Summary
Este protocolo describe el proceso de inmunostaining de las biopsias de succión rectal para la calretinina, la proteína S100 y el producto genético de proteína 9,5. Este novedoso método de diagnóstico adyuvante para la enfermedad de Hirschsprung tiene tasas de sensibilidad y especificidad preferibles.
Abstract
La enfermedad de Hirschsprung (EH) es una enfermedad intestinal congénita que se manifiesta clínicamente como una incapacidad para pasar meconio en lactantes o como estreñimiento a largo plazo en niños. La biopsia de succión rectal (RSB) para determinar la ausencia de células ganglio y la hipertrofia neuronal es la prueba más precisa para el diagnóstico de la EH en la actualidad. La tinción de hematoxilina-eosina tradicional carece de sensibilidad y especificidad. La tinción de la acetilcolinesterasa no puede ser ampliamente utilizada debido a su complejo proceso. Nuestro novedoso protocolo de inmunostón para calretinina, proteína S100 y producto genético 9,5 (PGP 9.5), que realizamos en RSBs, exhibe tasas de alta sensibilidad y especificidad de 96,49% (intervalo de confianza de 95%, 0,88-0,99) y 100% (95% de confianza intervalo, 0,97-1.00), respectivamente. Los segmentos afectados por la EH a menudo se presentan como la ausencia de la expresión de calretinina, proteína S100, y PGP 9.5, que son marcadores de hipertrofia neuronal en el tejido submucosa. Este protocolo describe el proceso operativo detallado de este nuevo método de diagnóstico.
Introduction
La enfermedad de Hirschsprung (EH) es un trastorno intestinal congénita común caracterizado por la falta de células ganglionada en diferentes segmentos del tracto intestinal distal1. El sistema nervioso entérico humano se forma cuando se completa la invasión de las células neuronales embrionarias. Si hay una perturbación del proceso y la invasión no se completa, el intestino distal del recién nacido se convierte en aganglionic2. Esta afección potencialmente mortal se denomina enfermedad de Hirschsprung. La proliferación, la motilidad y el crecimiento intestinal son los tres componentes principales de la colonización exitosa.
La tinción de hematoxilina y eosina tradicional (H & E) de una biopsia submucosa limitada no puede alcanzar un resultado tan satisfactorio como la tinción de H & E de un tejido de espesor completo Obtenido de la cirugía. Adicionalmente, la acetilcolinesterasa (AChE) la tinción del tejido de succión rectal es teóricamente desafiante debido a su sensibilidad inadecuada, que es 91%, y el procesamiento complejo de las secciones congeladas3,4. Varios otros marcadores inmunohistoquímicos de células ganglionadas y fibras nerviosas que se pueden teñir en muestras fijas de formol y de parafina se están convirtiendo gradualmente en el principal diagnóstico de la EH. La calretinina es una proteína de unión al calcio dependiente de la vitamina D que no se expresa en el plexo mientérico y submucosa de los segmentos afectados por la EH5. La proteína S100 se expresa en células derivadas de la cresta neural, como las fibras nerviosas y las células gliales, que a menudo presentan hipertrofia neuronal en el tejido submucosa de los segmentos afectados por la EH6. El producto genético de proteína 9,5 (PGP 9.5) Mancha de forma fiable las fibras nerviosas y las células ganglionadas; La tinción PGP 9.5 actúa como un suplemento a la tinción de calretinin, especialmente en casos de hipoganglionosis aislada. La tinción doble con S100 y PGP 9.5 puede disminuir la tasa de falsos negativos y aumentar la sensibilidad. Como requisito previo, el estudio actual tiene como objetivo garantizar la especificidad adecuada y la alta sensibilidad de este novedoso método de diagnóstico. Nuestro nuevo protocolo usó los tres marcadores para la discriminación del intestino agangliónico y las fibras nerviosas hipertróficas. Un estudio prospectivo de 318 niños fue realizado por nuestro laboratorio y publicado previamente sin un protocolo detallado7. El protocolo detallado y las precauciones se discuten en este artículo. Los neonatos que sufrieron un grave problema de defecación desde el nacimiento o los niños con estreñimiento crónico, excluyendo otras enfermedades comunes, son candidatos potenciales para la biopsia de succión rectal (RSB). Nuestro nuevo protocolo es adecuado para la tinción no sólo de RSBs, sino también de biopsias de espesor completo o especímenes quirúrgicos para hacer un diagnóstico final.
