように、各セクションを数秒間45-50 ° c の水に入れます。
- パラフィンセクションをスライドに移動します。
- スライドを60° c のオーブンで 3-5 h で焼く。長時間焼くことは避け、抗原の消失につながる可能性があります。
- 張り付けスライドをキシレン (2 変更、各15分) に配置します。
- スライドを無水エタノール、95%、80%、および 75% エタノールでそれぞれ5分間水和させる。次に、逆浸透 (RO)-精製水を別の5分間でそれらをすすいでください。
3. 抗原検索
- 200 mL の RO 精製水で EDTA 抗原抽出バッファー 4 mL を混合することにより、calretinin 検索のための作業希釈を行います。99 mL の RO 精製水を使用してクエン酸ナトリウム (100x) を 1 mL 混合して、S100 および PGP 9.5 検索のための作業希釈を行います。
注: Calretinin は、EDTA 検索ソリューションによって優先的に取得できます。ただし、S100 およびのクエン酸ナトリウムの緩衝液は、S100 および PGP 9.5 の検索に適しています。 - スライドを coplin 染色瓶に入れます。取り出し溶液でジャーを充填し、予熱した熱湯浴に置きます。20分間沸騰させた後、水浴から瓶を取り出し、室温まで冷まします。冷却プロセスには約10分かかります。スライドを除去し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で軽くすすぎます。
- 組織の周りにマーカーペンで円を描き、次の手順のための濡れたボックスを準備します。
4. ブロッキング
- 30% H2 の 3 mL と RO 精製水の27 mlを混合して、作業希釈を行います。
- 3% H2o 2 溶液を 2 ~ 3滴加えて組織に滴下し、peroxidates を遮断する。H2 溶液を速やかに追加して、溶液が円からあふれないようにします。37° c のインキュベーター内で peroxidates のブロッキングを20分間行います。
- PBS (3 回の洗浄、それぞれ5分) でスライドをやさしくすすいでください。
- 5% ウシ血清アルブミン (BSA、30 mL の RO 精製水と BSA 粉末の 1.5 g を混合することによって調製) で20分37° c でスライドをブロックします。
注: 3% H2o でのブロッキングは 、非特異的染色および 5% BSA によるブロッキングの 95% を防ぐことができ、非特異的染色の他の 5% を防ぐことができます。信頼性の高い結果を得るために2つのメソッドを組み合わせます。
5. 抗原抗体反応
- 5% BSA を取り外し、1次抗体 (calretinin、S100、または PGP 9.5) の50μ l をスライドに加えます。4° c で一晩インキュベートします。
- スライドを PBS (3 回、各3分) で洗います。
- セクションに50μ l のポリマーエンハンサー (試薬 A;材料のテーブルを参照) を加え、37° c のインキュベーター内で20分間インキュベートします。次に、スライドを PBS (3 回、各3分) で洗浄する。
- セクションに50μ l の二次抗体 B (ヤギ抗ウサギ/マウス IgG 二次抗体) を加え、37° c のインキュベーター内で30分間インキュベートします。セクションを PBS で洗ってください (それぞれ3回、5分ずつ)。
6. 3、3-ジアミノベンジジンおよびヘマトキシリン染色
- 850μ l の RO 精製水を 1.5 mL チューブに加え、A、B、および c. の順序で染色試薬 (材料の表を参照) を加えます。各試薬の50μ l を加えて、合計1ml の 3, 3-ジアミノベンジジン (DAB) 作業溶液を得る。沈殿物がある場合は、濾過後に溶液を使用する。
- DAB 作業用ソリューションをティッシュセクションに追加し、3-10 分間染色します。茶色の染色が検出されるまで、室温で DAB でスライドをインキュベートします。明視野の顕微鏡を使用して注意深く監察しなさい。DAB 作業用ソリューションを光から遠ざけてください。次に、PBS でスライドを5分間洗浄する。
- 約1分間核を対比染色するためにヘマトキシリンのドロップを追加します。その後、coplin を保持し、余分な染料が除去されるまで約 30-40 s のための水のトリクルの下で洗ってください。ティッシュのセクションを傷つけないように注意しなさい。
- RSB のスライドを 25-30 s の PBS を含む coplin 瓶に浸します。その後、1% 塩酸エタノールを10秒間に分化させる。スライドを PBS で1分間洗浄します。
