Aislamiento, purificación y diferenciación de los precursores de osteoclastos de la médula ósea de rata
Summary
Los osteoclastos son policaryones de macrófagos específicos de los tejidos derivados del linaje de monocitos y macrófagos de las células madre hematopoyéticas. Este protocolo describe cómo aislar las células de la médula ósea de manera que se obtengan grandes cantidades de osteoclastos reduciendo el riesgo de accidentes encontrados en los métodos tradicionales.
Abstract
Los osteoclastos son células grandes, multinucleadas y que recurren al hueso del linaje de monocitos y macrófagos que se forman mediante la fusión de monocitos o precursores de macrófagos. La resorción ósea excesiva es uno de los mecanismos celulares más significativos que conducen a enfermedades osteolíticas, incluyendo osteoporosis, periodontitis, y osteólisis periprotésica. La principal función fisiológica de los osteoclastos es absorber tanto el componente mineral de hidroxiapatita como la matriz orgánica de hueso, generando la apariencia de resorción característica en la superficie de los huesos. Hay relativamente pocos osteoclastos en comparación con otras células en el cuerpo, especialmente en los huesos adultos. Estudios recientes se han centrado en cómo obtener osteoclastos más maduros en menos tiempo, lo que siempre ha sido un problema. En los laboratorios se han desarrollado varias mejoras en las técnicas de aislamiento y cultivo para obtener osteoclastos más maduros. Aquí, introducimos un método que aísla la médula ósea en menos tiempo y con menos esfuerzo en comparación con el procedimiento tradicional, utilizando un dispositivo especial y simple. Con el uso de centrifugación de gradiente de densidad, obtenemos grandes cantidades de osteoclastos completamente diferenciados de la médula ósea de rata, que se identifican mediante métodos clásicos.
Introduction
La la homeostasis ósea es un proceso fisiológico complejo que está regulado por osteoclastos de resorto óseo y osteoblastos de formación ósea1. Un equilibrio entre la actividad osteoblástica y osteoclástica mediada a través de osteoblastos y osteoclastos, respectivamente, es muy esencial para mantener la salud ósea y la la homeostasis, porque las perturbaciones en la la homeostasis ósea pueden conducir a enfermedades óseas, tales como crecimiento óseo anormal o pérdida de densidad ósea. Como células únicas de resorción ósea, los osteoclastos son importantes en enfermedades relacionadas con la destrucción ósea anormal, incluyendo osteoporosis, periodontitis, y osteólisis periprotésica2,3.
El desarrollo de un cultivo de los osteoclastos se divide principalmente en dos etapas. Los métodos establecidos por Boyde et al.4 y Chambers et al.5 componían la primera etapa de la década de 1980. Obtuvieron osteoclastos relativamente abundantes de los huesos de los animales recién nacidos, que es el período de remodelación rápida. Los osteoclastos se liberan al fragmentar y agitar los huesos en un medio especial. Sin embargo, las células obtenidas por este método son bajas en cantidad y pureza. La segunda etapa fue el desarrollo de cultivos de largo alcance de formación de osteoclastos, utilizando células de linaje hematopoyético derivadas de la médula ósea6. Citoquinas, tales como 1 α, 25-dihidroxivitamina D3, prostaglandina E2 (PGE-2), y la hormona paratiroidea (PTH), que se añaden en el medio de cultivo, actúan a través del sistema de osteoblastos/células del stromal para estimular la formación de los osteoclastos7,8 . Sin embargo, la pureza y la cantidad de osteoclastos obtenidos por este método no pueden satisfacer las necesidades de la investigación moderna de biología molecular. Luego, el descubrimiento del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el activador de receptores para el ligando de factor nuclear-κB (RANKL) hacen que la osteoclastogénesis sea más fácil9,10,11, y el método de uso de M-CSF y RANKL para estimular directamente la formación de los osteoclastos es ampliamente utilizado en todo el mundo. Sin embargo, todavía hay algunos detalles en la metodología que deben mejorarse.
En la actualidad, el método de cultivo de los osteoclastos más utilizado, según lo descrito por marino et al.12 y PEI et al.13, a menudo requiere la extirpación del tejido circundante alrededor del hueso y utiliza una aguja esterilizada para vaciar la cavidad de la médula con medios completados. Hay algunos inconvenientes en este proceso, incluyendo el hecho de que (1) la eliminación del tejido circundante alrededor del hueso requiere mucho tiempo y gran técnica quirúrgica, (2) los huesos son frágiles y pueden conducir a la salida de la médula ósea, (3) la cavidad de la médula ósea podría ser demasiado pequeño para vaciar, y (4) hay un riesgo de lesión de pinchazo de aguja. Para evitar estos problemas, centrifugamos los tubos que contienen los huesos para la médula ósea en lugar de lavar la médula ósea con la aguja. Aquí, introducimos un método estable y seguro que aísla la médula ósea en menos tiempo y con menos esfuerzo en comparación con el procedimiento tradicional. Junto con el uso de centrifugación de gradiente de densidad, obtenemos grandes cantidades de osteoclastos completamente diferenciados in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de obtener y estudiar osteoclastos in vitro es una habilidad crítica y fundamental para cualquier investigador que desee estudiar el metabolismo óseo, lo que puede ayudar a comprender los mecanismos de las enfermedades que absorben los huesos y desarrollar nuevos agentes terapéuticos. El presente estudio describió un protocolo con algunas modificaciones basadas en métodos anteriores.
Mediante el uso de puntas de pipetas y tubos de microcentrífuga para obtener médula ósea, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta obra fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81473692) a Yong MA. Los autores agradecen a todo el personal del centro de investigación médica del primer Colegio de medicina clínica de la Universidad de Medicina China de Nanjing.
Materials
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Automatic Hard Tissue Slicer | Lecia | RM2265 | |
| Bovine femoral bone | Purchased by ourselves | ||
| Cell Incubator | Heraus | BB16/BB5060 | |
| Fetal Bovine Serum | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| Hard Tissue Grinders | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque Kit | TianJing Haoyang | TBD2013DR | Silicified centrifugal tube amd cell separation solution |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Inverted Phase Contrast Microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Lecia | DMI-3000 | |
| MEM, no Glutamine | Gibco | 11090-081 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| Rabbit Anti-Calcitonin receptor | Bioss | bs-0124R | |
| Recombinant Rat M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| Recombinant Rat sRANK Ligand | PeproTech | 400-30 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Absin | abs47014932 | |
| Scanning Electron Microscopy | FEI | Quanta 200 | |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89649 |
References
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