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Protocol
Este protocolo fue aprobado por la Junta de ética de la investigación del hospital de la Unión de la Universidad de ciencia y tecnología de Huazhong.
1. biopsia de succión rectal
- Realiza la biopsia de succión rectal por un cirujano pediátrico bien entrenado y un asistente usando un sistema de biopsia rectal de succión Rbi2 después de obtener el consentimiento informado del tutor.
- Realizar RSB en pacientes que tienen las siguientes indicaciones: incapacidad para pasar meconio en lactantes o hinchazón a largo plazo con o sin estreñimiento en niños; niños con estreñimiento a largo plazo que necesiten aceite de parafina para completar la defecación; obstrucción intestinal o perforación intestinal con razones desconocidas en niños sometidos a una enterostomía.
Nota: las contraindicaciones para la RSB son las siguientes: los niños que tienen síntomas severos, que están en mal estado físico, o que no pueden tolerarse la RSB; niños con enterocolitis en etapa aguda; niños sometidos a anastomosis intestinal sin curación completa.
- Realizar RSB en pacientes que tienen las siguientes indicaciones: incapacidad para pasar meconio en lactantes o hinchazón a largo plazo con o sin estreñimiento en niños; niños con estreñimiento a largo plazo que necesiten aceite de parafina para completar la defecación; obstrucción intestinal o perforación intestinal con razones desconocidas en niños sometidos a una enterostomía.
- Realizar un enema de retención salina normal como preparación intestinal 36 h antes del procedimiento para evitar heces sueltas y edema excesivo de la mucosa. Añadir solución de sulfato de magnesio si el niño tiene estreñimiento severo. Administrar vitamina K (1 mg/kg) a neonatos.
Nota: no realice análisis de sangre preoperatoria ni administre antibióticos, ya que no son necesarios. - Ponga paciente en la posición de la litotomía. Cubra la superficie del tubo con aceite de parafina. Inserte el tubo de punta Romo de 4-7 cm en el recto con el orificio lateral hacia las paredes posterior o lateral.
- Aplicar una presión suave sobre el tubo para facilitar la adherencia adecuada del orificio lateral a la pared rectal. Presione el gatillo y retire la herramienta inmediatamente.
- Utilice el instrumento de la biopsia para obtener 4 biopsias de succión con un diámetro de 2 mm a 3 cm y 6 cm por encima de la línea dental, anteriormente y posteriormente. Utilice una aguja para colocar la muestra en la gasa humedecida con solución salina.
- Observe al paciente hasta las 2 h después del procedimiento para descartar el sangrado rectal. Evite las manipulaciones rectales y anales en las primeras 24 h después de la RSB.
2. preparación de las secciones de la RSB
- Colocar las biopsias de succión rectal en un 4% de paraformaldehído durante 6 h para fijar el tejido. Utilice un volumen fijador 5 veces más que el volumen del tejido.
- Deshidratar el tejido con el deshidratador de tejido patológico durante 11 h. Todo el proceso programado consta de los siguientes 5 pasos:
- Colocar el tejido en formaldehído y fijarlo por 1 h.
- Colocar el tejido en etanol al 75% durante 4 h.
- Colocar el tejido en etanol absoluto (dos cambios, 1 h cada uno).
- Colocar el tejido en etanol absoluto (dos cambios, 30 min cada uno).
- Colocar el tejido en xileno (tres cambios, 1 h cada uno).
- Colocar el tejido en cera de parafina (58-60 ° c) (tres cambios, 1 h cada uno). Incrustar los tejidos de la RSB en bloques de parafina.
- Recorte los bloques de parafina utilizando un microtomo hasta que el tejido quede completamente expuesto con un plano de sección completo.
- Corte los bloques en secciones de 0,4 μm con un microtomo.
- Colocar las secciones en 45-50 ° c de agua durante unos segundos cada una para permitir que las secciones se esparcir en una placa plana.
- Transfiera las secciones de parafina a las diapositivas.
- Hornear las diapositivas en un horno de 60 ° c para 3-5 h. Evite hornear durante demasiado tiempo, lo que puede conducir a la pérdida de los antígenos.
- Coloque las diapositivas del deparaffinized en xileno (2 cambios, 15 min cada uno).
- Hidratar las diapositivas en etanol absoluto, 95%, 80% y etanol al 75% durante 5 min cada una. A continuación, enjuáguelos en osmosis inversa (RO)-agua purificada durante otros 5 min.