- 水和とは逆の順序でスライドを脱水します:75%、80%、95%、絶対エタノール (各5分)。
- スライドをキシレン (2 変更、各5分) に公開します。
- ウルトラクリーンマウントを使用してカバースリップをマウントします。顕微鏡を使用して可視化する前にスライドを乾燥させます。
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Representative Results
合計で、318人の患者が我々の研究に登録された。全ての患者は RSB を経験し、組織は calretinin、S100、および PGP 9.5 のために染色された。私たちの斬新なプロトコルに基づく診断は、97ケースで HD、非 HD は213のケースで、HD は8ケースで疑われました。手術後の132人の外科患者のうち、99人の患者は、外科手術後に全厚の標本を免疫染色することで HD と診断された。S100 および PGP 9.5 染色は、99患者の 92% および 93% がそれぞれ、肥大神経幹を有していたことを示した。186の患者の他の83は完全な厚さのバイオプシーを経験し、神経節細胞を示した。103の患者は保守的な療法によって臨床的に治癒し、HD は除外された。HD の疑いがある8人の患者のうち、3名はショートセグメント HD として分類され、他の5人の患者は非 HD として分類した。
我々の結果によると、97の患者は最初に RSB によって診断された。詳細な情報は表 1に示します。Calretinin、S100、および RSBs で行った PGP 9.5 のための免疫組織化学の議定書は、96.49% (95% 信頼区間 [CI]、0.88-0.99) および 100%(95% の CI、0.97-1.00) の高い感受性および特異性率を有する。正の予測値は 94.3%(95% CI、0.87-0.99)、負の予測値は 99.1% (95% CI、0.95-1.00) です。
図 1aおよび1bは、calretinin に対する免疫染色後の代表的な結果を示す。Calretinin を発現する多くの神経節細胞は、正常組織に見出すことができる。しかし、HD セグメントからの組織のどの領域においても神経節細胞は検出されなかった。図 1cに示されているように、S100 および pgp 9.5 免疫染色は、粘膜下層において肥大神経幹を示しているが、通常側側腸ではいくつかの小さな神経小枝の顆粒状の染色しか認められなかった。我々の研究では、肥厚性神経幹は、≥40μ m の直径を有する神経線維である。
図 1: calretinin、pgp 9.5、S100 の直腸吸引生検の免疫染色。HD 罹患組織における calretinin に対する免疫染色 (A) および通常側側組織における myenteric 叢の神経節細胞における (B)。Calretinin 染色は、HD 影響を受けたセグメントの myenteric 叢で検出されなかった。HD 影響を受けた組織における PGP 9.5 染色は、正常組織 (D) における神経線維とは対照的に粘膜下層 (C) に密な肥厚性神経線維を示した。(E) 緻密で著名な S100 免疫染色は、粘膜下層組織の高肥大神経幹を示した。(F) 粘膜下層中の正常な神経線維。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| タンパク質マーカー | HD (99) | ノン HD (219) | ||
| 神経節細胞 (+) | 肥厚性神経幹 (+) | 神経節細胞 (+) | 肥厚性神経幹 (+) | |
| calretinin | 2 | — | 214 | — |
| S100 | — | 91 | — | 3 |
| PGP 9.5 | — | 92 | — | 4 |
表 1: 直腸吸引生検における3つのタンパク質マーカーの免疫組織化性染色スコア
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Discussion
ここでは、HD の診断のために RBS セクションを染色する3つの異なる免疫組織化抗体を用いた手順について説明した。診断プロトコールの感度は 96.49% (95% CI, 0.88-0.99) であり, 特異性は 100% であった (95% CI, 0.97-1.00)。