3. recuperación de antígeno
- Hacer diluciones de trabajo para la recuperación de calretinin mezclando 4 mL de tampón de recuperación de antígeno EDTA con 200 mL de agua purificada de RO. Hacer diluciones de trabajo para la recuperación de S100 y PGP 9.5 mezclando 1 mL de tampón de citrato sódico de ácido cítrico (100x) con 99 mL de agua purificada de RO.
Nota: el calretinin se puede recuperar preferentemente mediante la solución de recuperación EDTA. Sin embargo, el tampón de citrato de sodio ácido cítrico es más adecuado para la recuperación de S100 y PGP 9.5. - Coloque las diapositivas en un frasco de tinción de cubeta tipo Coplin. Llene el frasco con la solución de recuperación y colóquelo en un baño de agua hirviendo precalentado. Después de hervir durante 20 minutos, retire el frasco del baño de agua y deje enfriar a temperatura ambiente. El proceso de enfriamiento tarda aproximadamente 10 min. Retire las diapositivas y enjuáguelas suavemente una vez con suero salino (PBS) amortiguado con fosfato.
- Dibuje un círculo con un rotulador alrededor del tejido y prepare una caja húmeda para los siguientes procedimientos.
4. bloqueo
- Hacer diluciones de trabajo mezclando 3 mL de 30% H2O2 con 27 ml de agua purificada de ro.
- Añadir dos o tres gotas de 3% H2o2 solución gota a gota en el tejido para bloquear peroxidates. Agregue la solución H2O2 de inmediato para asegurarse de que la solución no se desbordará del círculo. Realizar el bloqueo de peroxidates en una incubadora de 37 ° c durante 20 min.
- Enjuague las diapositivas suavemente con PBS (tres lavados, 5 min cada uno).
- Bloquee las diapositivas durante 20 min a 37 ° c con un 5% de albúmina sérica bovina (BSA, preparada mezclando 1,5 g de polvo de BSA con 30 mL de agua purificada de RO).
Nota: el bloqueo con 3% H2O2 puede prevenir el 95% de manchas no específicas y el bloqueo con 5% de BSA puede prevenir el otro 5% de manchas no específicas. Combine los dos métodos para obtener un resultado fiable.
5. antígeno-reacción de anticuerpos
- Retire el 5% de BSA y agregue 50 μL de anticuerpo primario (calretinin, S100, o PGP 9.5) a la diapositiva. Incubar durante la noche a 4 ° c.
- Lave el portaobjetos con PBS (tres veces, 3 min cada uno).
- Añadir 50 μL de potenciador de polímero (reactivo a; ver tabla de materiales) a la sección e incubarlo durante 20 min en una incubadora de 37 ° c. A continuación, lave el portaobjetos con PBS (tres veces, 3 min cada uno).
- Añadir 50 μL de anticuerpo secundario B (anticuerpo secundario IgG de cabra anticonejo/ratón) a la sección e incubar durante 30 min en una incubadora de 37 ° c. Lavar la sección con PBS (tres veces, 5 min cada una).
6.3, 3-diaminobenzidina y tinción de hematoxilina
- Añadir 850 μL de agua purificada de RO a un tubo de 1,5 mL y añadir los reactivos de tinción (ver tabla de materiales) en la orden a, B y C. Añadir 50 μl de cada reactivo para obtener un total de 1 ml de solución de trabajo de 3, 3-diaminobenzidina (DAB). Si hay precipitados, utilice la solución después de la filtración.
- Agregue una gota de solución de trabajo DAB a la sección de tejido y mancha durante 3-10 min. Incubar las diapositivas en DAB a temperatura ambiente hasta que se detecte la coloración marrón. Monitoree cuidadosamente usando un microscopio de campo claro. Mantenga la solución de trabajo DAB alejada de la luz. A continuación, lave la corredera con PBS durante 5 min.
- Agregue una gota de hematoxilina para contrarrestar los núcleos durante aproximadamente 1 min. A continuación, sostenga el frasco de cubeta tipo Coplin y lávelo bajo un goteo de agua durante aproximadamente 30-40 s hasta que se elimine el exceso de tinte. Tenga cuidado de no dañar las secciones de tejido.
- Sumergir las diapositivas RSB en un frasco de cubeta tipo Coplin que contiene PBS para 25-30 s. A continuación, diferenciar en 1% ácido clorhídrico-etanol para 10 s. Lave los portaobjetos con PBS durante 1 min.