プロトコルの最も重要なステップは、RSB および抗原抗体反応である。生検のサイズは、染色の精度を決定する。小さな生検は、正確な診断を下すために十分な組織を提供しません, 大きな生検は、出血のより高いリスクにつながります.経験の問題として、2つの mm の直径が付いているバイオプシーは最適のサイズである。抗原抗体反応では、抗体の適切な保存を無視することはできません。手順に従ってプロトコルのステップを実行し、優しく作業する必要があります。逆浸透-精製水は、すべてのステップで推奨され、観察のための明確なフィールドをもたらし、病理学者が正確な診断を行うことが容易になります。
対照浣腸、anorectal マノメトリー、および組織学を有する生検は、近年使用されている3つの術前診断方法である。Takawira et al.' によるとs 研究は、組織学を用いた生検は、最も高い感受性および特異性8を有する。マイヤー-ルーヘet al.最初に 19729の HD を診断するのを助けるために凍結された直腸の吸引組織のアセチルコリンエステラーゼ (痛み) 染色の使用を報告しました。この染色法は、粘膜下層の肥大神経幹を検出します。その報告の後、世界中の多くの機関が HD の診断の補助としてこの方法を使用し始めました。その診断上の制限のために、研究者は神経節細胞と神経線維を染色することができる他のマーカーに集中し始めたホルマリン固定されたパラフィン包埋標本。2004では、Barshack et al.は、calretinin 発現の損失は、HD10における aganglionic セグメントの診断に役立つ可能性があることを見出した。カポールet al.および Guinard-サミュエルet al . は2009でプロトコルを繰り返し、calretinin のための免疫組織化染色がアセチルコリンエステラーゼ11,12の染色より優れていたと結論付けた。1988では、HD の診断のための S100 免疫染色が Robey et alによって最初に導入された。13. モンフォルテ-ムニョスet al. 1998 でこの方法を繰り返し、20個のヒルシュスプルング症例の 90% が40μ m14よりも広い神経線維を有していたことを発見した。したがって、S100 免疫染色は、神経節細胞を含まない場合の補助的診断法として機能し得る。さらに、バッハマンet al.は、MAP2、CALRETININ、GLUT1、および S100 に対する免疫組織化染色が、凍結セクション技術15のように正確に信頼できる結果を得ることができることに気づいた。しかし、1992では、Sam et al.が HD16の診断において pgp 9.5 の値を評価しました。S100 はより多くの単層粘膜神経線維を検出することができますが、それはより高い偽陰性率を有します。したがって、前の研究が推奨するように、我々は、HD の免疫組織化性診断のために PGP 9.5 と S100 を併用することを選んだ。遷移ゾーンにおけるニューロン特異的エノラーゼのための染色の多くの症例はまた、myenteric および粘膜下神経叢において陽性神経節細胞を示したが、これらの細胞はまばらであり、かつ小さい12であった。同様に、calretinin 陽性神経節細胞は小さく、クラスター形成を有する。以前の研究では、いくつかのわずかに肥厚した神経幹は、HD の過渡的なセグメントで検出することもできたが、総大腸 aganglionosis では、神経幹は正常な限界内にある (< 40 μ m)17であることが示された。ケースごとに結果を分析し、これらの結果を臨床症状と組み合わせて誤診を避ける必要があります。
このプロトコルは最終的な病理診断を表すことができなかったので、各子供に対して最低1年間の臨床フォローアップを実施した。さらに、このプロトコルは信頼性を証明するためにより多くのサンプルを必要とします。
結論として、RSB による HD の診断は、許容可能な最小限の傷害で理想的な組織診断を提供する便利な方法である。感度は、サンプリングの場所が正しいかどうかと密接に関係しています。Calretinin、S100、および PGP 9.5 のための RSB の免疫組織化学的染色は、神経節細胞および肥厚性神経幹の検出において敏感で特異的である。これらの3つのマーカーの組み合わせは、HD のためのより信頼性の高い診断方法を提供しています。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
著者は、撮影室を提供することに彼の大きな助けを Weibing タンに感謝します。この記事は公的福祉研究によって支えられており、中国の国民健康・家族計画 (グラント 201402007) から特別資金が寄せられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