- Deshidratar las diapositivas en orden inverso de hidratación: 75%, 80%, 95%, y etanol absoluto (5 min cada uno).
- Exponga las diapositivas a xileno (2 cambios, 5 min cada uno).
- Monte el cobertramiento con un montaje Ultraclean. Deje secar las diapositivas antes de la visualización con un microscopio.
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Representative Results
En total, 318 pacientes fueron inscritos en nuestro estudio. Todos los pacientes fueron sometidos a RSB, y los tejidos fueron manchados para calretinin, S100, y PGP 9.5. El diagnóstico basado en nuestro nuevo protocolo fue HD en 97 casos, no HD en 213 casos, y sospecha de EH en 8 casos. Entre los 132 pacientes quirúrgicos, 99 pacientes fueron diagnosticados con EH por inmunostaining de especímenes de espesor completo después de la cirugía. Las manchas S100 y PGP 9.5 mostraron que el 92% y el 93% de los 99 pacientes, respectivamente, tenían troncos nerviosos hipertrofados. Los otros 83 de los 186 pacientes sufrieron biopsias de espesor completo y mostraron células ganglio. Un total de 103 pacientes fueron clínicamente curados por terapias conservadoras, y se excluyó la EH. De los 8 pacientes con sospecha de EH, 3 pacientes fueron categorizados como HD de segmento corto, y los otros 5 pacientes fueron categorizados como no-HD.
De acuerdo con nuestros resultados, 97 pacientes fueron diagnosticados inicialmente por RSB. La información detallada se muestra en la tabla 1. El protocolo de tinción inmunohistoquímica para calretinin, S100 y PGP 9.5, que realizamos en RSBs, tiene tasas de alta sensibilidad y especificidad de 96,49% (intervalo de confianza de 95% [CI], 0,88-0,99) y 100% (IC 95%, 0,97-1.00), respectivamente. El valor predictivo positivo es 94,3% (95% CI, 0.87-0.99), y el valor predictivo negativo es 99,1% (95% CI, 0.95-1.00).
Las figuras 1A y 1B representan resultados típicos después de la inmunostulación para la calretinin. Muchas células ganglio, que expresan la calretinin, se pueden encontrar en los tejidos normales. Sin embargo, no se detectaron células ganglio en ninguna zona del tejido del segmento de la EH. Como se muestra en la figura 1C-F, el inmunostamiento de S100 y PGP 9.5 muestra troncos nerviosos hipertrofados en la submucosa, mientras que sólo se observó una mancha granular de algunas ramas nerviosas pequeñas en el intestino inervado normalmente. En nuestro estudio, los troncos de los nervios hipertróficos son fibras nerviosas con un diámetro de ≥ 40 μm.
Figura 1: Inmunostaining de las biopsias de succión rectal para calretinin, PGP 9.5 y S100. Inmunostón para el calretinin en el tejido afectado por la EH (A) y en las células ganglióricas de plexos mientéricos en tejido normalmente inervado (B). No se detectaron manchas de calretinin en los plexos mientéricos del segmento afectado por la EH. La tinción de PGP 9.5 en el tejido afectado por la EH mostró fibras nerviosas hipertróficas densas en la submucosa (C) en contraste con las fibras nerviosas en los tejidos normales (D). (E) el inmunostesfuerzo denso y prominente de la S100 mostró troncos hipertróficos en la submucosa del tejido afectado por la EH. (F) fibras nerviosas normales en la submucosa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| marcadores proteicos | HD (99) | No HD (219) | ||
| células ganglio (+) | Troncos de nervio hipertrófico (+) | células ganglio (+) | Troncos de nervio hipertrófico (+) | |
| calretinin | 2 | — | 214 | — |
| S100 | — | 91 | — | 3 |
| PGP 9.5 | — | 92 | — | 4 |
Tabla 1: puntuaciones de tinción inmunohistoquímica para los tres marcadores proteicos en las biopsias de succión rectal.
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Discussion
Aquí describimos un procedimiento que utiliza tres anticuerpos inmunohistoquímicos diferentes para teñir secciones de RBS para el diagnóstico de la EH. La sensibilidad de nuestro protocolo de diagnóstico fue del 96,49% (95% CI, 0,88-0.99), y la especificidad fue de 100% (95% IC, 0,97-1.00).
Los pasos más críticos del protocolo son la RSB y la reacción antígeno-anticuerpo. El tamaño de la biopsia determina la precisión de la coloración. Una pequeña biopsia no proporcionará suficiente tejido para hacer un diagnóstico preciso, mientras que una biopsia grande conduce a un mayor riesgo de sangrado. Como cuestión de experiencia, las biopsias con un diámetro de 2 mm son del tamaño óptimo. Para la reacción antígeno-anticuerpo, no se puede ignorar la preservación adecuada del anticuerpo. Siguiendo el protocolo paso a paso y trabajando suavemente son necesarios. La osmosis inversa-agua purificada se recomienda en todos los pasos, dando un campo más claro para la observación y haciendo más fácil para los patólogos para hacer un diagnóstico preciso.
El enema en contraste, la manometría anorrectal y la biopsia con histología son tres métodos diagnósticos preoperatorios que se han utilizado en los últimos años. Según Takawira et al.' investigación, la biopsia con histología tiene la mayor sensibilidad y especificidad8. Meier-ruge et al. primero informaron el uso de la acetilcolinesterasa (AChE) tinción en el tejido de succión rectal congelada para ayudar a diagnosticar la eh en 19729. Este método de tinción detecta troncos nerviosos hipertróficos en la submucosa. Después de ese informe, muchas instituciones de todo el mundo empezaron a utilizar este método como complemento para el diagnóstico de la EH. debido a sus limitaciones diagnósticas, los investigadores empezaron a concentrarse en otros marcadores que también pueden manchar las células ganglio y las fibras nerviosas en especímenes fijos de formalina y de parafina. En 2004, Barshack et al. descubrió que la pérdida de la expresión de calretinina puede ayudar a diagnosticar los segmentos agangliónicos en la EH10. Kapur et al. y Guinard-Samuel et al. repitieron el protocolo en 2009 y concluyeron que la tinción inmunohistoquímica para la calretinina era superior a la tinción para la acetilcolinesterasa11,12. En 1988, la inmunoostulación de S100 para el diagnóstico de la EH fue introducida por primera vez por robey et al. 13. Monforte-Muñoz et al. repitió el método en 1998 y descubrió que el 90% de sus 20 casos de Hirschsprung tenían fibras nerviosas más anchas que 40 μm14. Por lo tanto, el inmunostamiento de S100 puede servir como un método de diagnóstico auxiliar en casos sin células gangliólas. Además, Bachmann et al. notó que la tinción inmunohistoquímica para MAP2, calretinin, GLUT1 y S100 podría obtener un resultado fiable tan preciso como las técnicas de sección congelada15. Sin embargo, en 1992, Sams et al. evaluó el valor de PGP 9.5 en el diagnóstico de HD16. Aunque S100 puede detectar más fibras nerviosas de la lámina propia, tiene una mayor tasa de falsos negativos. Por lo tanto, elegimos usar PGP 9.5 y S100 juntos para el diagnóstico inmunohistoquímico de la EH, como se recomendó en estudios previos. Muchos casos de tinción para la Enolasa específica de la neurona en zonas transicionales también mostraron células ganglionas positivas en el plexo mientérico y submucosa, pero estas células eran escasas y pequeñas12. Del mismo modo, las células ganglión positivas de calretinin son pequeñas y tienen una formación agrupada. Un estudio anterior indicó que algunos troncos nerviosos ligeramente engrosados también podrían detectarse en los segmentos transitorios de la EH, pero con aganglionosis colónica total, los troncos nerviosos pueden estar dentro de los límites normales (< 40 μm)17. Debemos analizar los resultados caso por caso y combinar estos resultados con las manifestaciones clínicas para evitar el diagnóstico erróneo.
Este protocolo no podría representar el diagnóstico patológico final, por lo que llevamos a cabo un mínimo de un año de seguimiento clínico exhaustivo para cada niño. Además, este protocolo requiere más muestras para demostrar su fiabilidad.
En conclusión, el diagnóstico de la EH por la RSB es un método conveniente que proporciona un diagnóstico histológico ideal con una lesión mínima aceptable. La sensibilidad está estrechamente relacionada con si el sitio de muestreo es correcto. La tinción inmunohistoquímica de la RSB para calretinin, S100 y PGP 9.5 es sensible y específica en la detección de células ganglio y troncos hipertróficos del nervio. La combinación de estos tres marcadores ofrece un método de diagnóstico más fiable para la EH.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Weibing Tang por su gran ayuda en el suministro del laboratorio de filmación. Este artículo es apoyado por la investigación de bienestar público, y los fondos especiales fueron recibidos de la salud nacional y planificación familiar de China (Grant no. 201402007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
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